微管穩(wěn)定性異常與帕金森病

楊 璇 陳 崢 賈炳泉 吳春艷 王 佳 宋彬彬 陳艷清 于 佳

一、神經(jīng)元中的微管

神經(jīng)元的微管結構亞單位與其他類型細胞微管結構亞單位的組分基本相同，原纖維以α-微管蛋白(tubulin)和β-tubulin相互交替形式進行裝配，形成了α-tubulin暴露在微管的一頭，而β-tubulin在另一頭的極化結構。微管的聚合由特異的核心形成位點起始，主要是中心體，被稱為微管微管組織中心。在中心體內(nèi)，γ-tubulin可形成一個環(huán)形結構，被稱為γ-tubulin環(huán)形復合體。α-tubulin和β-tubulin二聚體結合到γ-tubulin環(huán)形復合體, 通過與γ-tubulin相互作用形成短的微管, γ-tubulin環(huán)形復合體促使微管的負端穩(wěn)定，微管的正端從此生長、延伸。微管一直處于動態(tài)的解聚和組裝過程中，在微管正端速率較大，在負端速率較小。近年來研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)元中微管的組裝可能并不依賴于中心體。Stiess等[1]發(fā)現(xiàn)在微管解聚藥物諾考達唑處理后，成熟的海馬神經(jīng)元內(nèi)微管組裝并以中心體為核，而是在整個細胞中隨機成核組裝。進一步研究發(fā)現(xiàn)，隨著神經(jīng)元的發(fā)育γ-tubulin的定位發(fā)生了改變，在未成熟神經(jīng)元中γ-tubulin都分布在中心體，而在成熟神經(jīng)元大量γ-tubulin存在于軸突中，提示成熟的神經(jīng)元軸突中微管可直接發(fā)生組裝，而不必由中心體起始。樹突與軸突的微管排列也不一致：在軸突微管排列成方向一致的微管束，只以其正端朝向軸突末端；在樹突則不僅有正端向樹突末端的微管束，也存在負端向樹突末端的微管束，在樹突近胞體端，負端向樹突末端的微管束約占80%，而在遠端約占20%。

二、神經(jīng)元中微管的功能

1.維持神經(jīng)元極性：微管對于神經(jīng)元極性的形成至關重要。在神經(jīng)元極化的過程中，其中一個神經(jīng)突起內(nèi)的微管發(fā)生了重組，排列由原先的雙向變?yōu)榱苏顺蛲黄鹉┒说膯我环较?，而其他突起中的微管排列方向不發(fā)生改變，從而使得神經(jīng)元出現(xiàn)軸突和樹突，神經(jīng)元發(fā)生極化。改變微管的穩(wěn)定性會影響神經(jīng)元極性。利用紫杉醇增加微管的穩(wěn)定性會導致神經(jīng)元產(chǎn)生多個軸突樣結構；而諾考達唑處理的神經(jīng)元軸突生長受到抑制，軸突分支明顯減少[2]。

2.作為軸突運輸?shù)能壍溃涸谳S突內(nèi)無內(nèi)質網(wǎng)及溶酶體等細胞器存在，軸漿和軸突膜中的蛋白需要在胞體中合成后運送，而軸突內(nèi)的代謝產(chǎn)物也需要轉運至胞體進行降解，因此軸突運輸對于神經(jīng)元功能的維持十分重要。軸突運輸主要是通過驅動蛋白(kinesin)家族和動力蛋白(dynein)家族蛋白與微管結合，以微管作為軌道進行運輸。kinesin家族蛋白向微管正端移動，介導了順向軸突運輸；而dynein家族蛋白則向微管負端移動，介導了逆向軸突運輸。軸突運輸可分為快速軸突運輸和慢速軸突運輸，快速軸突運輸通常轉運突觸囊泡以及囊泡相關蛋白，速度約為每天50～400mm；慢速軸突運輸主要轉運絲狀骨架蛋白、神經(jīng)絲、微管蛋白以及可溶性的蛋白，速度約為每天0.2～10.0mm[2]。

