四氫嘧啶高產(chǎn)菌株的篩選及發(fā)酵條件的優(yōu)化

王冠鳳，石艷麗，錢曉路，董艷美，陳 晨，欒貽宏，郭學平

（華熙福瑞達生物醫(yī)藥有限公司，山東 濟南 250100）

為了維持細胞內(nèi)外的滲透壓平衡，防止細胞脫水，極端環(huán)境中的微生物在細胞中會積累一些物質(zhì)以抵抗外界的高滲環(huán)境，這類物質(zhì)主要包括氨基酸及其衍生物、多元醇、糖類、甜菜堿及四氫嘧啶類[1-5]。

四氫嘧啶（1,4,5,6-四氫-2-甲基-4-嘧啶羧酸）作為一類滲透壓補償溶質(zhì)，是細菌體內(nèi)一種相容性溶質(zhì)，它與細胞內(nèi)的新陳代謝相容，并不影響細胞的生物大分子功能或生理過程，且對處于高溫、高鹽、冷凍、干燥、輻射、自由基等不良環(huán)境刺激下的細胞和生物大分子（生物膜、蛋白質(zhì)、酶和核酸）具有保護作用[6-7]，因此四氫嘧啶在細胞保護劑、生物制劑穩(wěn)定劑、藥物制劑、化妝品等領(lǐng)域有重要的應(yīng)用價值和廣闊的應(yīng)用前景。其中，四氫嘧啶在醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)中的應(yīng)用已有大量研究與實例，如一種四氫嘧啶乳霜的臨床研究表明，四氫嘧啶可用于治療特異反應(yīng)性皮炎和神經(jīng)性皮炎。環(huán)境中懸浮微粒可誘發(fā)氣道炎癥反應(yīng)，Sydlik等[8]研究表明，四氫嘧啶能抑制納米顆粒誘導(dǎo)的促炎癥反應(yīng)信號，并劑量依賴性降低肺部中性粒細胞炎癥。Grein等[9]采用無血清細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)人間質(zhì)干細胞，發(fā)現(xiàn)四氫嘧啶是一種優(yōu)良的人間質(zhì)干細胞冷凍保護劑。

四氫嘧啶于1985年在極度嗜鹽光合細菌Ectothiorhodospira halochloris strainDSM 1059中首次被Galinsk等[5]發(fā)現(xiàn)并鑒定結(jié)構(gòu)，是一種環(huán)化的氨基酸衍生物，性質(zhì)穩(wěn)定，不易分解，分子式C6H10O2N2，分子量為142.16，結(jié)構(gòu)式見圖1，外觀為白色粉末，2 %溶液的pH值為6～8，溶于水、甘油、甲醇、乙醇、丙二醇等，不溶于二甲基亞砜、三氯甲烷。

圖1 四氫嘧啶結(jié)構(gòu)式

化學合成四氫嘧啶的前體物（如二氨基丁酸）價格昂貴，且四氫嘧啶分子中有一個手性碳原子，很難用化學方法合成。目前四氫嘧啶的生產(chǎn)方法包括發(fā)酵法和酶催化法。嗜鹽微生物中有四氫嘧啶的合成途徑，因此廣泛用于四氫嘧啶的發(fā)酵法生產(chǎn)。目前已發(fā)現(xiàn)有許多耐鹽菌及嗜鹽菌細胞內(nèi)可合成四氫嘧啶，包括Halomonas elongata,Brevibacterium epidermis,Marinococcus strain M52,Halomonas boliviensis,Chromohalobacter salexigens,Halomonasvenusta[10-15]等。可利用這些微生物采用“細菌擠奶”工藝生產(chǎn)四氫嘧啶，即高鹽誘導(dǎo)下在細胞內(nèi)合成四氫嘧啶，然后經(jīng)低滲沖擊細胞釋放四氫嘧啶，維持細胞內(nèi)外滲透壓平衡。另外，有研究人員用重組工程菌如Escherichia coli[16-18]和Corynebacterium glutamicum[19]，或嗜鹽菌如Halomonas salina[20-21]連續(xù)合成并分泌四氫嘧啶。目前文獻報道的四氫嘧啶發(fā)酵產(chǎn)率最高的是重組大腸桿菌ECT05（pTrcECT，pSTVLysC-CG），產(chǎn)率達25.1 g/L[22]。

