一次性使用血漿病毒滅活輸血器材光化學(xué)照射后遺傳毒性研究

侯 麗，喬春霞，王鸞鸞，孫令驍

（1. 山東省醫(yī)療器械產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)中心，山東 濟(jì)南 250101；2. 山東省醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南 250101）

一次性使用血漿病毒滅活輸血器材是采用亞甲藍(lán)/光照病毒滅活法，對(duì)血漿中人類免疫缺陷病毒（HIV）、乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）、人類嗜T淋巴細(xì)胞病毒（HTLV）等脂質(zhì)包膜病毒進(jìn)行滅活，以保證臨床輸血安全的醫(yī)療器械。目前此方法在國內(nèi)各個(gè)血站應(yīng)用較為廣泛[1]。對(duì)于血漿病毒滅活輸血器材的研究，目前主要集中于對(duì)病毒滅活效果、滅活后血漿成分回收率[2-3]、是否產(chǎn)生輸血反應(yīng)[4]等方面，沒有對(duì)亞甲藍(lán)經(jīng)光照后輸入人體后是否有潛在的毒理學(xué)風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行研究。本文作者模擬血漿病毒滅活輸血器材在血站的實(shí)際使用過程，并對(duì)其遺傳毒性進(jìn)行了研究，以評(píng)估此類產(chǎn)品的使用安全性。

1 材料與試劑

1.1 測(cè)試樣品

一次性使用血漿病毒滅活輸血器材（南京雙威醫(yī)學(xué)科技公司）。

1.2 試劑

敵克松，環(huán)磷酰胺，絲裂霉素，甲基磺酸甲酯，2-氨基蕪，三氟胸苷（分析純，Sigma）；RPMI1640培養(yǎng)基（Hyclone?）；新生牛血清（浙江天杭）；羥乙基淀粉130/0.4 氯化鈉注射液（南京正大天晴，批號(hào)1208291）。

1.3 細(xì)胞株

CHL細(xì)胞購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)昆明細(xì)胞庫；L5178Y TK+/- clone（3.7.2C）細(xì)胞購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)上海細(xì)胞庫。

1.4 菌株

鼠傷寒沙門菌組氨酸缺陷型TA97a，TA98，TA100，TA102 菌株（上海寶錄生物科技公司），經(jīng)組氨酸缺陷型鑒定、脂多糖屏障缺陷鑒定、R因子鑒定、紫外線缺陷型鑒定、四環(huán)素抗性鑒定，TA97，TA98，TA100，TA102符合試驗(yàn)要求。

實(shí)驗(yàn)前將菌株接種至肉湯培養(yǎng)基中，于恒溫振蕩器上增菌培養(yǎng)14～16 h（37 ℃，120 r/min）。

1.5 代謝活化系統(tǒng)（S9混合液）

鼠肝微粒體酶混合物（S9勻漿，上海寶錄生物科技公司）。使用前添加其他輔助成分[0.4 mol/L MgCl20.2 ml，1.65 mol/L KCl 0.2 ml，0.05 mol/L葡萄糖-6-磷酸1.0 ml，0.025 mol/L NADP 1.6 ml，0.2 mol/L PBS（pH 7.4）6.0 ml]，將S9勻漿1 ml與以上輔助成分混合液混合配制成S9混合液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

2 方法

2.1 樣品制備方法

按一次性使用血漿病毒滅活輸血器材產(chǎn)品使用說明中的操作方法將血漿病毒滅活輸血器材的血袋穿刺器刺入羥乙基淀粉130/0.4氯化鈉注射液中，使其通過亞甲藍(lán)釋放件全部充入光照袋至標(biāo)稱容量，并使其混勻，經(jīng)市售醫(yī)用病毒滅活柜光照處理，光照處理后經(jīng)一次性使用血漿病毒滅活輸血器材的吸附濾器吸附過濾，制成供試液，受試物含殘留的亞甲藍(lán)及其降解產(chǎn)物。供試液制備后，放置-18 ℃保存待用。臨用前，將裝有供試液的血袋放置37±1 ℃，浸提72±2 h。羥乙基淀粉130/0.4氯化鈉注射液同法制備作為對(duì)照液。

