一測多評法測定茵梔黃顆粒中4個黃酮類成分的含量

李艷芳，黃傳亮，范建偉，劉武占*，關(guān)永霞*

（1. 魯南厚普制藥有限公司，山東 臨沂 276006；2. 中藥制藥共性技術(shù)國家重點實驗室，山東 臨沂 276006；3. 魯南制藥集團股份有限公司，山東 臨沂 276006）

茵梔黃顆粒是由茵陳、梔子、黃芩、金銀花4味中藥提取物制成的常用中成藥制劑，源于《傷寒論》中“茵陳蒿湯”[1]，具清熱解毒、利濕退黃之功效，用于肝膽濕熱所致的黃疸，癥見面目悉黃，胸脅脹痛，惡心嘔吐，小便黃赤，急、慢性肝炎見上述證候者[2]；臨床上對新生兒生理性和病理性黃疸有較好的療效[3-5]。2015年版中國藥典以黃芩苷作為茵梔黃顆粒中黃芩提取物的檢測指標，而黃芩提取物作為處方的主要組成（約占60.25 %），僅控制黃芩苷單一成分的含量難以保證黃芩提取物及茵梔黃顆粒的質(zhì)量。多成分同步質(zhì)量控制是目前國際上廣泛認可的質(zhì)量評價模式[6]，但由于所需對照品物質(zhì)大多難以獲得，極大地限制了該模式的實際應(yīng)用。王智民等[7]提出了“一測多評”的中藥多指標質(zhì)量評價模式，本課題組前期曾用該方法測定梔子中環(huán)烯醚萜苷類成分的含量[8]。基于此，本實驗選擇特征性強、供應(yīng)充足的黃芩苷作為內(nèi)參物，采用高效液相色譜法（HPLC）測定其與野黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素間的相對校正因子，建立茵梔黃顆?！耙粶y多評”含量測定方法，為茵梔黃顆粒的質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1100液相色譜系統(tǒng)（OpenLAB CDS化學工作站，美國Agilent公司），Shimadzu LC-20A高效液相色譜系統(tǒng)（包括LC solution工作站，日本Shimadzu公司）；色譜柱Diamonsi C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），Kromasil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），Platisil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；AG285型電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；KQ250 DB數(shù)控超聲波清洗器（昆山超聲儀器公司，160 W，40 kHz）。

1.2 試藥

對照品野黃芩苷（批號110842-200403），黃芩苷（批號110715-200514），漢黃芩苷（批號112002-201702），黃芩素（批號111595-200905）購自中國食品藥品檢定研究院，均為含量測定用；對照品漢黃芩素（批號MUST-14110311，成都曼斯特，質(zhì)量分數(shù)≥98 %）；茵梔黃顆粒（規(guī)格：3 g/袋，魯南厚普，批號為00917229，00917230，00917231，00917232，00917233，00917234）；乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液制備 精密稱取野黃芩苷、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素對照品適量，分別置50 ml量瓶中，以甲醇溶解并定容置刻度，搖勻，即得各對照品儲備液。依次精密吸取各儲備液適量于同一量瓶中，以甲醇定容至刻度，搖勻，即得濃度分別為27.98，95.28，35.46，70.92，9.6 mg/L的混合對照品溶液。上述混合對照品溶液于4 ℃冷藏，備用。

2.1.2 供試品溶液制備 取茵梔黃顆粒1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50 %甲醇20 ml，稱定重量，超聲30 min，取出，放冷，用50 %甲醇補足失重，搖勻，濾過，即得。

2.1.3 陰性溶液制備 取按茵梔黃顆粒制備方法制得的缺黃芩提取物的陰性樣品，按2.1.2項方法操作，即得。

2.2 液相色譜條件

采用Agilent 1100 高效液相色譜儀，OpenLAB CDS化學工作站。色譜柱：Diamonsi C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.1 %磷酸溶液（B），梯度洗脫（0 ～1 5 min，5 %～6 % A；15～23 min，6 %～10 % A；23～42 min，10 %～20 % A；42～60 min，20 %～25 %A；60～90 min，25 %～60 % A）；流速：1.0 ml/min；檢測波長：274 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：5 μl。

2.3 測定法

分別精密吸取混合對照品溶液和供試品溶液各 5 μl，注入液相色譜儀，測定。

2.4 方法學驗證

2.4.1 專屬性試驗 分別吸取對照品溶液、供試品溶液和陰性溶液各5 μl，按上述色譜條件進樣測定，結(jié)果見圖 1。由圖1 可見，各待測色譜峰均達到基線分離，陰性對照色譜中，在與野黃芩苷、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素相對應(yīng)的保留時間處無干擾。