當細胞內(nèi)四氫嘧啶達到一定濃度時，合成即受抑制，四氫嘧啶的合成量受胞內(nèi)四氫嘧啶濃度閾值的限制[23]，因此選擇四氫嘧啶胞內(nèi)濃度閾值較高的菌株，可提高四氫嘧啶的發(fā)酵效率。本研究選擇Halomonas neptunia為研究對象，通過人工誘變育種方法，改變其胞內(nèi)四氫嘧啶的濃度閾值，目的在于誘變選育適合于商業(yè)化生產(chǎn)的四氫嘧啶優(yōu)良菌株。

1 材料

1.1 菌株

Halomonas neptuniaATCC BAA-805購自美國ATCC。

1.2 培養(yǎng)基

富集與高鹽選擇性培養(yǎng)基選用OSM培養(yǎng)基[24]（g/L）：蛋白胨10.0，酵母粉2.0，氯化鈉 50.0，氯化鉀2.0，無水硫酸鎂9.7，檸檬酸鈉3.0，無水氯化鈣0.2，pH調(diào)至7.5，固體培養(yǎng)基加瓊脂20.0，121 ℃滅菌15 min。

低鹽培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨10.0，酵母粉2.0，氯化鈉 5.0，氯化鉀2.0，無水硫酸鎂9.7，檸檬酸鈉3.0，無水氯化鈣0.2，pH調(diào)至7.5，固體培養(yǎng)基加瓊脂20.0，121 ℃滅菌15 min。

搖瓶培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖10.0，酵母粉3.0，氯化鈉45.0，無水硫酸鎂2.0，磷酸氫二鉀0.55，七水硫酸亞鐵0.005，檸檬酸鈉3.0，無水氯化鈣0.2，pH調(diào)至7.5，121 ℃滅菌15 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖20.0，酵母粉3.0，氯化鈉50.0，無水硫酸鎂6.0，磷酸氫二鉀3.5，七水硫酸亞鐵0.01，檸檬酸鈉3.0，pH調(diào)至7.5，葡萄糖115 ℃單獨滅菌，其余成分121 ℃滅菌15 min。

補料培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖800，酵母粉150，磷酸氫二鉀35，葡萄糖115 ℃單獨滅菌，其余成分121 ℃滅菌15 min。

1.3 溶液與試劑

四氫嘧啶抽提劑：80 %乙醇；TCL展層劑：正丁醇-甲酸-水混合液（75:15:10）；四氫嘧啶對照品購自Sigma公司。

2 方法

2.1 菌株誘變

2.1.1 菌懸液的制備 用預(yù)先滅菌的10 ml PBS緩沖液洗下新鮮斜面上的菌體，轉(zhuǎn)移至盛有無菌玻璃珠的三角瓶，搖床振蕩30 min，然后用PBS緩沖液梯度稀釋至菌濃度約1×107cfu/ml。

2.1.2 復(fù)合誘變 紫外線誘變：取5 ml菌懸液置于無菌平皿（直徑9 cm），磁力攪拌下，18 W紫外燈下30 cm處照射60 s。

亞硝基胍誘變：將上述經(jīng)紫外線照射后的菌液用0.4 g/L亞硝基胍30 ℃處理50 min后，離心收集菌體，PBS緩沖液洗滌3次，除去殘留的亞硝基胍，然后用富集培養(yǎng)基稀釋至合適濃度后，涂布富集培養(yǎng)基平板，30 ℃培養(yǎng)24 h，計算致死率。復(fù)合誘變設(shè)3個平行。

2.2 正向突變株的篩選

2.2.1 初篩 經(jīng)復(fù)合誘變的菌液適當稀釋后涂布于高鹽選擇性培養(yǎng)基平板，30 ℃倒置培養(yǎng)24 h，篩選長勢良好的菌株，分別接種至低鹽培養(yǎng)基，篩選能快速生長的菌株。

2.2.2 復(fù)篩 將初篩得到的菌株接種至富集培養(yǎng)基，經(jīng)過夜培養(yǎng)活化后，以1 %接種量接種至搖瓶培養(yǎng)基，150 r/min，30 ℃振蕩培養(yǎng)24 h，然后10 000 r/min離心5 min收集菌體后，用等滲氯化鈉溶液充分洗滌3次，10 000 r/min離心5 min，采用乙醇法抽提胞內(nèi)四氫嘧啶[25]。用GF254型硅膠板薄層層析，展層劑為正丁醇-甲酸-水混合液（75:15:10，v/v），顯色劑為水合茚三酮溶于正丁醇溶液，以四氫嘧啶對照品作對照，加熱至130 ℃，時間5 min，觀察結(jié)果，計算遷移率。根據(jù)樣品圈大小粗略篩選出四氫嘧啶產(chǎn)量較高菌株。

