囊胚發(fā)育速度及形態(tài)學(xué)評(píng)分對(duì)凍融胚胎移植周期單囊胚移植結(jié)局的影響

張怡，嚴(yán)思思，丁錦麗，楊菁

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，湖北省輔助生殖與胚胎發(fā)育醫(yī)學(xué)臨床研究中心，武漢 430060)

隨著培養(yǎng)體系的改善，囊胚移植逐漸得到廣泛應(yīng)用，與卵裂期胚胎移植相比，囊胚移植有利于篩選發(fā)育潛能更佳的胚胎，移植后著床及活產(chǎn)率更高[1]。而單囊胚移植因可保證與雙囊胚移植相近的成功率并可降低多胎妊娠率、早產(chǎn)率等并發(fā)癥而被越來(lái)越多的中心所接受[2-3]。挑選一個(gè)發(fā)育潛能良好的囊胚是選擇性單囊胚移植成功的關(guān)鍵因素之一，但目前預(yù)測(cè)囊胚的發(fā)育潛能主要依據(jù)囊胚的發(fā)育速度及形態(tài)學(xué)評(píng)分，其選擇的標(biāo)準(zhǔn)尚存在爭(zhēng)議[4-5]，而關(guān)于D5及D6日囊胚移植成功率的差異，以及內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)層細(xì)胞與妊娠結(jié)局的關(guān)系并無(wú)明確答案。本研究通過(guò)回顧性分析本中心近2年來(lái)行凍融胚胎移植(FET)周期選擇性單囊胚移植的患者資料，綜合分析比較囊胚發(fā)育速度及形態(tài)學(xué)評(píng)分對(duì)移植結(jié)局的影響，以探討單囊胚移植的優(yōu)化策略。

資料與方法

一、研究對(duì)象

選取2016年1月至2018年6月在武漢大學(xué)人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心行FET周期單囊胚移植的患者。排除年齡>35歲、內(nèi)膜轉(zhuǎn)化日子宮內(nèi)膜厚度<7 mm及行PGD/PGS者。按照上述標(biāo)準(zhǔn)共納入296個(gè)周期。

二、方法

1.囊胚培養(yǎng)及評(píng)分：體外受精第3日，將移植及冷凍后剩余胚胎逐一轉(zhuǎn)移至囊胚培養(yǎng)液，在37℃、6% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，于受精后第5及6日觀察胚胎，按照Gardner評(píng)分系統(tǒng)對(duì)囊胚進(jìn)行評(píng)級(jí)。優(yōu)質(zhì)囊胚的標(biāo)準(zhǔn)定義為3期及3期以上、內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)及滋養(yǎng)層(TE)細(xì)胞均為B級(jí)及以上者；可利用胚胎定義為3期以上、ICM和TE評(píng)分不同時(shí)為C者。選取優(yōu)質(zhì)胚胎及可利用胚胎進(jìn)行冷凍，用于FET周期囊胚移植。

2.囊胚冷凍與復(fù)蘇：囊胚冷凍前行激光皺縮，2 h內(nèi)進(jìn)行玻璃化冷凍。冷凍/解凍液購(gòu)自日本加藤公司，室溫下將囊胚放入平衡液中5 min，然后將囊胚轉(zhuǎn)移至玻璃化冷凍液中，60 s內(nèi)將囊胚放置于冷凍載桿上，迅速浸入液氮中保存。解凍時(shí)將載桿浸入37℃解凍液中，1 min內(nèi)將胚胎轉(zhuǎn)移至稀釋液中作用3 min，后依次在洗滌液1、2中作用5 min，將胚胎轉(zhuǎn)移至囊胚培養(yǎng)液中，37℃、6%CO2環(huán)境中培養(yǎng)，等待囊胚移植。

3.內(nèi)膜準(zhǔn)備與囊胚移植：采用人工或自然周期準(zhǔn)備內(nèi)膜，囊胚移植在腹部超聲引導(dǎo)下進(jìn)行。移植后第12日查血HCG，移植后30 d行B超檢查，見(jiàn)宮內(nèi)孕囊者為臨床妊娠。