三、PD中微管穩(wěn)定性的異常

1.PD患者細胞中微管穩(wěn)定性的異常：微管蛋白的翻譯后修飾種類繁多，其中研究最廣泛的是乙酰化、酪氨酸化/去酪氨酸化。微管蛋白的乙?；揎椫饕l(fā)生在α-tubulin的第40 位賴氨酸殘基。一般認為α-tubulin 乙?；龠M了微管的穩(wěn)定性。此外，將α-tubulin的乙?；稽cK40突變?yōu)镽使其失活導致kinesin與α-tubulin的結合作用顯著降低，同時軸絲運動速度降低，提示α-tubulin 的乙?；纱龠MKinesin介導的軸突運輸功能[3]。微管蛋白的去酪氨酸/酪氨酸化是迄今研究最多的微管蛋白翻譯后修飾形式。α-tubulin 的羧基端最后一個氨基酸是酪氨酸，可在酶的催化作用下進行“去酪氨酸化/酪氨酸化”循環(huán)。tubulin去酪氨酸化可降低微管與有微管解聚作用的kinesin-13 家族蛋白的相互作用，抑制微管的解聚，提高微管的穩(wěn)定性[4]。在神經(jīng)元中，去酪氨酸化的tubulin在軸突中富集，而生長錐中則含有大量酪氨酸化的tubulin，提示軸突中的微管可能較穩(wěn)定，而生長錐中微管相對不穩(wěn)定，會更利于其在引導信號誘導下進行生長[3]。

多項證據(jù)表明在PD患者細胞內(nèi)的微管的穩(wěn)定性發(fā)生改變。Salama等[5]利用酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測了26個PD患者血漿中的tubulin含量，結果發(fā)現(xiàn)PD患者血漿中的tubulin水平顯著增高。Esteves等[6]將散發(fā)性PD患者血小板中的線粒體轉入NT2細胞成為PD胞質雜合細胞，結果發(fā)現(xiàn)與健康對照組比較，PD患者胞質雜合細胞中游離tubulin的比例明顯升高。Cartelli等[7]分離并培養(yǎng)了散發(fā)性PD患者以及富含亮氨酸重復序列激酶2(leucine-rich repeat kinase 2，LRRK2)、Parkin突變的家族性PD患者的成纖維細胞，經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)散發(fā)性PD和家族性PD患者成纖維細胞中游離tubulin明顯升高，同時Parkin突變PD患者成纖維細胞中酪氨酸化的α-tubulin水平明顯升高，而散發(fā)性PD患者成纖維細胞中去酪氨酸化的α-tubulin水平明顯升高，LRRK2突變PD患者成纖維細胞中乙?；摩?tubulin水平明顯升高。上述結果均提示在PD患者細胞內(nèi)微管穩(wěn)定性發(fā)生了異常。

2.PD相關蛋白對微管穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)

(1)α-synuclein對微管穩(wěn)定性的調(diào)節(jié):研究發(fā)現(xiàn)α-突觸核蛋白(α-synuclein)通過其羧基端與tubulin直接作用，且α-synuclein可能只特異性的與tubulin異源二聚體結合，而與已組裝的微管并無結合。在體外實驗中，生理濃度的α-synucleinn能夠促進tubulin聚合，而α-synucleinn突變體A53T和A30P只能使tubulin形成無固定形態(tài)的聚集物[8]。Prots等[9]證實α-synucleinn的寡聚物有效抑制了微管的組裝。據(jù)此推測，在生理條件下，α-synucleinn能夠促進微管的組裝；而在病理條件下，α-synucleinn的過度表達或突變使得α-synucleinn的蛋白構象或者功能改變，對微管的形成起到抑制作用，但其中的具體機制仍不清楚。Cartelli等[10]發(fā)現(xiàn)當α-synucleinn單體與tubulin作用時，α-synucleinn的構象發(fā)生改變形成了α螺旋，誘導產(chǎn)生了數(shù)目更多但較短的微管，表明α-synucleinn促進了微管的核化過程，從而促進接下來的微管組裝；而α-synucleinn的突變體則只能引起tubulin形成聚集，影響了正常的微管組裝。

