光交聯(lián)羧甲基殼聚糖衍生物水凝膠的制備及性能研究

姚芳蓮，田欣露，孫?達

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光交聯(lián)羧甲基殼聚糖衍生物水凝膠的制備及性能研究

姚芳蓮，田欣露，孫?達

(天津大學化工學院，天津 300350)

以疊氮基團的光耦合反應為交聯(lián)反應制備了疊氮化羧甲基殼聚糖（AZ-CMCS）水凝膠。利用FT-IR紅外光譜、1H-NMR核磁共振譜表征了AZ-CMCS的結構，使用紫外可見分光光度計和流變儀跟蹤了AZ-CMCS凝膠的光交聯(lián)過程，并驗證了凝膠的可注射性. 使用水接觸角測試儀表征了凝膠的親疏水性. 以牛血清白蛋白（BSA）為模型藥物研究了水凝膠在不同pH值下的藥物釋放性能，并研究了人胚胎肺成纖維細胞（MRC-5）在水凝膠上的生長情況．結果表明：通過紫外光照射可快速得到AZ-CMCS水凝膠，反應條件溫和，易于控制；AZ-CMCS水凝膠具有較好的可注射性，且具有一定的pH響應性，其能夠?qū)崿F(xiàn)包載藥物和藥物控釋的功能；此外AZ-CMCS水凝膠對細胞無毒，可作為細胞支架，具有較好的應用前景.

光交聯(lián)；羧甲基殼聚糖；水凝膠；可注射；蛋白釋放；細胞支架

水凝膠是一種親水的三維聚合物網(wǎng)絡，其物理性質(zhì)與軟組織很相似，結構接近細胞外基質(zhì)[1-2]，在組織工程和藥物釋放等領域具有較好的應用前景．

光交聯(lián)是一種制備水凝膠的常用方法，光交聯(lián)反應條件十分溫和，反應過程中所產(chǎn)生的副產(chǎn)物很少．此外，光交聯(lián)反應的反應效率很高，反應過程易于控制．疊氮基團光耦合反應具有反應速度快、反應條件溫和、反應活性高和不產(chǎn)生有毒物質(zhì)等特點[3-4].因此，通過疊氮基團的光耦合反應可快速簡便地得到原位可注射水凝膠，從而拓展水凝膠在藥物載體和組織工程等領域的應用．

殼聚糖及其衍生物可被生物降解且生物相容性好，對生物體幾乎不顯示毒性，是自然界存在的唯一堿性多糖．但是殼聚糖的水溶性較差，從而限制了其在藥物載體和組織工程等領域的應用[5]．O-羧甲基殼聚糖(CMCS)是殼聚糖眾多水溶性衍生物中非常重要的一種，CMCS的分子鏈內(nèi)同時含有氨基和羧基，當外界pH值發(fā)生變化時，氨基和羧基的解離程度也相應改變，因此以CMCS基質(zhì)構建的水凝膠具有pH敏感性，改變介質(zhì)的pH值可實現(xiàn)對藥物的包載和?釋放．

本文以水溶性殼聚糖衍生物CMCS為基本原料，首先制備了疊氮化羧甲基殼聚糖(AZ-CMCS)，進一步基于疊氮基團的光耦合反應構建了具有可注射原位凝膠性能的AZ-CMCS水凝膠，對其光交聯(lián)凝膠形成過程、水凝膠的可注射性、親疏水性進行了研究．同時，研究了水凝膠在不同pH條件下中對BSA的包封和釋放行為，并評價了AZ-CMCS水凝膠的細胞毒性．

1?實驗材料和方法

1.1?材?料

O-羧甲基殼聚糖(CMCS，黏度為36mPa·s)、對氨基苯甲酸(PAC)、無水乙醇、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、濃鹽酸、二甲基亞砜(DMSO)、乙酸乙酯、氯化鉀、碳酸氫鈉、二氧六環(huán)、丙酮、磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉均為分析純，天津元立化工有限公司；疊氮化鈉，優(yōu)級純，上海笛柏化學品技術有限公司；N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)和二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)，均為分析純，天津希恩斯生化科技有限公司；牛血清白蛋白(BSA)和考馬斯亮藍均為生物制劑，上海生工生物工程有限公司；噻唑藍(MTT)，Sigma-Aldrich；MEM培養(yǎng)基，胎牛血清(FBS)和0.25%胰蛋白酶均為生物制劑，Gibco．

