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    分子印跡技術(shù)在中藥研究中的應(yīng)用

    2019-02-21 23:26:40鄺詠梅吳學(xué)軍姜文清金鵬飛
    西北藥學(xué)雜志 2019年3期
    關(guān)鍵詞:印跡槲皮素單體

    徐 碩,鄺詠梅,吳學(xué)軍,姜文清,金鵬飛

    (北京醫(yī)院藥學(xué)部,國家老年醫(yī)學(xué)中心,藥物臨床風(fēng)險與個體化應(yīng)用評價北京市重點實驗室,北京 100730)

    分子印跡技術(shù)(molecularly imprinting technology,MIT)是指將某一特定的目標分子(也稱為模板分子、印跡分子或烙印分子)作為模板,制備對該分子具有特異選擇性聚合物的過程,常被描述為制造識別分子鑰匙的人工鎖的技術(shù)。該技術(shù)具備特異識別性和構(gòu)效預(yù)定性等優(yōu)勢,分子印跡聚合物的吸附性良好、選擇性高,在目標藥物的識別、富集、分離和檢測中被廣泛應(yīng)用[1]。本文綜述了近年來分子印跡技術(shù)在中藥研究方面的應(yīng)用,以期為該技術(shù)在中藥領(lǐng)域中的推廣應(yīng)用提供參考。

    1 概述

    1.1分子印跡技術(shù)的基本原理 在聚合物單體溶液中,模板分子(印跡分子和目標分子)依靠交聯(lián)劑的作用與功能單體進行聚合,得到模板分子-單體的聚合物,之后通過物理或化學(xué)方法洗去模板分子,即得到分子印跡聚合物,該聚合物印跡有模板分子空間結(jié)構(gòu)和結(jié)合位點,對模板分子具有特異選擇性[2]。

    1.2分子印跡聚合物的制備 制備過程分為3步:①主客體配合物的形成:通過官能團之間的共價、非共價或半共價作用,使得模板分子與功能單體形成配合物;②聚合反應(yīng)的產(chǎn)生:通過加入交聯(lián)劑和致孔劑使其產(chǎn)生反應(yīng);③將聚合物中的模板分子洗掉。按照上述方法制得的分子印跡聚合物有選擇性,與模板分子大小、形狀相匹配的立體孔穴可以在聚合物中留下。由于聚合方法和形式的不同,能夠制得不同形態(tài)的聚合物。分子印跡技術(shù)按照模板分子和功能單體間的相互作用分為非共價法、共價法和半共價法。目前可采用本體聚合、懸浮聚合、乳液聚合、沉淀聚合以及表面印跡法等方式[2-4]。

    2 分子印跡技術(shù)在中藥研究領(lǐng)域的應(yīng)用

    2.1在中藥有效成分提取分離純化中的應(yīng)用 中藥的化學(xué)成分復(fù)雜,采用正相或反相硅膠、大孔吸附樹脂和凝膠柱色譜等常用的柱色譜技術(shù),或結(jié)合制備或半制備液相色譜等技術(shù)進行化學(xué)成分的提取、分離和純化效率普遍較低。而采用分子印跡技術(shù)可以明顯縮短實驗周期,快速分離純化得到目標化合物。

    2.1.1用于黃酮類化合物的分離 黃酮類化合物具有抗炎、抗菌、抗腫瘤、抗氧化和預(yù)防心血管疾病等多種生物活性,藥用開發(fā)價值很高[5-6]。Yang W L等[7]制備柚皮苷印跡聚合物是利用柚皮苷作為模板分子,測試結(jié)果表明,該聚合物的最大平衡吸附量是64.80 μmol·g-1,可以使柚皮苷很快吸附。把該印跡聚合物作為固相萃取吸附劑,有助于從橘紅中提取并富集得到柚皮苷,經(jīng)檢測該化合物的質(zhì)量分數(shù)為72%。Pakade V等[8]制備了槲皮素印跡聚合物,用此聚合物制備固相萃取柱,從辣木的甲醇提取物中分離得到槲皮素與山柰酚2種黃酮苷元。姚杰等[9]采用高良姜素作為模板分子,制備對模板分子具備特異性吸附和識別能力的高良姜素分子印跡聚合物,成功應(yīng)用于藥材中活性成分高良姜素的分離純化。潘浪勝等[10]為分離花生殼中的黃酮類成分,利用木犀草素為模板分子,制備分子印跡聚合物,結(jié)合柱色譜技術(shù),從花生殼體積分數(shù)為70%的乙醇提取物中成功分離得到木犀草素,并經(jīng)氫譜、碳譜和質(zhì)譜等技術(shù)鑒定其結(jié)構(gòu)。