α-synucleinn還可通過作用于Tau以調(diào)節(jié)微管穩(wěn)定性。Tau蛋白是一個重要微管組裝調(diào)節(jié)因子。在非磷酸化狀態(tài)下，Tau可以促進微管的組裝，但是當處于磷酸化狀態(tài)時，Tau與tubulin的結合能力減弱，反而會抑制微管的組裝。研究者在α-synucleinn轉基因小鼠腦內(nèi)LB中觀察到α-synucleinn和磷酸化狀態(tài)的Tau共定位，表明兩者可能在PD發(fā)病中存在一定的聯(lián)系，且大量證據(jù)表明α-synucleinn和Tau之間存在直接相互作用[11]。Oikawa等[12]發(fā)現(xiàn)α-synucleinn原纖維能夠競爭性的與Tau結合，致使與微管結合的Tau減少，降低微管的穩(wěn)定性。α-synucleinn的異常表達會誘使細胞內(nèi)Tau多個位點磷酸化水平升高。1-甲基-4-苯基-吡啶離子(1-Methyl-4-phenylpyridine，MPP+)處理的原代中腦神經(jīng)元Tau S396/404磷酸化水平升高，而在α-synucleinn基因敲除的神經(jīng)元中則無法觀察到這一現(xiàn)象，提示Tau磷酸化水平升高由α-synucleinn介導[13]。在α-synucleinn轉基因小鼠紋狀體內(nèi)，Tau的多個位點包括S202、S262和S396/404磷酸化水平大幅度升高，同時糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase，GSK3β)磷酸化水平明顯升高，提示α-synucleinn誘導的Tau磷酸化與GSK-3β的激活相關[11]。Kawakami等[14]則發(fā)現(xiàn)α-synucleinn可以和GSK-3β、Tau形成異源三聚體復合物，α-synucleinn對GSK-3β和Tau起到連接作用，促進GSK-3β對Tau的磷酸化。α-synucleinn誘導的Tau高度磷酸化抑制微管的組裝，導致細胞內(nèi)游離形式的tubulin明顯增加，細胞骨架的穩(wěn)定性下降[11]。

(2)LRRK2對微管穩(wěn)定性的調(diào)節(jié):Gandhi等[15]利用Pull-down和質譜實驗證實LRRK2和α/β-tubulin二聚體之間有相互作用。LRRK2可以磷酸化β-tubulin，體外微管聚合實驗顯示LRRK2介導的β-tubulin磷酸化促進了微管聚合[16]。微管穩(wěn)定對于細胞正常功能起到至關重要的作用，但是微管的過度穩(wěn)定也會損害細胞功能。研究者在野生型、PD相關的LRRK2突變G2019S和I2020T轉基因小鼠內(nèi)均觀察到了微管穩(wěn)定性增加，但這影響了正常微管網(wǎng)絡的形成，導致高爾基體發(fā)生片段化。Esteves等[17]給予NT2細胞LRRK2激酶活性抑制劑IN-1處理，結果發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)游離的tubulin水平升高。除了對tubulin的磷酸化修飾，Law等[18]還發(fā)現(xiàn)LRRK2對tubulin乙?；接姓{(diào)節(jié)作用。他們發(fā)現(xiàn)LRRK2基因敲除小鼠胚胎成纖維細胞內(nèi)α-tubulin乙?；矫黠@高于野生型小鼠。但是，Esteves等[17]則觀察到IN-1處理的NT2細胞內(nèi)α-tubulin乙酰化水平顯著降低，因此推測LRRK2對α-tubulin乙?；降恼{(diào)節(jié)可能并不是由于其激酶活性。

LRRK2還可能通過作用于微管相關蛋白Tau調(diào)節(jié)微管穩(wěn)定性。Kawakami等[19]利用體外實驗證實了LRRK2和Tau在tubulin存在的情況下發(fā)生相互作用，且LRRK2可直接磷酸化與tubulin結合的Tau，而非游離的Tau，提示LRRK2可能并不直接與Tau發(fā)生相互作用，而是需要tubulin作為支架。他們還發(fā)現(xiàn)與野生型LRRK2比較，G2019S、I2020T突變均可顯著增加Tau的磷酸化水平，降低Tau和微管的結合能力。Bailey等[20]通過進一步研究發(fā)現(xiàn)Tau T149、T153、T205、S199/S202/T205殘基均可被LRRK2磷酸化。但也有研究對LRRK2對Tau的磷酸化作用有不同觀點。Shanley等[21]利用免疫共沉淀實驗發(fā)現(xiàn)在SH-SY5Y細胞以及小鼠腦內(nèi)，LRRK2、Tau和細胞周期素依賴蛋白激酶5(cyclin-dependent kinase 5，CDK5)存在相互作用，而利用siRNA干擾細胞內(nèi)LRRK2的表達導致Tau磷酸化水平明顯下降，但是LRRK2激酶活性抑制劑卻對并未影響Tau磷酸化水平。體外實驗顯示LRRK2對Tau的磷酸化作用遠遠低于CDK5，但是Tau與LRRK2的結合能力約為與CDK5的200倍，因而推測LRRK2可能作為中間支架蛋白促進CDK5對Tau的磷酸化，而非主要的磷酸化Tau的激酶。