1.2?疊氮化羧甲基殼聚糖(AZ-CMCS)的制備

3.425g PAC、濃鹽酸9mL和蒸餾水30mL在0～5℃下攪拌混勻，滴加7mL的4mol/L的亞硝酸鈉溶液，低溫攪拌均勻后，滴加10mL的4mol/L疊氮鈉水溶液，反應結束后用乙酸乙酯萃取，旋蒸乙酸乙酯后得到對疊氮苯甲酸(AZ)(產(chǎn)率81%)．

根據(jù)Choi等[6]報道的方法，取2g AZ溶于40mL二氧六環(huán)，加入1.4g NHS及2.52g DCC，室溫避光反應12h，抽濾除去副產(chǎn)物，用二氧六環(huán)反復沖洗濾餅，旋干濾液中的二氧六環(huán)后經(jīng)真空干燥，得到對疊氮苯甲酸活化酯(NHS-AZ)(產(chǎn)率89%)．

將0.5g CMCS溶于40mL的碳酸氫鈉溶液(pH 8.4)，通過控制NHS-AZ的加入量可得到不同取代度的AZ-CMCS．將0.3012g或0.6024g NHS-AZ在避光條件下充分溶于40mL DMSO中，并將此溶液緩慢滴加到CMCS的碳酸氫鈉溶液中，避光反應72h后用丙酮沉淀，離心，用丙酮多次洗滌后真空干燥得到AZ-CMCS，根據(jù)取代度的不同，將取代度為3%的AZ-CMCS命名為AZ-CMCS(Low SD)(產(chǎn)率77%)，將取代度為5%的AZ-CMCS命名為AZ-CMCS (High SD)(產(chǎn)率72%)．

1.3?光交聯(lián)AZ-CMCS水凝膠的制備

分別取適量不同取代度的AZ-CMCS，將其均配成兩種質(zhì)量濃度的水溶液(30mg/mL和50mg/mL)． 將配好的各AZ-CMCS水溶液在紫外光(400W/365nm)下均照射5min，可得一系列光交聯(lián)AZ-CMCS水凝膠．

1.4?分析與測定

1.4.1?FT-IR及1H-NMR分析

取NHS-AZ或AZ-CMCS與溴化鉀(光譜純)充分研磨后放入壓片機壓片，用NICOLET380 FT-IR紅外光譜儀進行測試．取少量NHS-AZ溶于氘代丙酮中，AZ-CMCS溶于氘代水中，用AVANCE III 400M核磁共振譜儀對其1H-NMR進行檢測．

1.4.2?AZ-CMCS光交聯(lián)過程的跟蹤

分別取適量不同取代度的AZ-CMCS，將其均配制成濃度為0.1mg/mL的水溶液．將配制好的上述各AZ-CMCS水溶液均放在紫外光(400W/365nm)下照射，在不同的時間點取出溶液，用WFZ-26A紫外可見分光光度計測試其在270nm處的吸光度，根據(jù)吸光度計算體系中疊氮基團含量．

通過流變學方法跟蹤AZ-CMC(Low SD)凝膠的交聯(lián)過程．首先將30mg/mL AZ-CMCS水溶液滴加到Stress tech rheometer流變儀樣品池，預掃120s后用紫外光(400W/365nm)照射該溶液，繼續(xù)掃描直至交聯(lián)平衡．掃描頻率為1Hz，應變恒定為1%．

1.5?AZ-CMCS凝膠支架制備及其性能的探究

1.5.1?AZ-CMCS水溶液的可注射性表征

分別稱取適量AZ-CMCS(Low SD)和AZ-CMCS(High SD)，將其均配制成30mg/mL、40mg/mL、50mg/mL的水溶液并分別注入5mL注射器中，通過壓縮實驗檢測推動注射器所需力大?。?/p>