    2.1.2用于蒽醌類化合物的分離 王勝利等[11]利用熱引發(fā)聚合制備大黃酚分子印跡聚合物,大黃酚作為印跡分子,4-乙烯基吡啶作功能單體,聚合物對大黃酚的選擇性能測試是通過固相萃取柱來進行。結(jié)果表明,該印跡聚合物對模板分子具備良好的選擇性及識別能力,使得大黃酚和大黃素甲醚在固相萃取柱上分離良好,大黃酚被富集了23倍。

    2.1.3用于二萜類化合物的分離 樂康等[12]將α-甲基丙烯酸作為功能單體,乙二醇二甲基丙烯酸酯作為交聯(lián)劑,丹參酮ⅡA為模板分子,采用熱聚合法制得對丹參酮ⅡA具備特異選擇性吸附的分子印跡聚合物。該聚合物的識別性能檢測依據(jù)平衡結(jié)合實驗和固相萃取實驗進行評價,結(jié)果顯示,其對丹參酮ⅡA具備很好的識別性能,能達到從丹參酮提取液中分離得到該目標成分的目的。

    2.1.4用于三萜類化合物的分離 倪付勇等[13]將分子模板確定為去氫土莫酸,通過溶膠-凝膠法制得該化合物的分子印跡聚合物,并對其吸附性能進行研究。以此聚合物為填料,從桂枝茯苓膠囊提取物中進一步分離制得去氫土莫酸。經(jīng)Scatchard分析,去氫土莫酸分子印跡聚合物最大表觀結(jié)合位點數(shù)(Qmax)是9.10 mg·g-1。經(jīng)HPLC法檢測去氫土莫酸質(zhì)量分數(shù)為90.76%。該方法能用于從桂枝茯苓膠囊提取物中靶向分離制備去氫土莫酸,減少提取過程中有機溶劑的使用。

    2.1.5用于生物堿類化合物的分離 Suedee R等[14]以奎寧作為模版分子合成印跡聚合物,將合成的分子印跡聚合物用于薄層色譜,結(jié)果表明,該聚合物可很好地識別奎寧分子對映體及與其結(jié)構(gòu)相似的化合物。奎寧在稀硫酸溶液中能產(chǎn)生熒光,盧彥兵等[15]利用熒光法對奎寧分子印跡聚合物(MIP)的吸附性能和識別能力進行探索,測試結(jié)果顯示其離解常數(shù)為1.08×10-3mol·L-1,表觀最大吸附量為131.8 μmol·g-1,為中藥中奎寧的選擇性富集及分析提供了新途徑。Lai J P等[16]采用苦參堿作為模板制備分子印跡膜,從槐屬植物苦參中分離得到苦參堿,測定了分子印跡膜對該成分的回收率(71.4%),為藥材中有效成分的大量提取奠定基礎(chǔ)。

    2.1.6用于鞣質(zhì)類的分離 表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)具有良好的抗氧化、抗腫瘤和降血脂等藥理作用,該化合物可從中國綠茶中分離得到。雷啟福等[17]采用本體聚合法,對EGCG分子印跡聚合物進行合成,通過固相萃取來分離純化茶葉提取物中的EGCG,進而分離得到高純度的EGCG。鐘世安等[18]利用EGCG作為模板分子合成了分子印跡聚合物,將該聚合物制成分子印跡固相萃取柱,用于茶葉中有效成分的提取分離,具有高選擇性和良好的穩(wěn)定性。

    2.1.7用于有機酸類化合物的分離 朱秀芳等[19]采用氫化阿魏酸作為假模板分子,以4-乙烯基吡啶作為功能單體,在乙腈中對印跡聚合物進行制備,該聚合物對阿魏酸的識別能力良好。采用平衡吸附表征了聚合物對阿魏酸的吸附特性及分子識別性能,并采用紫外光譜滴定法和Scachard結(jié)合模型,研究了聚合物的印跡機理和識別機理。結(jié)果顯示,該聚合物對阿魏酸的識別能力高于氫化阿魏酸,在體積分數(shù)為50%的乙腈水溶液中仍能有效識別阿魏酸。將該聚合物應(yīng)用于從川芎水提液中分離阿魏酸,分離結(jié)果良好,表明該聚合物有望成為直接從藥材中分離得到阿魏酸的提取材料。