(3)Parkin對微管穩(wěn)定性的調(diào)節(jié):Parkin是一種在腦內(nèi)廣泛表達的泛素E3連接酶，介導受損蛋白的泛素化，促使其發(fā)生降解，維持蛋白質穩(wěn)態(tài)。Parkin突變失活可導致多巴胺能神經(jīng)元變性，參與PD的發(fā)病過程。有研究發(fā)現(xiàn)Parkin和α、β-tubulin均存在強烈的相互作用，在HEK293細胞中過表達Parkin導致α、β-tubulin的泛素化水平明顯升高，降解速度增加，提示Parkin可以對α、β-tubulin進行泛素化修飾促進其降解。細胞內(nèi)大量錯誤折疊的tubulin單體可導致細胞發(fā)生死亡，因而Parkin介導的tubulin的降解對于細胞的存活有重要的生理意義。此外，Parkin還可影響微管的穩(wěn)定性。Yang等[22]發(fā)現(xiàn)Parkin通過linker、RING1和RING2 3個結構域與α/β-tubulin二聚體結合，在COS-7細胞中過表達全長的Parkin或linker、RING1和RING2結構域序列能夠明顯降低秋水仙堿所誘導的微管解聚，而泛素E3連接酶失活的Parkin突變則對微管穩(wěn)定性無明顯影響，表明Parkin促進微管穩(wěn)定，但是這一效應并不依賴其泛素E3連接酶活性。

3.誘發(fā)PD的毒性物質導致微管穩(wěn)定性異常:研究發(fā)現(xiàn)多種誘發(fā)PD的毒性物質均可導致細胞微管穩(wěn)定性下降。Cartelli等[23]檢測發(fā)現(xiàn)在MPP+處理的PC12細胞中酪氨酸化的tubulin水平明顯降低，且組裝進入微管的酪氨酸化的tubulin與游離的酪氨酸化的tubulin的比率明顯降低，表明MPP+導致微管穩(wěn)定性降低。魚藤酮可以直接與tubulin結合，導致tubulin的解聚，Hongo等[24]發(fā)現(xiàn)在魚藤酮損傷的SH-SY5Y細胞中的游離的tubulin大量增加，而聚合狀態(tài)的tubulin明顯減少。

四、微管穩(wěn)定性異常參與PD發(fā)病

1.微管解聚更易導致多巴胺能神經(jīng)元受損:黑質多巴胺能神經(jīng)元擁有更多的軸突分支。在大鼠黑質致密部中約有12000個多巴胺能神經(jīng)元，平均每個神經(jīng)元支配102165～245103個突觸，據(jù)此計算每個黑質多巴胺能神經(jīng)元軸突總長度約為46.7cm。而其他種類的神經(jīng)元的神經(jīng)支配數(shù)目遠遠低于多巴胺能神經(jīng)元，大鼠GABA能神經(jīng)元約有5000個突觸，而蒼白球內(nèi)的神經(jīng)元僅有約2000個突觸。因此，黑質多巴胺能神經(jīng)元可能對于微管的損傷更加敏感。Ren等[25]發(fā)現(xiàn)利用魚藤酮或秋水仙堿促使黑質神經(jīng)元中微管發(fā)生解聚，大鼠黑質中TH陽性神經(jīng)元與TH陰性神經(jīng)元比較更易發(fā)生死亡，利用紫杉醇抑制微管解聚可減輕魚藤酮對TH陽性神經(jīng)元的損傷，但對TH陰性神經(jīng)元的存活影響較小。Cartelli等[26]也發(fā)現(xiàn)微管穩(wěn)定劑埃博霉素D能夠有效抑制MPTP誘導的黑質多巴胺能神經(jīng)元變性死亡。