1.5.2?AZ-CMCS水凝膠薄膜的親疏水性測試

分別取適量不同取代度的AZ-CMCS并將其配成溶液，取溶液適量滴在玻璃板上并流平后，經(jīng)紫外光照后得到凝膠，將凝膠放在空氣中干燥、脫模，得到厚度均一的AZ-CMCS薄膜．用HARKE-SPCA水接觸角測定儀測定上述薄膜的親疏水性．

1.5.3?AZ-CMCS凝膠的藥物釋放性能測試

配制不同取代度AZ-CMCS(30mg/mL)的含BSA(2mg/mL)溶液，光交聯(lián)后得到載BSA的AZ-CMCS水凝膠．在所得水凝膠中加入5mL PBS緩沖液(pH＝1.2、pH＝7.4、pH＝9.0)．在不同時間點從釋放介質(zhì)中取出1mL液體，并加入1mL相應的新鮮釋放介質(zhì)．用考馬斯亮藍標準液將取出的樣品染色后，用紫外可見分光光度計測定各個樣品在595nm處的吸光度，進而通過式(1)計算BSA的累積釋放量(%)，即

(1)

式中：0為凝膠負載的BSA總質(zhì)量，mg；為第次置換取樣時釋放液中BSA的質(zhì)量濃度，mg/mL；為緩沖液的置換次數(shù)．

1.5.4?AZ-CMCS凝膠的生物學性能評價

將質(zhì)量濃度為50mg/mL的 AZ-CM(Low SD)溶液加入聚四氟乙烯模具中，在400W/365nm的紫外光下照射30min，使凝膠完全交聯(lián)．冷凍干燥得到干凝膠．將干凝膠加入MEM完全培養(yǎng)基中，在37℃恒溫器中浸提24h．用MEM完全培養(yǎng)液稀釋的質(zhì)量分數(shù)分別為100%、90%、50%、25%、12.5%浸提液在96孔板中(每孔100μL浸提液，每個濃度3個復孔)，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)人胚胎肺成纖維細胞(MRC-5)1d后，各孔均加入10μL MTT溶液，培養(yǎng)4h后吸盡各孔培養(yǎng)基，各孔均加入100μL DMSO溶解細胞中的甲瓚，并將孔板置于搖床中緩慢振蕩10min，在450nm用酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔吸光度(OD)，比較各組OD值，以MEM完全培養(yǎng)基(浸提液的質(zhì)量分數(shù)為0)為陰性對照，根據(jù)式(2)計算細胞相對增殖率(relative growth rate，RGR)，通過RGR的大小判斷材料的細胞毒性．

(2)

將密度為5×104個/mL的MRC-5細胞接種到AZ-CMCS(Low SD)凝膠上，培養(yǎng)細胞7d后，用2.5%戊二醛固定，再用梯度乙醇脫水，將凝膠徹底干燥后在表面噴金，置于S-4800掃描電鏡下觀察．

2?實驗結果與討論

2.1?AZ-CMCS的合成與結構分析

為使AZ與CMCS進行反應，傳統(tǒng)方法用EDC/NHS將AZ的羧基活化，再使AZ與CMCS進行酰胺化反應．但EDC/NHS活化體系對反應條件的控制要求很高，且在該體系下CMCS上羧基與氨基易發(fā)生自交聯(lián)而無法得到水溶性AZ-CMCS[7]．

為避免CMCS自交聯(lián)反應發(fā)生，本文采用DCC/NHS活化體系，先合成NHS-AZ，通過NHS-AZ與CMCS之間的酰胺化反應合成一系列不同取代度的疊氮化羧甲基殼聚糖AZ-CMCS(見圖1)．此合成路線在避免CMCS自交聯(lián)反應的同時還可有效控制疊氮基團取代度，且重復性好．

圖1?AZ-CMCS的合成路線

從圖2(a)NHS-AZ的紅外譜圖中可以看出，在2140cm-1處出現(xiàn)的強吸收峰為NHS-AZ上疊氮基團的特征峰，由圖2(b)NHS-AZ的核磁共振譜圖可知，＝2.97處的峰1為NHS-AZ五元環(huán)上的兩個等效氫的峰；＝8.18和＝7.34處的峰2和峰3為NHS-AZ苯環(huán)上的氫的吸收峰．3個峰的峰面積比為2∶1∶1，符合NHS-AZ上的氫原子數(shù)比．證明NHS-AZ的成功合成．