2.2.3 遺傳穩(wěn)定性測定 將復(fù)篩得到的四氫嘧啶發(fā)酵產(chǎn)量最高的菌株連續(xù)傳代5次培養(yǎng)，測定每代發(fā)酵液中四氫嘧啶含量，考察菌株的遺傳穩(wěn)定性。

2.3 四氫嘧啶含量測定及結(jié)構(gòu)鑒定

2.3.1 HPLC法測定四氫嘧啶 四氫嘧啶對照品溶液濃度分別為0，2.5，5，10，20，40 μg/ml，根據(jù)譜圖的峰面積和濃度對應(yīng)關(guān)系繪制四氫嘧啶標準曲線。色譜柱為Capcell PAK C18（5 μm，4.6 mm×250 mm），外標法計算圖譜的峰面積。檢測條件：波長210 nm，流動相為色譜級乙腈/水（v/v：98/2），柱溫35 ℃，進樣量20 μl，流速0.8 ml/min。根據(jù)HPLC圖譜中四氫嘧啶目標物的峰面積，代入線性回歸方程Y=91 897X-0.66（R2=0.9990），計算HPLC檢測樣品中四氫嘧啶的含量。其中，Y為HPLC圖譜中四氫嘧啶的峰面積；X為檢測樣品中四氫嘧啶的含量，單位g/L。結(jié)合檢測樣品的稀釋比例，計算出原待測樣品溶液中四氫嘧啶的含量。

2.3.2 紅外光譜分析 采用傅立葉變換紅外光譜儀（型號：NICOLET IR200 FT-IR）檢測四氫嘧啶標準品與樣品，并對比兩者的紅外光譜圖。

2.3.31H-NMR方法 采用核磁共振波譜儀（型號：INOVA 600）檢測四氫嘧啶標準品與樣品，并對比兩者的1H-NMR譜圖，采用的溶劑為甲醇。

2.4 分批補料發(fā)酵

2.4.1 種子培養(yǎng) 將菌株接種至裝液量為150 ml搖瓶培養(yǎng)基的1 L三角瓶內(nèi)，30 ℃，200 r/min，振蕩培養(yǎng)13 h。

2.4.2 高密度發(fā)酵 將種子培養(yǎng)液按5 %接種量接種至裝液量為3 L發(fā)酵培養(yǎng)基的5 L生物反應(yīng)器內(nèi)進行補料分批發(fā)酵，溫度維持30 ℃，5 mol/L HCl/NaOH調(diào)節(jié)pH 7.5～7.8。攪拌轉(zhuǎn)速初始200 r/min，通風量初始3 Nl/min，然后不斷調(diào)整，維持溶氧在20 %～50 %，最高轉(zhuǎn)速和通風量不超過800 r/min和15 Nl/min。通過調(diào)整補料液維持葡萄糖濃度20 g/L，發(fā)酵24 h。

2.4.3 乙醇法抽提胞內(nèi)四氫嘧啶 補料分批發(fā)酵結(jié)束后，8000 r/min離心10 min收集菌體，用等滲NaCl溶液充分洗滌菌體沉淀2次，8000 r/min離心10 min，用80 %乙醇抽提胞內(nèi)四氫嘧啶。經(jīng)減壓蒸發(fā)濃縮后，真空干燥得干品。

2.4.4 細胞干重測定方法 取3 ml發(fā)酵液離心，用3 ml與四氫嘧啶生產(chǎn)用的相同鹽濃度溶液洗滌細胞1次，70 ℃烘干至恒重。

2.5 發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.5.1 氮源 將發(fā)酵培養(yǎng)基中的酵母粉分別用蛋白胨、大豆肽、硫酸銨、谷氨酸鈉代替，終濃度0.3 %，30 ℃發(fā)酵24 h，收集菌體，抽提并測定四氫嘧啶含量，檢測菌體干重。篩選出最佳氮源，將此氮源分別按1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 g/L添加量發(fā)酵，考察氮源的最適濃度。

2.5.2 碳源 將發(fā)酵培養(yǎng)基中的葡萄糖分別用乳糖、蔗糖代替，終濃度2 %，30 ℃發(fā)酵24 h，收集菌體，抽提并測定四氫嘧啶含量，檢測菌體干重。篩選得最佳碳源，將此碳源分別按10，15，20，25，30，35 g/L添加量發(fā)酵，考察碳源的最適濃度。