三、觀察指標(biāo)

患者一般資料；臨床妊娠率(臨床妊娠例數(shù)占總FET周期數(shù)的百分比)；孕早期流產(chǎn)率(孕3月內(nèi)流產(chǎn)例數(shù)占妊娠例數(shù)百分比)；繼續(xù)妊娠率(孕3月后妊娠例數(shù)占FET周期數(shù)的百分比)。并對(duì)FET周期單囊胚移植妊娠結(jié)局影響因素進(jìn)行二分類(lèi)Logistic回歸分析。

四、統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)或方差分析，率的比較采用卡方檢驗(yàn)，并采用二分類(lèi)Logistic回歸分析對(duì)相關(guān)參數(shù)對(duì)臨床妊娠率的影響進(jìn)行分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、一般資料

本研究共納入296個(gè)周期。接受囊胚移植患者平均年齡為(32.6±5.1)歲，囊胚復(fù)蘇存活率為100%，臨床妊娠124例(41.9%)，孕早期流產(chǎn)15例(12.1%)，繼續(xù)妊娠109例(36.8%)；其中，多胎妊娠2例(0.7%)、異位妊娠3例(1.0%)。

二、囊胚發(fā)育速度對(duì)妊娠結(jié)局的影響

在所納入移植周期中，130例(43.6%)患者移植第5日(D5)囊胚，166例(56.4%)患者移植第6日(D6)囊胚。D5組與D6組患者年齡、內(nèi)膜準(zhǔn)備方案構(gòu)成及內(nèi)膜厚度比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。其中D5組優(yōu)質(zhì)囊胚62例(47.7%)，D6組優(yōu)質(zhì)囊胚49例(29.5%)，D5組優(yōu)質(zhì)囊胚比例顯著高于D6組(P<0.05)。

移植優(yōu)質(zhì)囊胚者，D6組孕早期流產(chǎn)率、臨床妊娠率、繼續(xù)妊娠率均稍高于D5組，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；移植非優(yōu)質(zhì)囊胚者，D5組臨床妊娠率及繼續(xù)妊娠率稍高于D6組，但亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表1)。

表1 不同發(fā)育速度單囊胚移植結(jié)局比較[n(%)]

三、形態(tài)學(xué)評(píng)分對(duì)臨床妊娠的影響

根據(jù)ICM及TE評(píng)分將單囊胚移植患者分為優(yōu)質(zhì)囊胚組及非優(yōu)質(zhì)囊胚組，其中非優(yōu)質(zhì)囊胚組進(jìn)一步細(xì)分為ICM/TE評(píng)分B/C及C/B兩個(gè)亞組。三組間患者年齡、內(nèi)膜準(zhǔn)備方案構(gòu)成及內(nèi)膜厚度均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

對(duì)于移植非優(yōu)質(zhì)囊胚者而言，ICM/TE評(píng)分為C/B者臨床妊娠率及繼續(xù)妊娠率均顯著低于優(yōu)質(zhì)囊胚組(P<0.05)，早期流產(chǎn)率升高，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；而B(niǎo)/C組臨床妊娠率與移植優(yōu)質(zhì)囊胚者相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表2)。

表2 形態(tài)學(xué)評(píng)分對(duì)單囊胚移植結(jié)局的影響[n(%)]

注：與優(yōu)質(zhì)囊胚組比較，*P<0.05

四、臨床妊娠影響因素分析

采用二分類(lèi)Logistic回歸分析。在校正可能的混雜因素影響之后，ICM評(píng)分對(duì)臨床妊娠結(jié)局存在顯著影響[OR=0.12，95%CI(0.03，0.56)，P=0.007]，而囊胚TE評(píng)分、發(fā)育速度等則無(wú)顯著影響(P>0.05)(表3)。