圖2?NHS-AZ的紅外譜圖和核磁譜圖

圖3(a)為CMCS、AZ-CMCS和光交聯(lián)AZ-CMCS凝膠的紅外譜圖，從圖中可以看出，與CMCS的紅外譜圖相比，AZ-CMCS的紅外譜圖在2133cm-1處出現(xiàn)了一個新的吸收峰，該峰為疊氮基團的吸收峰，證明AZ與CMCS酰胺化反應的成功進行，而經(jīng)過光交聯(lián)后此峰消失，證明疊氮基團完全反應．3425cm-1處伯胺的游離N—H伸縮振動峰和1606cm-1處N—H的彎曲振動峰均隨著取代度的增加而變窄減弱．從圖3(b)中可以看出，與CMCS相比，AZ-CMCS的核磁譜圖上新出現(xiàn)的兩個峰，＝7.75處的峰c和＝7.13處的峰d均隸屬于AZ的苯環(huán)上的氫，且這兩個峰的峰面積之比為1∶1，隨著CMC取代度的增加這兩個峰的峰面積均增加．

圖3 CMCS、AZ-CMCS和光交聯(lián)AZ-CMCS凝膠的紅外譜圖與核磁譜圖

2.2?光交聯(lián)AZ-CMCS凝膠的形成

如圖4所示，光交聯(lián)AZ-CMCS凝膠的形成機理是疊氮基團在紫外光照射下先光解，隨后兩分子AZ-CMCS進行耦合形成偶氮鍵完成交聯(lián)．疊氮基團的光耦合交聯(lián)反應由疊氮基團的光解和偶氮基團的形成兩步反應組成，疊氮基團的光解和偶氮基團的形成同步發(fā)生．

圖4?光誘導AZ-CMCS交聯(lián)

從圖5(a)中可以看出，疊氮基團的光解反應非常迅速．紫外光輻射1s后，270nm處疊氮基團的吸光度降低約40%，這表明1s內(nèi)約40%的疊氮基團消失．經(jīng)過60s照射后，270nm處的吸收消失，疊氮基團反應完全．由圖5(b)可知，不同取代度的AZ-CMCS中疊氮基團的光解速度幾乎相同，說明疊氮基團的光解速度與取代度無關，在40s以內(nèi)，不同取代度的AZ-CMCS中疊氮基團數(shù)目均低于10%．

圖5 疊氮基團的光解過程的紫外可見光譜圖和經(jīng)紫外光照射后AZ-CMCS水溶液的剩余疊氮基團數(shù)目

為了更好地了解光交聯(lián)AZ-CMCS凝膠的形成過程，用流變儀跟蹤了紫外光照射凝膠的全過程．采用恒溫依時性掃描方法跟蹤AZ-CMCS凝膠過程，記錄凝膠交聯(lián)過程中動態(tài)儲能模量(′)和動態(tài)損耗模量(″)．圖6(a)為AZ-CMCS(Low SD)體系在10℃下的流變學曲線．從圖6(a)中可以看出，開始階段′和″的數(shù)值均很低，但″比′數(shù)值大，根據(jù)大分子流變學特性，AZ-CMCS(Low SD)體系在此時處于黏性特性占優(yōu)態(tài)，呈溶膠狀．而引入紫外光源后，′和″的數(shù)值同時增加，且′增加的速度更快，′與″兩者的曲線相交后，′的數(shù)值仍快速增加．AZ-CMCS (Low SD)(固含量3%)的凝膠點為′和″兩者曲線的交點即紫外光照射后第14s．圖6(b)為利用不同溫度下的流變學曲線得到的AZ-CMCS(Low SD)體系光照凝膠時間隨溫度的變化，可以看出溫度越高，凝膠速度越快．