    2.1.8用于其他類化合物的分離 Faizal C K M等[20]通過相轉(zhuǎn)換法制備維生素E印跡聚合物膜,實驗選用的功能單體是甲基丙烯酸,交聯(lián)劑是丙烯腈,結(jié)果表明,與非印跡膜相比,單位質(zhì)量的膜對維生素E的吸附量是它的10倍。Yin X Y等[21]采用穿心蓮內(nèi)酯作為模板分子制備分子印跡聚合物,作為柱填料應(yīng)用于固相萃取,與碳十八、三氧化二鋁和空白聚合物相比,該聚合物對目標分子的吸附效果具有明顯的優(yōu)越性。向海艷等[22]利用該成分作為模板分子,對白藜蘆醇具有特異選擇性的MIP進行合成。將靜態(tài)平衡結(jié)合法和Scatchard分析法用于吸附性能評價的分析,結(jié)果顯示,該印跡聚合物中形成2種不同的結(jié)合位點,能對白藜蘆醇產(chǎn)生良好的吸附性能與選擇性。在虎杖藥材的提取分離中,采用白藜蘆醇MIP并結(jié)合固相萃取技術(shù),可以將大量白藜蘆醇和少量與其結(jié)構(gòu)相似的化合物白藜蘆醇苷分離,這表明分子印跡分離法可應(yīng)用于中藥有效成分的分離純化中。

    2.2在分離得到多個結(jié)構(gòu)類似物中的應(yīng)用 在治療某些疾病方面,可以充分運用中藥復(fù)方多種藥效成分的綜合藥理作用來達到治愈疾病的目的。近年來,藥學(xué)科研工作者提出復(fù)方藥物有效成分組學(xué)的概念,是指傳統(tǒng)復(fù)方藥物發(fā)揮療效的全部活性成分總和。利用分子印跡技術(shù)的特異性分子識別特性,可以將其作為選擇性分離材料,用于對藥材中發(fā)揮特定藥理作用的有效成分群進行提取分離。通過分析研究提取分離的化合物,可以為闡明中藥復(fù)方的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供參考[23]。

    朱秀芳等[24]利用橙皮苷為模板分子,結(jié)合MIT法,制備分子印跡聚合物,探討該聚合物的吸附選擇性能。結(jié)果顯示,該聚合物能對橙皮苷及與其相似的黃酮苷類成分柚皮苷產(chǎn)生選擇性吸附作用。López Mdel M等[25]將槲皮素作為模板分子,功能單體采用4-乙烯基吡啶合成分子印跡聚合物,結(jié)果顯示這種聚合物能夠很好地識別黃酮類成分槲皮素及黃烷類成分兒茶素,但不能識別α-生育酚這種結(jié)構(gòu)差異較大的化合物。

    2.3在中藥有效成分測定中的應(yīng)用 信建豪等[26]將鹽酸小檗堿作為目標分子,以鐵絲為磁芯,功能單體采用甲基丙烯酸,交聯(lián)劑采用乙二醇二甲基丙烯酸酯,制備聚合成分子印跡攪拌棒。利用該攪拌棒對黃柏中的鹽酸小檗堿進行提取分離,結(jié)合HPLC法測定,檢出限為2.7 mg·L-1。

    曾紹梅等[27]將樟柳堿作為模板分子,功能單體采用甲基丙烯酸,交聯(lián)劑為三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯,致孔劑采用乙腈,利用沉淀聚合法,合成了對4種托烷類生物堿(樟柳堿、東莨菪堿、山莨菪堿和阿托品)具有類特異性識別能力的聚合物。以該分子印跡聚合物為固相萃取柱填料,采用分子印跡固相萃取-高效液相色譜法,富集并分離了藏藥馬尿泡中的4種托烷類生物堿成分。該方法檢出限為0.26~0.39 μg·mL-1,可去除樣品中的雜質(zhì)干擾,提高馬尿泡果實中4種托烷類生物堿的萃取效率。

    2.4在手性物質(zhì)拆分中的應(yīng)用 手性藥物在中藥化學(xué)成分中常見,其對映異構(gòu)體的藥理作用和毒性反應(yīng)往往差異巨大。Dong X等[28]在測定麻黃藥材中的(-)-麻黃堿時,將(-)-麻黃堿作為模板分子,合成(-)-麻黃堿分子印跡聚合物,結(jié)果顯示制備的聚合物能對(-)-麻黃堿產(chǎn)生很好的識別和親和作用。