表3 單囊胚FET臨床妊娠影響因素分析

討 論

本研究主要分析了不同發(fā)育速度及不同質(zhì)量的囊胚FET臨床結(jié)局的差異。研究發(fā)現(xiàn)，囊胚發(fā)育速度與FET臨床妊娠率無(wú)顯著相關(guān)性，無(wú)論是移植優(yōu)質(zhì)囊胚還是非優(yōu)質(zhì)囊胚，D5日與D6日單囊胚移植者臨床妊娠率、孕早期流產(chǎn)率及繼續(xù)妊娠率均無(wú)顯著差異。Logistic回歸分析結(jié)果也顯示臨床妊娠結(jié)局與胚胎發(fā)育速度無(wú)關(guān)。然而，當(dāng)對(duì)ICM評(píng)分不同的非優(yōu)質(zhì)囊胚進(jìn)行亞組分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，ICM評(píng)分為C的非優(yōu)質(zhì)囊胚臨床妊娠率及繼續(xù)妊娠率均顯著低于優(yōu)質(zhì)囊胚，孕早期流產(chǎn)率也有增加的趨勢(shì)；而ICM評(píng)分為B級(jí)的非優(yōu)質(zhì)囊胚臨床妊娠率與優(yōu)質(zhì)囊胚相當(dāng)，這與Logistic回歸分析結(jié)果相一致——ICM評(píng)分與臨床妊娠結(jié)局相關(guān)，而TE評(píng)分則無(wú)此影響。在Logistic回歸分析模型中，為排除其他混雜因素的影響，亦將囊胚擴(kuò)張程度、取卵時(shí)患者年齡、FET周期內(nèi)膜準(zhǔn)備方案及內(nèi)膜厚度納入模型中，并未發(fā)現(xiàn)上述變量與妊娠結(jié)局相關(guān)，表明內(nèi)細(xì)胞團(tuán)評(píng)分是影響單囊胚移植妊娠結(jié)局的獨(dú)立因素。

囊胚發(fā)育速度被認(rèn)為是反映胚胎質(zhì)量的指標(biāo)之一。曾有研究表明，在鮮胚移植周期中，D5囊胚移植臨床妊娠率高于D6囊胚，但目前尚不清楚這一結(jié)果究竟與囊胚發(fā)育潛能還是子宮內(nèi)膜容受性降低有關(guān)。FET周期降低了子宮內(nèi)膜容受性對(duì)移植結(jié)局的影響，可更好地判斷囊胚發(fā)育速度與囊胚發(fā)育潛能的關(guān)系，但D5與D6囊胚移植結(jié)局是否存在差異仍有分歧。Irani等[6]回顧性分析了701名活檢后移植行整倍體單囊胚移植周期的妊娠結(jié)局，D5囊胚著床率及活產(chǎn)率均高于D6囊胚。有研究則表明，對(duì)于移植優(yōu)質(zhì)囊胚者，D5及D6囊胚可獲得相近的妊娠率及著床率，但對(duì)于移植非優(yōu)質(zhì)囊胚者，移植D5囊胚結(jié)局明顯優(yōu)于D6囊胚，這可能與D6囊胚非整倍體率發(fā)生率相對(duì)較高有關(guān)[7-9]。另有研究發(fā)現(xiàn)，囊胚復(fù)蘇周期移植成功率主要與囊胚質(zhì)量有關(guān)，而與囊胚發(fā)育天數(shù)無(wú)關(guān)[10]。在本研究中，對(duì)于移植優(yōu)質(zhì)單囊胚患者，D5及D6臨床妊娠結(jié)局無(wú)顯著差異；而對(duì)于移植非優(yōu)質(zhì)單囊胚者，盡管D5囊胚臨床妊娠率較D6囊胚無(wú)顯著差異，但有升高的趨勢(shì)。尚有待進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行分析。