圖6 AZ-CMCS(Low SD)的流變學曲線及溫度對凝膠時間的影響

2.3?AZ-CMCS凝膠的性能

2.3.1?AZ-CMCS溶液的可注射性

通過Pescosolido等[8]報道的方法，測試了AZ-CMCS水溶液的可注射性能，由圖7可知，不同取代度的AZ-CMCS和CMCS溶液注射平衡時的力均遠小于甘油，由于甘油是一種具有良好可注射性能的樣品，因而AZ-CMCS和CMCS溶液均具有較好的可注射性能．此外，注射不同取代度AZ-CMCS和CMCS溶液平衡時的力均隨固含量增大而增大，這是因為體系黏度隨固含量增大而增大．此外，在相同的固含量下，注射AZ-CMCS(Low SD)所需的力低于注射AZ-CMCS(High SD)所需的力，這是由于CMCS的分子間氫鍵因AZ與CMCS上的氨基反應而減弱，溶液黏度減?。鳤Z-CMCS(High SD)由于取代度較高，分子鏈內(nèi)苯環(huán)比AZ-CMCS(Low SD)多，苯環(huán)較大的剛性使其具有較大剛性，且分子鏈更加伸展，苯環(huán)間的π-π堆積作用和殘余的分子間和分子內(nèi)氫鍵均使體系黏度增大．

圖7 各樣品注射平衡時所需的外力(AZ-CMCS的質(zhì)量濃度：30mg/mL，40mg/mL，50mg/mL)

2.3.2?AZ-CMCS水凝膠薄膜的親疏水性

CMCS經(jīng)AZ基團改性前后其親疏水性會有所變化，這里通過測試薄膜的靜態(tài)接觸角來直觀反映CMCS改性前后的親疏水性變化．如圖8所示，AZ-CMCS薄膜的靜態(tài)水接觸角比CMCS薄膜的大，而且AZ-CMCS薄膜的靜態(tài)水接觸角隨取代度的增大而增大，這是由于AZ基團上的疏水基團苯環(huán)降低了CMCS的親水性，且苯環(huán)隨取代度的增加而增多，AZ-CMCS(High SD)的親水性比AZ-CMCS(Low SD)差．

圖8 AZ-CMCS水凝膠薄膜的靜態(tài)水接觸角測試照片和結果

2.3.3?AZ-CMCS凝膠的藥物釋放性能

AZ-CMCS水凝膠具有較好的可注射性能，在極短時間內(nèi)可完成交聯(lián)，可作為生物活性藥物的載體，此外由于AZ-CMCS分子鏈上既含有氨基又含有羧基，因而其具有pH響應性，從而使水凝膠在不同pH值下具有不同的溶脹性能，因此AZ-CMCS水凝膠可同時實現(xiàn)藥物包載和可控藥物釋放．本文以BSA為模型藥物考察AZ-CMCS水凝膠對生物活性藥物的包載及釋放行為．

從圖9(b)可以看出，對于AZ-CMCS(High SD)水凝膠，在pH＝1.2時，幾乎沒有BSA釋放，而在pH＝7.4和pH＝9.0時，BSA都有一定的釋放量．而BSA在3種pH值下均從AZ-CMCS(Low SD)水凝膠中大量釋放．首先，AZ-CMCS的平衡溶脹性能會隨著pH變化而改變(見圖9(a))，對于AZ-CMCS(Low SD)凝膠，在3種pH值下均具有較高的平衡溶脹率，凝膠結構疏松，因而均有大量BSA釋放，而AZ-CMCS(High SD)凝膠在pH＝1.2時，平衡溶脹率最小，因而幾乎沒有BSA釋放，在pH＝7.4和pH＝9.0條件下，AZ-CMCS(High SD)具有一定的平衡溶脹率，因而有一定的BSA從中釋放．其次，BSA的構象和尺寸會隨著pH值的變化而變化(BSA的等電點?pI＝4.7)，在pH＝1.2時BSA分子完全擴張體積最大，不易從結構較為緊密AZ-CMCS(High SD)水凝膠中釋放，在pH＝7.4時，BSA呈球形，體積較小，與pH＝1.2時相比較，容易從AZ-CMCS水凝膠中釋放．而當pH＝9.0時，BSA位于構象轉(zhuǎn)變中間態(tài)，BSA的體積比其在pH＝7.4時有所增大，因此在pH值9.0時，BSA的釋放量比pH＝7.4時的釋放量少．此外在pH＝9.0時，AZ-CMCS的氨基全部脫質(zhì)子化，BSA與AZ-CMCS分子間氫鍵作用最強，加劇了二者的分子間纏結，從而使BSA的釋放受到阻礙.