2.2 細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)（Ames試驗(yàn)）

采用鼠傷寒沙門菌組氨酸缺陷型TA 9 7、TA98、TA100和TA102 4種菌株進(jìn)行試驗(yàn)。設(shè)立樣品組，以羥乙基淀粉130/0.4 氯化鈉注射液為陰性對(duì)照，敵克松（TA97菌株、TA98菌株、TA100菌株）、2-氨基芴（TA100菌株）、甲基磺酸甲酯（TA102菌株）為陽性對(duì)照，采用平板摻入法，各菌株分別在加S9與不加S9混合液的條件下進(jìn)行試驗(yàn)。在保溫的頂層培養(yǎng)基中依次加入每種試驗(yàn)菌株新鮮菌液0.1 ml，樣品組分別加供試液0.1 ml（活化組再加10 % S9混合液0.5 ml，無活化組加0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液0.5 ml）；陰性對(duì)照組分別加相應(yīng)的對(duì)照液0.1 ml，陽性對(duì)照組分別加相應(yīng)的誘變劑0.1 ml，其余操作相同。每組3管，混勻后迅速將每管溶液分別傾入底層培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使頂層培養(yǎng)基均勻分布在底層上，平放固化，倒置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48～72 h觀察結(jié)果。計(jì)數(shù)并記錄每一平皿的回變菌落數(shù)，并計(jì)算出3個(gè)平皿的平均值。將所用的4個(gè)測(cè)定品系的每一品系被測(cè)平板的回復(fù)突變平均數(shù)與其相應(yīng)的陰性對(duì)照回復(fù)突變平均數(shù)作比較。

2.3 體外小鼠淋巴瘤細(xì)胞突變?cè)囼?yàn)

采用L5178Y TK+/- clone（3.7.2C）細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。設(shè)立樣品組，以羥乙基淀粉130/0.4 氯化鈉注射液為陰性對(duì)照，甲磺酸甲酯（MMS，無活化系統(tǒng)，10 μg/ml）、7, 12-二甲基苯蒽（DMBA，活化系統(tǒng)，2.5 μg/ml）作為陽性對(duì)照。在加S9與不加S9混合液的條件下進(jìn)行試驗(yàn)，首先調(diào)整L5178Y TK+/- 細(xì)胞濃度至2×105個(gè)細(xì)胞/ml，取10 ml細(xì)胞懸液與9 ml供試液或?qū)φ杖芤夯旌虾蠼佑|培養(yǎng)，最后加入TFT（三氟胸苷，終濃度為3 μg/ml）培養(yǎng)。計(jì)數(shù)各平板無集落生長(zhǎng)的孔數(shù)并計(jì)算PE0（第0天平板效率）和PE2（第2天平板效率）、RS（平板效率相對(duì)存活率）、MF（TFT抗性突變頻率）。

2.4 體外染色體畸變?cè)囼?yàn)

采用中國倉鼠肺細(xì)胞（CHL）進(jìn)行試驗(yàn)。設(shè)立樣品組，以羥乙基淀粉130/0.4 氯化鈉注射液為陰性對(duì)照，絲裂霉素C（MMC，無活化系統(tǒng)，短期接觸0.4 μg/ml和持續(xù)接觸0.2 μg/ml）、環(huán)磷酰胺（CP，活化系統(tǒng)，40 mg/ml）作為陽性對(duì)照。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CHL細(xì)胞，在加S9與不加S9混合液的條件下進(jìn)行，短期接觸組細(xì)胞與供試液或?qū)φ找航佑|6 h，隨后更換新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，持續(xù)接觸組細(xì)胞與供試液或?qū)φ找航佑|24 h，收獲細(xì)胞前3 h用秋水仙素處理細(xì)胞，隨后胰酶處理成細(xì)胞懸液，進(jìn)行低滲處理后固定，用1～2滴細(xì)胞懸液滴片，自然干燥后用5 %吉姆薩染液染色，鏡下觀察并記分，進(jìn)行染色體畸變分析。試驗(yàn)組和對(duì)照組各分析200個(gè)分散良好的中期分裂相，陽性組記錄100個(gè)分散良好的中期分裂相。

3 結(jié)果

3.1 Ames試驗(yàn)結(jié)果

平板計(jì)數(shù)，所有平皿背景生長(zhǎng)良好，菌株自發(fā)回變菌落數(shù)在本實(shí)驗(yàn)室鑒定范圍內(nèi)（見表1）；陽性對(duì)照組回變菌落平均值為介質(zhì)對(duì)照組回變菌落平均值的3倍以上；試驗(yàn)組回變菌落平均值與對(duì)照組回變菌落平均值相比無明顯差異。故試驗(yàn)組與對(duì)照組相比，該供試液對(duì)受試菌株TA97、TA98、TA100和TA102呈陰性反應(yīng)（見表2）。

表1 回變菌落數(shù)鑒定范圍

表 2 Ames試驗(yàn)結(jié)果（±s）

表 2 Ames試驗(yàn)結(jié)果（±s）

組別 TA97 TA98 TA100 TA102-S9 +S9 -S9 +S9 -S9 +S9 -S9 +S9試驗(yàn)組 108±6.6 139±14.0 29±2.6 31±3.1 193±4.0 111±2.6 226±8.0 258±9.5陰性對(duì)照 107±10.1 130±13.4 28±2.3 28±2.5 99±11.2 105±7.0 272±10.6 221±15.1陽性對(duì)照 731±85.5 924±129.9 1177±107.2 2068±154.4 2349±258.0 2697±294.9 2286±120.0 2235±228.6