    Ou J J等[29]在利用HPLC法對延胡索中的D-四氫巴馬丁和L-四氫巴馬丁手性對映體進行分離的過程中,首先采用原位MIT,以L-四氫巴馬丁作為模板分子,合成印跡聚合物整體柱,結(jié)果顯示,模板分子的識別性能非常好,之后反復(fù)摸索色譜條件,使得2種對映體達到滿意的分離度。

    2.5在中成藥中非法添加化學(xué)藥物檢測中的應(yīng)用 黃紅萍等[30]建立了以分子印跡固相萃取-高效液相色譜法測定喘息靈中鹽酸克侖特羅含量的方法。樣品用乙醇超聲提取,濾液蒸干,用體積分數(shù)為1%的鹽酸溶解,加到處理過的鹽酸克侖特羅分子印跡固相萃取小柱上,體積分數(shù)為25%的乙腈水溶液淋洗,甲醇-乙酸(9∶1)洗脫,洗脫液蒸干,用體積分數(shù)為1%的鹽酸定容。以0.05 mmol·L-1磷酸二氫鈉-甲醇(60∶40)為流動相。鹽酸克侖特羅線性范圍為0.4~40.0 μg·mL-1,分離效果良好。

    2.6在活性成分篩選中的應(yīng)用 中藥中的化學(xué)成分十分復(fù)雜,在確定活性成分之后,可將其作為模板分子合成MIP,與模板分子構(gòu)型相似的空穴和對應(yīng)的作用位點就會留在MIPs上,產(chǎn)生特異的吸附性能,與模板分子結(jié)構(gòu)類似的成分也會留在MIPs中。

    中藥藏錦雞兒的乙酸乙酯提取物具有抑制表皮生長因子受體(EGFR)酪氨酸激酶的藥理作用,槲皮素是一種天然的抗EGFR抑制劑。Zhu L L等[31]采用槲皮素MIPs,分離藏錦雞兒乙酸乙酯提取物中的化學(xué)成分。結(jié)果顯示,洗脫液的抗EGFR活性最強,其次是乙酸乙酯提取物,而淋洗液的活性最弱。這表明在洗脫液中,與槲皮素結(jié)構(gòu)相近的化合物被選擇性吸附于固相萃取柱上,結(jié)合高分辨質(zhì)譜對其進行結(jié)構(gòu)鑒定,確定為白皮杉醇和紫鉚查耳酮。活性測試結(jié)果表明2種成分均有抑制EGFR的藥理作用,相比于槲皮素,兩者具有更低的IC50值。將(E)-白皮杉醇確定為模板分子,合成MIP,對紫鉚查耳酮和槲皮素也具備特異的識別性能(這2種化合物均具有抗EGFR酪氨酸酶活性)。RD3-4078是一種丙肝病毒NS3蛋白酶抑制劑,將其作為模板分子制備MIPs,結(jié)合柱色譜技術(shù),從選擇性吸附于柱子上的葉下珠(Phyllanthusurinaria)粗提物中分離得到5個化合物,活性測試結(jié)果顯示均對丙肝病毒NS3蛋白酶有抑制作用[32]。

    3 結(jié)語

    目前分子印跡技術(shù)已成功應(yīng)用于中藥研究的部分領(lǐng)域。在中藥有效成分的分離純化、獲得多個結(jié)構(gòu)類似物、中藥有效成分的測定、手性物質(zhì)拆分、中成藥中非法添加化學(xué)藥物的檢測和活性成分篩選等方面均有應(yīng)用。

    MIP可進行中藥活性成分的篩選研究。該技術(shù)尚存在一些需要進一步深入探索的問題,如分子印跡和識別過程的機制以及定量描述,在功能單體和交聯(lián)劑的選擇方面以及水相MIP等方面存在一定的局限性。對于小分子化合物,分子印跡聚合物的制備和識別相對容易,聚合物的制備方法較為復(fù)雜,且不易識別目標物質(zhì)。對于新型材料的基礎(chǔ)研究較多,但很少運用于實際研究中。印跡聚合物有制備簡便、能重復(fù)應(yīng)用等優(yōu)點,且有機溶劑、酸、堿、熱等因素不會對其分子識別能力產(chǎn)生影響,在中藥研究領(lǐng)域的應(yīng)用前景十分廣闊。

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