圖1 對照品（A）、茵梔黃顆粒（B）和缺黃芩提取物陰性樣品（C）的HPLC圖譜

2.4.2 線性關(guān)系考察、檢測限、定量限 分別精密吸取2.1.1項下對照品溶液2，4，6，8，10 μl，注入液相色譜儀，按2.2項下色譜條件測定。以峰面積Y為縱坐標，進樣量（X，μg）為橫坐標，繪制標準曲線，得回歸方程：野黃芩苷Y=4×106X-8532，r=0.9993，線性范圍0.056～0.280 μg，定量限1.680 ng，檢測限0.560 ng；黃芩苷Y=7×106X-1449，r=0.9995，線性范圍0.191～0.953 μg，定量限1.906 ng，檢測限0.572 ng；漢黃芩苷Y=9×106X+6063，r=0.9995，線性范圍0.071～0.355 μg，定量限0.709 ng，檢測限0.213 ng；黃芩素Y=1×107X-10 625，r=0.9991，線性范圍0.142～0.709 μg，定量限1.418 ng，檢測限0.425 ng；漢黃芩素Y=1×107X-15124，r=0.9996，線性范圍0.019～0.096 μg，定量限0.576 ng，檢測限0.192 ng。

2.4.3 精密度試驗 取2.1.1項下對照品溶液，按2.2項色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄野黃芩苷、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素的峰面積，計算RSD值。結(jié)果各成分峰面積的RSD（n=6）分別為0.59 %，0.22 %，0.74 %，0.99 %，0.65 %，表明儀器精密度良好。

2.4.4 重復(fù)性試驗 取同一批茵梔黃顆粒（批號00917229）6份，按2.1.2項下方法制備供試品溶液，按2.2項色譜條件進樣測定。結(jié)果野黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素平均含量分別為0.526，0.738，1.509，0.175 mg/g，RSD分別為1.11 %，0.35 %，1.02 %，0.83 %。表明方法重復(fù)性良好。

2.4.5 穩(wěn)定性試驗 取同一批茵梔黃顆粒（批號00917229），按2.1.2項方法制備供試品溶液，分別于制備后0，4，8，12，16，24 h進樣測定，測得野黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素峰面積的RSD分別為0.91 %，0.74 %，1.06 %，1.04 %，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.6 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的茵梔黃顆粒（批號00917229）0.5 g，平行6份，分別精密加入混合對照品溶液10.0 ml，按2.1.2項方法制備供試品溶液，測定，計算加樣回收率及RSD。結(jié)果野黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素的平均加樣回收率為98.59 %，97.91 %，99.03 %，100.90 %，RSD分別為2.76 %，1.97 %，1.45 %，2.14 %。表明本方法具有良好的回收率。

2.4.7 耐用性試驗 取茵梔黃顆粒（批號00917229）適量，按2.1.2項方法制備供試品溶液，考察柱溫變化（25、30、35 ℃）及不同的色譜柱（Diamonsi C18、Kromasil C18、Platisil C18和Zorbax SB-C18）對測定結(jié)果的影響。結(jié)果顯示上述變化對測定結(jié)果無明顯影響，表明耐用性佳。

2.5 相對校正因子的確定

2.5.1 待測組分相對校正因子的計算 參照文獻[9]，根據(jù)多點校正法計算相對較正因子， 即以多個質(zhì)量濃度點計算所得的相對校正因子的平均值作為含量計算用相對校正因子（fs/i）。按相對校正因子計算公式式中As為內(nèi)參物對照品s峰面積，Cs為內(nèi)參物對照品s濃度，Ai為某待測成分對照品i峰面積，Ci為某待測成分對照品i濃度。取2.1.1項下對照品溶液，分別進樣2，4，6，8，10 μl，測定野黃芩苷、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素的峰面積。以黃芩苷為內(nèi)參物，分別計算黃芩苷（s）對野黃芩苷（a）、漢黃芩苷（b）、黃芩素（c）和漢黃芩素（d）的相對校正因子，見表1。

表1 茵梔黃顆粒中4個黃酮類成分的相對校正因子（n=2）

2.5.2 不同色譜柱對相對校正因子的影響 采用Agilent 1100高效液相色譜系統(tǒng)，分別考察了Diamonsi C18、Kromasil C18、Platisil C18和Zorbax SB-C18色譜柱對茵梔黃顆粒中黃酮類成分相對校正因子的影響，結(jié)果見表2。由表2可見，重現(xiàn)性良好（RSD＜3 %）。