有關(guān)囊胚形態(tài)學(xué)評(píng)分對(duì)囊胚發(fā)育潛能的預(yù)測(cè)價(jià)值目前也存在眾多爭(zhēng)議。近年來(lái)研究表明，囊胚滋養(yǎng)層細(xì)胞在預(yù)測(cè)妊娠結(jié)局方面效果更佳，與持續(xù)妊娠率密切相關(guān)[11]。甄璟然等[12]對(duì)141個(gè)單囊胚復(fù)蘇移植周期分析發(fā)現(xiàn)，在女性年齡、ICM質(zhì)量及TE質(zhì)量三個(gè)變量中，TE評(píng)分對(duì)臨床妊娠有最大預(yù)測(cè)價(jià)值；Honnma等[13]及國(guó)內(nèi)學(xué)者陳清汾等[14]也發(fā)現(xiàn)，對(duì)于非優(yōu)質(zhì)胚胎而言，滋養(yǎng)層細(xì)胞形態(tài)學(xué)評(píng)分低者妊娠率降低、流產(chǎn)率升高。這可能與囊胚滋養(yǎng)層的功能有關(guān)——滋養(yǎng)層細(xì)胞在胚胎著床過(guò)程中是分化發(fā)育成胎盤(pán)的部分，與胚胎著床相關(guān)[15]。但亦有研究表明，ICM評(píng)分越高，整倍體囊胚所占比例越低，與囊胚發(fā)育潛能相關(guān)[16-17]。在本研究，并未發(fā)現(xiàn)TE評(píng)分與移植結(jié)局之間的顯著關(guān)聯(lián)，反之，對(duì)于非優(yōu)質(zhì)囊胚來(lái)說(shuō)，ICM評(píng)分為C者臨床妊娠率及繼續(xù)妊娠率均低于移植優(yōu)質(zhì)囊胚者，間接表明相較于滋養(yǎng)層而言，內(nèi)細(xì)胞團(tuán)質(zhì)量是決定胚胎發(fā)育潛能、影響臨床妊娠率的重要因素。為排除混雜因素對(duì)臨床妊娠結(jié)局的判斷，我們?cè)贚ogistic回歸分析中同時(shí)納入年齡、內(nèi)膜準(zhǔn)備方案、內(nèi)膜厚度等變量，并未發(fā)現(xiàn)上述因素對(duì)妊娠結(jié)局的影響。但有研究發(fā)現(xiàn)，高齡女性(≥39歲)囊胚移植成功率隨之下降[10]，這可能與年齡相關(guān)的非整倍體率上升有關(guān)。而囊胚發(fā)育天數(shù)、ICM評(píng)分及TE評(píng)分這三個(gè)變量中，僅ICM評(píng)分對(duì)妊娠結(jié)局存在影響，表明ICM是決定囊胚發(fā)育潛能的主要因素。

然而，本實(shí)驗(yàn)仍存在一定的缺陷。首先，所納入的單囊胚移植周期數(shù)量較少，對(duì)于組間比較差異無(wú)顯著性的結(jié)果，仍需要擴(kuò)大樣本量進(jìn)行深入研究；此外，因部分病例為近期移植患者，僅能追蹤到移植后3個(gè)月結(jié)局，故僅對(duì)臨床妊娠率、孕早期流產(chǎn)率及繼續(xù)妊娠率進(jìn)行分析，而活產(chǎn)結(jié)局仍有待進(jìn)一步隨訪。

綜上所述，對(duì)于優(yōu)質(zhì)囊胚而言，囊胚發(fā)育速度對(duì)FET周期單囊胚移植結(jié)局影響不大；但對(duì)于非優(yōu)質(zhì)囊胚而言，囊胚發(fā)育速度的影響仍有待進(jìn)一步探索，在本研究中，盡管D6囊胚與D5囊胚相比臨床妊娠率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但仍有一定程度的降低。故在進(jìn)行胚胎移植時(shí)，可傾向于優(yōu)先選擇內(nèi)細(xì)胞團(tuán)評(píng)分較高的D5囊胚，或?qū)⒂锌赡芴岣吲R床妊娠率。