2.微管穩(wěn)定性降低促進α-synucleinn聚集:神經(jīng)元胞質內(nèi)出現(xiàn)路易小體是PD最重要病理特征之一，路易小體主要是由α-synucleinn大量聚集沉積形成。研究者利用免疫熒光染色檢測發(fā)現(xiàn)在PD患者迷走神經(jīng)背側運動核中tubulin與α-synucleinn同時存在于路易小體中。Kim等[27]在體外實驗中發(fā)現(xiàn)將α、β-tubulin和α-synucleinn共同孵育，α-synucleinn發(fā)生聚集形成不規(guī)則的纖維樣物質；而微管的組裝抑制劑苯菌靈進一步加速了α-synucleinn聚集。Esteves等[6]發(fā)現(xiàn)紫杉醇能夠有效抑制PD胞質雜合體細胞中α-synucleinn的聚集。上述結果提示，微管的穩(wěn)定性下降能夠促進α-synucleinn的聚集，游離狀態(tài)的tubulin可能通過和α-synucleinn相互作用改變α-synucleinn的構象從而促使α-synucleinn發(fā)生聚集。

3.微管穩(wěn)定性降低導致線粒體功能受損:Cartelli等[25]觀察發(fā)現(xiàn)在MPP+損傷的細胞內(nèi)，微管解聚過程要先于線粒體功能障礙發(fā)生，因此推測微管解聚會破環(huán)軸突運輸過程，使得線粒體在軸突內(nèi)無法正常運輸，從而損傷線粒體功能。Godena等[28]觀察到過表達乙酰基轉移酶微管蛋白乙酰轉移酶(α-tubulin acetyltransferase，αTAT1)以增加tubulin乙?；矫黠@改善了LRRK2突變導致的線粒體運動功能障礙。Esteves等[29]利用davunetide促進微管組裝，結果發(fā)現(xiàn)davunetide能夠明顯提高PD胞質雜合體細胞中線粒體運動功能，增加線粒體膜電位。上述結果表明提高微管穩(wěn)定性可以改善線粒體功能，提示在PD發(fā)病過程中微管穩(wěn)定性下降可能是線粒體功能損傷的重要原因。

五、展 望

綜上所述，微管介導神經(jīng)元極性形成以及軸突運輸?shù)壬窠?jīng)元功能，而微管穩(wěn)定性異?？蓪е律窠?jīng)元功能障礙，從而發(fā)生變性。研究結果顯示在PD患者細胞內(nèi)微管穩(wěn)定性異常，在細胞和動物模型中PD相關蛋白的異常表達以及誘發(fā)PD的毒性物質也會導致微管穩(wěn)定性異常。微管穩(wěn)定性的異常參與了PD的發(fā)病過程，微管穩(wěn)定性下降會促進細胞內(nèi)α-synucleinn聚集、線粒體功能受損，而多巴胺能神經(jīng)元擁有更多的軸突分支這一特殊形態(tài)導致其更易因微管穩(wěn)定性下降受損。因此，以微管的穩(wěn)定性作為要為藥物靶點對于PD的治療有著重要意義。事實上已經(jīng)在多種實驗模型中證實微管穩(wěn)定劑如紫杉醇、埃博霉素D等對于多巴胺能神經(jīng)元的保護作用。但是，紫杉醇無法穿過血-腦脊液屏障進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，因而無法用于治療PD，目前多個研究正致力于對紫杉醇進行修飾以使其能夠進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)。埃博霉素D能夠穿過血-腦脊液屏障，但用于早期阿爾茨海默病患者治療的臨床實驗時，埃博霉素D引起了強烈的不良反應。近年來人們設計了一種新型的微管穩(wěn)定劑NAP，NAP是一段與微管作用的肽段，可改善過表達α-synucleinn的小鼠的運動功能障礙，但NAP仍未能應用于臨床。因此，在未來進一步闡釋微管參與PD的發(fā)病機制，并且以微管為靶點開發(fā)新藥物將會是一個重要的研究方向，對于PD的治療具有指導意義。