表3 體外小鼠淋巴瘤細(xì)胞突變?cè)囼?yàn)結(jié)果

3.2 體外小鼠淋巴瘤細(xì)胞突變?cè)囼?yàn)結(jié)果

介質(zhì)對(duì)照組的PE0在60 %～140 %范圍內(nèi)，PE2在70 %～130 %之間，試驗(yàn)組與對(duì)照組比較，該供試液L5178Y TK+/- clone9（3.7.2C）細(xì)胞的突變頻率在S9代謝活化劑存在或不存在的情況下均低于介質(zhì)對(duì)照組的兩倍，試驗(yàn)結(jié)果表明該試驗(yàn)反應(yīng)是陰性的（見表3）。

3.3 體外染色體畸變?cè)囼?yàn)結(jié)果

在加和不加S9代謝活化系統(tǒng)的情況下，染色體畸變率與介質(zhì)對(duì)照相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），表明該供試液無致染色體畸變性（見表4）。

表4 染色體結(jié)構(gòu)畸變?cè)囼?yàn)結(jié)果

4 討論

亞甲藍(lán)是一種堿性生物染料，也是國家藥典收錄的靜脈注射藥物，臨床主要用于治療亞硝酸鹽中毒或診斷示蹤劑。在治療氰化物中毒時(shí)24 h總量不超過500 mg，靜脈注射劑量過大（＞500 mg）時(shí)可出現(xiàn)不良反應(yīng)。血漿病毒滅活的亞甲藍(lán)用量為0.9～1.3 μmol/L，且在病毒滅活后還會(huì)用專門的一次性濾器濾除血漿中85 %以上的亞甲藍(lán)[5]，因此患者所接受的劑量遠(yuǎn)在安全用量范圍以下。但亞甲藍(lán)經(jīng)光照后的殘留及其降解產(chǎn)物輸入人體是否產(chǎn)生未知的不良反應(yīng)，如遺傳毒性、長(zhǎng)期毒性等未見報(bào)道。本研究選擇羥乙基淀粉130/0.4 氯化鈉注射液為模擬液，并通過光照、過濾及儲(chǔ)存等臨床處理過程，評(píng)估光照后亞甲藍(lán)的殘留及其降解產(chǎn)物產(chǎn)生的遺傳毒性作用。

GB/T16886.12規(guī)定樣品制備時(shí)除推薦方法外，也可使用其他適合于器械的性質(zhì)和應(yīng)用或適合于危害識(shí)別方法的浸提介質(zhì)[6]，故本研究沒有按GB/T16886.12中常規(guī)的樣品制備方法，而是按產(chǎn)品使用說明書的使用方法進(jìn)行樣品制備。羥乙基淀粉130/0.4 氯化鈉注射液在臨床上主要應(yīng)用于大出血、大面積燒傷、重癥監(jiān)護(hù)或手術(shù)病人，具有快速、強(qiáng)效的擴(kuò)容效應(yīng)，用以擴(kuò)充血容量，改善微循環(huán)，是臨床上廣泛使用的血漿代用品[7]。在本遺傳毒性試驗(yàn)系統(tǒng)中，羥乙基淀粉130/0.4 氯化鈉注射液作為對(duì)照組并未引起試驗(yàn)體系發(fā)生變化。

本研究根據(jù)GB/T16886.3中遺傳毒性試驗(yàn)方案1進(jìn)行試驗(yàn)[8]。Ames試驗(yàn)從基因水平上反映了遺傳物質(zhì)受損傷情況。本研究結(jié)果顯示，在無論有無活化系統(tǒng)（S9混合液）存在情況下，TA97、TA98、TA100和TA102菌株回復(fù)突變菌落數(shù)均接近自發(fā)突變，與陰性對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果提示亞甲藍(lán)經(jīng)光照后的殘留及其降解產(chǎn)物在體外Ames試驗(yàn)中未發(fā)現(xiàn)致突變作用。小鼠淋巴瘤試驗(yàn)以突變頻率作為指標(biāo)，通過試驗(yàn)樣品誘導(dǎo)小鼠淋巴瘤細(xì)胞（L5178Y）tk基因受損傷而發(fā)生突變的請(qǐng)況，評(píng)價(jià)受試樣品潛在的致突變性。在本研究試驗(yàn)條件下，亞甲藍(lán)經(jīng)光照后的殘留及其降解產(chǎn)物沒有引起小鼠淋巴瘤細(xì)胞克隆形成率的顯著升高。染色體畸變?cè)囼?yàn)以染色體畸變率作為指標(biāo)，通過誘導(dǎo)細(xì)胞染色體發(fā)生畸變性評(píng)價(jià)材料潛在的致突變性。在本研究試驗(yàn)條件下，亞甲藍(lán)經(jīng)光照后的殘留及其降解產(chǎn)物沒有引起細(xì)胞染色體畸變率的顯著升高。以上結(jié)果顯示，亞甲藍(lán)經(jīng)光照后的殘留及其降解產(chǎn)物在本次試驗(yàn)條件下沒有潛在的遺傳毒性。