2.5.3 NaCl濃度 在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入不同量NaCl，濃度分別為2 %，5 %，7 %，10 %，15 %，30 ℃發(fā)酵24 h，收集菌體，抽提并測定四氫嘧啶含量，檢測菌體干重?？疾焖臍溧奏ぐl(fā)酵的最佳NaCl濃度。

2.5.4 pH 在上述最優(yōu)培養(yǎng)基濃度下，考察pH分別為6.0，6.5，7.0，7.5，8.0時對四氫嘧啶產(chǎn)量和菌體生長的影響。

3 結(jié)果

3.1 菌株誘變

最終致死率為92.1 %。

3.2 篩選結(jié)果

3.2.1 初篩 篩選到8株能快速生長的菌株，分別命名為UN-1～UN-8。

3.2.2 復(fù)篩 結(jié)果見表1。菌株UN-2細胞內(nèi)四氫嘧啶含量最高，達1.8 g/L，比原始出發(fā)菌株含量（1.17 g/L）高53.8 %，因此選擇UN-2菌株為對象作進一步研究。

表1 篩選菌株細胞內(nèi)的四氫嘧啶含量

3.2.3 遺傳穩(wěn)定性 以相對于未經(jīng)傳代誘變菌株的四氫嘧啶產(chǎn)量變化率為評價指標，變化率±5 %以內(nèi)的菌株具有遺傳穩(wěn)定性。結(jié)果見表2。誘變菌株的四氫嘧啶發(fā)酵產(chǎn)量變化率小于5 %，表明該菌株的遺傳性能穩(wěn)定。

表2 突變株UN-2經(jīng)5次傳代的遺傳穩(wěn)定性結(jié)果

3.3 四氫嘧啶的結(jié)構(gòu)鑒定

3.3.1 紅外光譜分析結(jié)果 結(jié)果見圖1。

圖1 四氫嘧啶標準品與UN-2胞內(nèi)四氫嘧啶的紅外光譜圖對比

3.3.21H-NMR測定結(jié)果 結(jié)果見圖2。

圖2 四氫嘧啶標準品與UN-2胞內(nèi)四氫嘧啶的1H-NMR譜圖對比

由圖1、圖2可見，UN-2菌株胞內(nèi)提取物與四氫嘧啶標準品的紅外光譜圖和1H-NMR譜圖均一致，可初步判定UN-2胞內(nèi)分泌提取得到的是四氫嘧啶。

3.4 分批補料發(fā)酵結(jié)果

UN-2菌株分批補料發(fā)酵，細胞干重33 g/L，四氫嘧啶產(chǎn)量3.72 g/L。

3.5 UN-2菌株產(chǎn)四氫嘧啶發(fā)酵條件的優(yōu)化

3.5.1 氮源 結(jié)果見圖3。

圖3 不同氮源對生物量和四氫嘧啶產(chǎn)量的影響

由圖3可見，酵母粉最有利于菌體生長，同時可使四氫嘧啶的產(chǎn)量達到最大，是菌株UN-2的最佳氮源，其次是谷氨酸鈉、大豆肽和蛋白胨，無機氮源硫酸銨為氮源時菌體量和四氫嘧啶產(chǎn)量最低。分析原因可能為天然的有機氮源在為微生物生長代謝提供氮成分的同時，還提供微生物生長代謝所需的部分微量元素、生長因子與維生素等。

圖4 不同濃度的酵母粉對生物量和四氫嘧啶產(chǎn)量的影響

圖4表明，當酵母粉濃度1.0～4.0 g/L時，四氫嘧啶產(chǎn)量隨酵母粉濃度增加而增加，當酵母粉濃度4.0 g/L時，四氫嘧啶產(chǎn)量最高，達4.4 g/L；當酵母粉濃度高于4.0 g/L時，四氫嘧啶產(chǎn)量隨酵母粉濃度增加而明顯下降，故酵母粉最佳濃度為4.0 g/L。

3.5.2 碳源 結(jié)果見圖5。

由圖5可見，碳源是葡萄糖時，四氫嘧啶的產(chǎn)量和生物量最高，乳糖和蔗糖為碳源時的產(chǎn)物和生物量均較低。20 g/L葡萄糖作碳源時，四氫嘧啶發(fā)酵產(chǎn)量達4.4 g/L， 遠高于乳糖和蔗糖。因此確定葡萄糖為四氫嘧啶發(fā)酵的最佳碳源。