表2 不同色譜柱測得相對校正因子（n=2）

2.5.3 不同儀器對相對校正因子的影響 采用Diamonsi C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，分別考察了Agilent 1100和LC-20A 2種不同的高效液相色譜系統(tǒng)對茵梔黃顆粒中黃酮類成分相對校正因子的影響，結(jié)果見表3。由表3可見，重現(xiàn)性良好（RSD＜3 %）。

表3 不同儀器測得相對校正因子（n=2）

2.5.4 不同柱溫對相對校正因子的影響 采用Agilent 1100高效液相色譜系統(tǒng)和Diamonsil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，分別考察了不同柱溫（25，30，35 ℃）對茵梔黃顆粒中黃酮類成分相對校正因子的影響，結(jié)果見表4。由表4可見，重現(xiàn)性良好（RSD＜3 %）。

表4 不同柱溫測得相對校正因子（n=2）

2.6 待測組分色譜峰的定位

在僅使用黃芩苷1個對照品的情況下，為實現(xiàn)對茵梔黃顆粒中其他幾個黃酮類成分的準確指認，分別考察采用2種高效液相系統(tǒng)及4種規(guī)格色譜柱黃芩苷對野黃芩苷等成分的相對保留時間和保留時間差，結(jié)果相對保留時間波動較小，其RSD為1.07 %～2.40 %，保留時間差的RSD為1.91 %～3.96 %，因此本實驗采用相對保留時間作為色譜峰的定位依據(jù)。根據(jù)實驗結(jié)果最終確定的茵梔黃顆粒中黃芩苷對野黃芩苷等各色譜峰相對保留時間分別為rs/a=1.289，rs/b=0.852，rs/c=0.789，rs/d=0.717。

2.7 QAMS與外標法測定結(jié)果的比較

實驗采用QAMS和外標法對6批茵梔黃顆粒的含量進行了測定，結(jié)果見表5。由表5可見，2種方法測得的含量無顯著性差異，相對偏差均小于2 %，表明本實驗建立的QAMS法可用于茵梔黃顆粒的多成分質(zhì)量評價研究。

表5 外標法和QAMS測定4個黃酮類成分的含量比較（n=2）

3 討論

因黃芩苷性質(zhì)穩(wěn)定、價廉易得，故本實驗選取黃芩苷作為內(nèi)參物進行一測多評。2015年版中國藥典規(guī)定茵梔黃顆粒每袋（3 g）含黃芩苷180～220 mg[2]，即60.0～73.3 mg/g，本課題組研究發(fā)現(xiàn)野黃芩苷等4個成分的含量與黃芩苷含量差異較大，在同一條件下同時檢測黃芩苷與野黃芩苷等4個成分的含量，會產(chǎn)生較大的誤差。因此本次實驗建立以黃芩苷為內(nèi)參物，同時測定茵梔黃顆粒中野黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素含量的一測多評法，未同時測定黃芩苷。

在一測多評法中，如何將待測組分色譜峰進行準確定位，是該法能否順利或成功應(yīng)用的關(guān)鍵。本實驗通過考察2種高效液相系統(tǒng)及4種規(guī)格色譜柱對相對保留時間、保留時間差的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者重現(xiàn)性均較好（RSD＜5 %），最終選擇了波動較小的相對保留時間作為色譜峰的定位依據(jù)。

經(jīng)查閱文獻黃酮類成分檢測波長為2 8 0 nm[10]、278 nm[11]、275 nm[12]、274 nm[6,13]等，本實驗采用DAD檢測器對樣品全波長掃描，發(fā)現(xiàn)在274 nm處，野黃芩苷峰前面的干擾峰降至最低，對其含量測定無影響；其他3個成分亦均有較大吸收，且分離度均大于1.5，因此選取274 nm作為吸收波長。另外在試驗過程中，流動相比例的變化和流速的變化對野黃芩苷的重現(xiàn)性有影響，因此在耐用性試驗中，未考察流動相比例和流速的變化。

采用一測多評法測得茵梔黃顆粒中4個黃酮類成分含量與常規(guī)的外標法測得的含量間無顯著差異，說明在對照品缺乏的情況下，一測多評法作為多指標含量測定方法的一種補充，可用于茵梔黃顆粒的質(zhì)量控制與評價。