低溫和攝食對(duì)虹鱒脂肪酸合成基因表達(dá)的影響?

劉騁躍， 周演根， 孫大江， 高勤峰， 董雙林

(1.海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(中國(guó)海洋大學(xué))，山東 青島 266003； 2.中國(guó)科學(xué)院南海海洋研究所，中國(guó)科學(xué)院熱帶海洋生物資源與生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省應(yīng)用海洋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510301)

魚(yú)類作為變溫動(dòng)物，周圍環(huán)境溫度的變化可以顯著影響其生長(zhǎng)發(fā)育，因此溫度被視為是魚(yú)類整個(gè)生活史中最重要的非生物因素。低溫通常會(huì)造成重要養(yǎng)殖魚(yú)類生長(zhǎng)停滯甚至死亡，如羅非魚(yú)(Oreochromisniloticus)[1]、大黃魚(yú)(Larimichthyscrocea)[2]、點(diǎn)帶石斑魚(yú)(Epinepheluscoioides)[3]及大西洋鮭(Salmosalar)[4]等。

為了應(yīng)對(duì)低溫帶來(lái)的不利影響，魚(yú)類會(huì)做出一列生理生化以及行為上的響應(yīng)。生物膜磷脂是迄今為止發(fā)現(xiàn)的溫度適應(yīng)過(guò)程可以發(fā)生補(bǔ)償重組的結(jié)構(gòu)成分，生物膜結(jié)構(gòu)的重組是魚(yú)類等變溫動(dòng)物對(duì)溫度變化的普遍應(yīng)答方式[5-7]。很多研究已經(jīng)證明，當(dāng)周圍環(huán)境溫度降低時(shí)，魚(yú)類生物膜磷脂sn-1位置中飽和脂肪酸比例下降而單一不飽和脂肪酸的比例上升，sn-2位置中長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸(尤其是DHA和EPA)的比例上升，這一過(guò)程也被稱作“膜脂相變理論”[8-10]。這是由于相對(duì)于飽和脂肪酸，其同源的不飽和脂肪酸的熔點(diǎn)較低并且在膜結(jié)構(gòu)中占據(jù)的空間更大，從而使生物膜結(jié)構(gòu)的流動(dòng)性增加以此降低低溫帶來(lái)的不利影響[8-11]。

不同魚(yú)類主要通過(guò)兩種方式來(lái)改變磷脂中各種脂肪酸的比例，一種途徑是通過(guò)去飽和酶和延長(zhǎng)酶的交替作用逐步生成單一不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪，主要出現(xiàn)在海水魚(yú)當(dāng)中，另一種途徑是通過(guò)脫酰作用和重酰化作用將目的多不飽和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acid, PUFA)和單一不報(bào)飽和脂肪酸(Monounsaturated fatty acid, MUFA)取代磷脂中的飽和脂肪酸(Saturated fatty acid, SFA)，主要出現(xiàn)在淡水魚(yú)當(dāng)中[12-13]。

硬脂酰輔酶A脫氫酶(Stearoyl-coenzyme A desaturase，SCD)可以將飽和脂肪酸(如硬脂酸，18:0)轉(zhuǎn)化為單一不飽和脂肪酸(如油酸，18:1n9)[2， 14]。在包括魚(yú)類的脊椎動(dòng)物中長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸(如ARA，EPA和DHA)的合成則是由C18脂肪酸(如亞油酸，18:2n6；亞麻酸，18:3n3)在去飽和酶(Fatty acid desaturase, Fads)和延長(zhǎng)酶(Elongation of very long chain fatty acids like, Elovl)的交替作用下完成的[15-19]。

虹鱒是世界上養(yǎng)殖國(guó)家最多的鮭鱒魚(yú)類，由于其具有較少的肌間刺、富含蛋白質(zhì)和不飽和脂肪酸因而受到人們的喜愛(ài)[20]。近年來(lái)，虹鱒在中國(guó)的養(yǎng)殖產(chǎn)量逐年遞增，但是由于中國(guó)北方地區(qū)冬季溫度過(guò)低，可能會(huì)引起虹鱒的停食甚至死亡，造成一定的經(jīng)濟(jì)損失。虹鱒作為一種洄游性魚(yú)類，整個(gè)生活史涉及到了淡水和海水環(huán)境，因而其具有獨(dú)特的脂質(zhì)代謝途徑。本研究通過(guò)研究低溫和攝食對(duì)虹鱒肝臟和肌肉中不飽和脂肪酸合成相關(guān)基因的影響，探究其低溫適應(yīng)機(jī)制，為虹鱒的成功越冬提供一定的理論依據(jù)，以此優(yōu)化虹鱒的養(yǎng)殖技術(shù)體系。

1 實(shí)驗(yàn)材料和設(shè)計(jì)

1. 1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)材料為三倍體虹鱒((96.56 ± 8.71) g)，實(shí)驗(yàn)時(shí)間：2017年9月21日～10月4日，實(shí)驗(yàn)用魚(yú)取自日照市萬(wàn)澤豐漁業(yè)有限公司鮭鱒魚(yú)類繁育基地。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)共分為4個(gè)處理組：低溫?cái)z食組(CF)、低溫不攝食組(CU)、正常溫度攝食組(NF)和正常溫度不攝食組(NU)，每個(gè)處理組設(shè)置3個(gè)重復(fù)每個(gè)水缸277 L(高:58 cm，半徑:39 cm)放置20尾魚(yú)。低溫組水溫為6 ℃(以1 ℃/2h的降溫速度將水溫由16 ℃降到6 ℃)，正常溫度組水溫為16 ℃；攝食組每天投喂量占總體重的2%，不攝食組每天投喂量為0。根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)論可知，鮭鱒魚(yú)類(硬頭鱒和大西洋鮭)適應(yīng)低溫過(guò)程中，其生物膜磷脂脂肪酸的補(bǔ)償重組可以在7 d內(nèi)完成，因此，本實(shí)驗(yàn)將采樣時(shí)間點(diǎn)定為第1、3、5、7和14天。