通過上述不同取代度AZ-CMCS凝膠藥物釋放性能研究可知，AZ-CMCS水凝膠對蛋白類藥物可實現(xiàn)負載和控制釋放．特別地，在pH＝1.2時AZ-CMCS(High SD)凝膠阻斷BSA釋放的能力可有效避免口服藥物在胃酸條件下失活，保護蛋白類藥物安全通過胃部，而在較高pH環(huán)境中可以緩慢釋放，有利于蛋白質(zhì)類藥物的吸收，避免反復服藥．

2.3.4?AZ-CMCS凝膠的生物學性能

從圖10(a)可以看出，在不同的浸提液濃度下，MRC-5細胞培養(yǎng)1d后，其相對增殖率均大于100%，說明AZ-CMCS浸提液對細胞無毒．此外，圖10(b)所示為MRC-5細胞在AZ-CMCS(Low SD)凝膠表面培養(yǎng)7d之后的SEM照片，可以看出細胞形態(tài)及生長狀態(tài)良好，進一步證明AZ-CMCS凝膠具有良好的細胞相容性．

圖10 AZ-CMCS(Low SD)凝膠的細胞毒性和MRC-5細胞在AZ-CMCS支架上培養(yǎng)7d的掃描電鏡照片

3?結?語

本文成功合成了不同取代度的AZ-CMCS，并通過疊氮基團的光耦合反應得到了AZ-CMCS水凝膠．光交聯(lián)動力學研究表明光交聯(lián)反應在20s內(nèi)完成．AZ-CMCS水凝膠具有較好的可注射性和pH響應性，可作為載體包裹BSA并實現(xiàn)pH敏感釋放，細胞毒性實驗表明AZ-CMCS水凝膠具有良好的細胞相容性，因此AZ-CMCS可注射水凝膠作為蛋白類藥物的載體和細胞支架具有較好的應用前景．

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Preparation and Characterization of Photo-Crosslinking Hydrogel of Carboxymethyl Chitosan Derivative

Yao Fanglian，Tian Xinlu，Sun Da

(School of Chemical Engineering and Technology，Tianjin University，Tianjin 300350，China)

The azide carboxymethyl chitosan(AZ-CMCS) hydrogel was prepared by UV-irradiation-induced photo-crosslinking reaction which was based on the optical coupling reaction of azide groups. The chemical structure of the AZ-CMCS hydrogel was characterized by FT-IR and1H-NMR. The photo-crosslinking process was tracked by a rheometer and a UV-Vis spectrophotometer. The injectable property of the AZ-CMCS hydrogel was verified by a rheometer. The hydrophobicity of the AZ-CMCS hydrogel was assessed by a water contact tester. Bovine serum albumin was used as the model drug to analyze the drug release property of the AZ-CMCS hydrogel at different pH values. The growth condition of human embryonic lung fibroblast (MRC-5) cells on AZ-CMCS scaffolds was also investigated. Results showed that the AZ-CMCS hydrogel can be rapidly prepared by UV irradiation. The reaction conditions are mild and controllable. The AZ-CMCS hydrogel has good injectable properties and pH sensibility. The AZ-CMCS hydrogel can load the model drug and control the drug release behavior. Moreover，the AZ-CMCS hydrogel is non- cytotoxic and has a good application prospect as cell scaffold.

photo-crosslinking；carboxymethyl chitsosan；hydrogel；injectable；protein release；cell scaffold

10.11784/tdxbz201804036

TK448.21

A

0493-2137(2019)05-0508-07

2018-04-15；

2018-05-19.

姚芳蓮（1964— ），女，博士，教授.

姚芳蓮，yaofanglian@tju.edu.cn.

國家自然科學基金資助項目(51573127).

the National Natural Science Foundation of China(No. 51573127).

(責任編輯：田?軍)