圖5 不同碳源對生物量和四氫嘧啶產(chǎn)量的影響

圖6 不同濃度的葡萄糖對生物量和四氫嘧啶產(chǎn)量的影響

由圖6可見，葡萄糖濃度10～35 g/L時，隨濃度升高，生物量和四氫嘧啶產(chǎn)量的變化趨勢是一致的，均先增后降；20 g/L時，生物量和四氫嘧啶產(chǎn)量最高。表明適量的葡萄糖利于菌體生長及四氫嘧啶合成，但當葡萄糖濃度過高時，則抑制菌體生長，四氫嘧啶產(chǎn)量也相應(yīng)降低。

3.5.3 NaCl濃度 在確定了濃度為4.0 g/L的酵母粉和濃度為20 g/L的葡萄糖分別為發(fā)酵培養(yǎng)基的最優(yōu)氮源和碳源后，按2.5.3項操作，結(jié)果見圖7。

圖7 不同濃度的NaCl對生物量和四氫嘧啶產(chǎn)量的影響

由圖7可見，隨培養(yǎng)基中NaCl濃度增加，四氫嘧啶的產(chǎn)量先增后減，NaCl 2 %～7 %時，培養(yǎng)基的高滲透壓刺激菌體在細胞內(nèi)合成四氫嘧啶；7 %～15 %時，已達到胞內(nèi)四氫嘧啶的濃度閾值，四氫嘧啶的合成量不再增加，故四氫嘧啶產(chǎn)量隨生物量的降低而下降。細菌生長受到培養(yǎng)基中高滲透壓抑制，生物量逐漸降低。因此，有利于四氫嘧啶合成的最佳NaCl濃度為7 %，此時四氫嘧啶產(chǎn)量為5.53 g/L，生物量33.46 g/L。

3.5.4 pH 在上述最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基配方的基礎(chǔ)上，調(diào)整pH至不同值，考察發(fā)酵培養(yǎng)基pH對生物量和四氫嘧啶產(chǎn)量的影響，結(jié)果見圖8。

圖8 pH對四氫嘧啶產(chǎn)量和生物量的影響

由圖8可見，pH 6.0～7.5時，四氫嘧啶產(chǎn)量和生物量均隨pH升高而增加，至pH為7.5時，兩者達到最高值，分別為5.53 g/L和33.46 g/L；但當pH＞7.5時，四氫嘧啶產(chǎn)量和生物量均有所下降。當pH為7.5時，四氫嘧啶產(chǎn)量最高，原因可能是參與四氫嘧啶合成途徑的酶在pH7.5時的活性最高，也可能是由于此pH條件下的生物量最高，導(dǎo)致單位發(fā)酵液中四氫嘧啶的量最高。

4 討論

本文通過紫外線及亞硝基胍的復(fù)合誘變篩選到了突變株UN-2，搖瓶發(fā)酵條件下，與出發(fā)菌株相比，四氫嘧啶產(chǎn)量提高了53.8 %，并初步探討了不同氮源、碳源、NaCl濃度、pH對胞內(nèi)四氫嘧啶合成的影響。研究確立了UN-2胞內(nèi)四氫嘧啶合成的最佳單因素條件為酵母粉濃度4.0 g/L，葡萄糖濃度20 g/L，NaCl濃度7 %（w/v），pH 7.5。在優(yōu)化條件下，UN-2合成四氫嘧啶的最高產(chǎn)率為5.53 g/L。因菌株UN-2易于培養(yǎng)，NaCl濃度要求范圍寬，且在低氯化鈉濃度下即可合成高產(chǎn)量的四氫嘧啶，具有潛在的商業(yè)應(yīng)用開發(fā)價值。且本文在細菌擠奶工藝的基礎(chǔ)上，采用分批補料發(fā)酵技術(shù)實現(xiàn)細菌的高密度發(fā)酵，在一定程度上提高了發(fā)酵產(chǎn)率。

下一步可開展溫度、接種量、攪拌轉(zhuǎn)速、生物素、氨基酸、金屬離子等相關(guān)因素對發(fā)酵影響的研究工作，以及利用正交試驗或響應(yīng)面法綜合研究各因素對發(fā)酵的影響，為進一步實現(xiàn)商業(yè)化開發(fā)提供更多數(shù)據(jù)。