HPLC測(cè)定史國(guó)公藥酒中升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷

羅漢宇，羅瀅娟**

（1. 吉安市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，江西 吉安 343000；2. 吉安市疾病預(yù)防控制中心，江西 吉安 343000）

史國(guó)公藥酒是歷史悠久且目前仍廣泛使用的著名酒劑成藥[1-2]，收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》中藥成方制劑第九冊(cè)，由玉竹、鱉甲、牛膝、桑寄生、防風(fēng)、川芎等17味中藥組成[3]，具有祛風(fēng)除濕、活血通絡(luò)的功效，主要用于風(fēng)寒濕痹、骨節(jié)疼痛、四肢麻木。該制劑處方藥味多，現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)采用理化鑒別，難以控制產(chǎn)品質(zhì)量，目前文獻(xiàn)雖有對(duì)處方中羌活和紅曲化學(xué)成分的研究[4]，但未見(jiàn)對(duì)處方中防風(fēng)化學(xué)成分研究的報(bào)道。本文采用高效液相色譜法（HPLC）同時(shí)測(cè)定升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷以檢測(cè)防風(fēng)的含量，該方法操作簡(jiǎn)便，分離度好，為該品種質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高提供參考。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

Agilent1260 型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司）；Bp211D十萬(wàn)分之一電子天平（德國(guó)Sartorias公司）；密里博DQ5超純水制水機(jī)（Merck Millipore公司）。

1.2 試劑

正丁醇（分析純，國(guó)藥集團(tuán)）；甲醇（色譜純，默克公司）；超純水（自制）；升麻素苷對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)111522-201712，含量96.2 %）；5-O-甲基維斯阿米醇苷對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)111523-201610，含量96.1 %）；史國(guó)公藥酒（江西藥都樟樹(shù)制藥，批號(hào)160701，161101，170301）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-2 % 冰醋酸（40:60）；流速：1.0 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 μl。理論塔板數(shù)按升麻素苷計(jì)算，不低于6000。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷對(duì)照品適量，加甲醇溶解并定量稀釋制成每1 ml中各含60 μg的混合溶液，搖勻。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密量取本品25 ml，水浴蒸至約10 ml，移至分液漏斗中，加水飽和正丁醇提取5次（20，20，10，10，10 ml），合并正丁醇液，加氨試液洗滌5次（20，20，10，10，10 ml），棄去洗液，正丁醇液置水浴蒸干，加甲醇適量溶解并稀釋至5 ml，搖勻，濾過(guò)。

圖1 專屬性試驗(yàn)HPLC色譜圖

2.2.3 陰性對(duì)照溶液的制備 取除防風(fēng)藥材的其他藥材按處方比例，照生產(chǎn)工藝制備空白樣品，按2.2.2項(xiàng)下方法制成陰性對(duì)照溶液。

2.3 專屬性試驗(yàn)

分別取對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液，按2.1項(xiàng)色譜條件測(cè)定。結(jié)果顯示，升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷峰分離良好，陰性對(duì)照溶液在升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷處無(wú)干擾峰，見(jiàn)圖1。

2.4 線性關(guān)系考察

精密量取升麻素苷（609.2 μg/ml）5-O-甲基維斯阿米醇苷（613.6 μg/ml）混合對(duì)照品溶液1，1，2，1，2，3 ml，分別置50，25，25，10，10，10 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別精密量取10 μl注入液相色譜儀，按2.1項(xiàng)色譜條件測(cè)定。以峰面積為縱坐標(biāo)、進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，計(jì)算回歸方程。升麻素苷回歸方程為Y=59.841X-54.543，r=0.9989；5-O-甲基維斯阿米醇苷回歸方程為Y=30.21X-48.742，r=0.9983，表明升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷分別在121.84～1827.60 ng、122.72～1840.80 ng范圍內(nèi)，進(jìn)樣量與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn)

取混合對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，按2.1項(xiàng)色譜條件測(cè)定，計(jì)算峰面積的RSD，結(jié)果升麻素苷峰面積RSD為0.63 %，5-O-甲基維斯阿米醇苷峰面積RSD為0.52 %，表明精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取樣品（批號(hào)160701），按2.2.2項(xiàng)下方法制備，室溫下放置，分別在0，2，4，8，12，16，24 h測(cè)定，結(jié)果升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷峰面積的RSD分別為0.90 %，0.87 %，表明樣品溶液至少在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取樣品（批號(hào)160701），按2.2.2項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，按2.1項(xiàng)色譜條件測(cè)定，根據(jù)峰面積計(jì)算升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷的含量，結(jié)果升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷平均含量分別為60.06，52.55 μg/ml，RSD分別為1.13 %，0.98 %，表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密量取已測(cè)定升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷含量的史國(guó)公藥酒（批號(hào)161101）25 ml，平行9份，分為3組，分別精密加入混合對(duì)照溶液1 ml（升麻素苷濃度分別為48.23，60.16，72.52μg/ml，5-O-甲基維斯阿米醇苷濃度分別為48.12，60.25，72.36 μg/ml），按2.2.2項(xiàng)方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)色譜條件測(cè)定，結(jié)果升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷平均回收率分別為98.12 %，97.56 %，RSD分別為0.95 %，0.98 %。

2.9 樣品測(cè)定

取3批次樣品，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)色譜條件測(cè)定，計(jì)算升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷含量。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 樣品測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1 測(cè)定對(duì)象的選擇

史國(guó)公藥酒是祛風(fēng)除濕、活血通絡(luò)的藥品，防風(fēng)具有祛風(fēng)解表、勝濕止痛、止痙的功效[5]，是處方中起主要作用的中藥材之一。因此，選擇防風(fēng)作為該藥酒含量測(cè)定的研究對(duì)象。

3.2 流動(dòng)相的選擇

作者曾選擇甲醇-水、乙腈-水和甲醇-乙腈-水系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，雖能檢測(cè)出成分峰，但峰形拖尾，分離度較低，故將流動(dòng)相改為甲醇-2 %冰醋酸水溶液（40:60），在此條件下各檢測(cè)成分分離度和峰形良好，能獲得滿意的結(jié)果。

3.3 提取方法和溶劑的選擇

史國(guó)公藥酒含大量蔗糖，曾使用柱層析試圖去除試樣的糖分，但在去除糖分的同時(shí)，也使試樣中的升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷流失。后改用水飽和的正丁醇提取，正丁醇提取液用氨試液洗滌后，蒸干，加甲醇溶解后測(cè)定，此方法既可很好地去除藥酒中的糖分和大部分對(duì)目標(biāo)成分測(cè)定有干擾的物質(zhì)，又可避免升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷在制備過(guò)程中的損失。

3.4 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

參照防風(fēng)藥材項(xiàng)下的含量測(cè)定方法[6]并經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷在254 nm波長(zhǎng)處均有最大吸收，因此選擇254 nm作為測(cè)定波長(zhǎng)。