1.3 實(shí)驗(yàn)條件

本實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)在中國(guó)海洋大學(xué)魚(yú)山校區(qū)水產(chǎn)養(yǎng)殖生態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)室(海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將實(shí)驗(yàn)魚(yú)類在實(shí)驗(yàn)室條件下((16 ± 0.5) ℃)暫養(yǎng)2周。暫養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)過(guò)程中攝食組每天投喂2次(投喂時(shí)間：8:00和18:00)，餌料為商品飼料(七好鮭鱒魚(yú)飼料)。在投喂2 h后利用虹吸的方式將殘餌糞便吸出，以保證水質(zhì)。實(shí)驗(yàn)水溫通過(guò)設(shè)定溫控系統(tǒng)(ZKH-WK2000，中科海水處理公司，中國(guó))達(dá)到，波動(dòng)范圍控制在±0.5 ℃。水缸上覆有紗網(wǎng)，防止實(shí)驗(yàn)魚(yú)類躍出。每個(gè)水缸配有2個(gè)氣石并24 h曝氣，使水中溶解氧處于近飽和狀態(tài)(>6 mg/L)。每天換水量為水缸總體積的1/2。光照周期為12 h光照：12 h黑暗。pH始終維持在7.8±0.3，氨氮、硝氮和亞硝氮的含量均低于1 mg/L。

1.4 樣品采集

在投喂后4 h開(kāi)始采樣，每次采樣每缸取3尾魚(yú)，共48尾(每個(gè)重復(fù)12尾魚(yú))。取樣前先用麻醉劑(MS-222，阿拉丁，中國(guó)；70 mg/L)將魚(yú)麻醉，然后采集背肌、鰓絲和肝臟樣品并放入液氮中，采樣結(jié)束后樣樣品轉(zhuǎn)移至超低溫冰箱(-80 ℃)(New Brunswick Scientific, Edison, New Jersey, USA)保存。

1.5 虹鱒肝臟和肌肉中SCD、Δ6 Fad和Elovl2 mRNA表達(dá)水平的檢測(cè)

1.5.1 引物的設(shè)計(jì)與合成 在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore)數(shù)據(jù)庫(kù)中找到虹鱒SCD、Δ6Fad、Elovl2和β-actin的基因序列，然后通過(guò)軟件Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物，引物序列見(jiàn)表1。設(shè)計(jì)完成后的因?yàn)橛杀本┣婵乒具M(jìn)行合成。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR設(shè)計(jì)引物Table 1 Gene-special primers used in the real-time quantitative reverse-transcription PCR

1.5.2 虹鱒肝臟、肌肉和鰓中RNA提取和cDNA合成

(1)將1 mL TRIzol試劑加入1.5 mL EP管中，然后加入50 mg左右組織樣品放，用勻漿儀(Tissuelyser-192，上海凈信；50 Hz, 1 min)進(jìn)行勻漿處理。

(2) 將勻漿后的組織樣品樣品加入200 μL 氯仿，劇烈震蕩15 s，室溫靜置2 min后離心(4 ℃，12 000 r/min，15 min)。樣品分為3層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無(wú)色水相和一個(gè)中間層。

(3)將上層水相轉(zhuǎn)移到新的1.5 mL EP管中，加入等體積的異丙醇，室溫靜置10 min后離心(4 ℃，15 000 r/min，15 min)。離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。

(4)棄上清液，然后用預(yù)冷的75 %乙醇 1mL反復(fù)吹打洗滌后離心(4 ℃，8 000 r/min，5 min)。

(5)把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見(jiàn)后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1 mL TRIzol加入0.5 mL異丙醇，室溫放置10 min。棄上清液然后在濾紙上晾干。

(6)加0.1 % DEPC水100 μL溶解。

(7)測(cè)OD260，計(jì)算RNA的濃度。

(8)測(cè)OD260/OD280 的比值，判定RNA的純度，然后采用瓊脂糖凝膠電泳判定RNA的完整度。

(9)選取合適的RNA樣品，將得到的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

1.5.3 基因表達(dá)量的檢測(cè) 采用StepOnePlusTMReal-time PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems, USA)進(jìn)行測(cè)定，使用專用的熒光定量試劑盒(TaKaRa，Japan)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR的反應(yīng)體系見(jiàn)表2。反應(yīng)條件是為：95 ℃預(yù)變性，30 s；95 ℃變性，5 s；58 ℃退火，34 s；該程序循環(huán)40次。

表2 實(shí)時(shí)定量PCR的反應(yīng)體系Table 2 PCR of reaction system

1.5.4 基因相對(duì)表達(dá)量的計(jì)算 ΔΔCt 法是實(shí)時(shí)熒光定量 PCR分析基因表達(dá)相對(duì)差異中較為常用的方法。PCR擴(kuò)增信號(hào)進(jìn)入到相對(duì)穩(wěn)定對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期時(shí)的熒光值即是閾值，而Ct值是PCR循環(huán)到達(dá)閾值時(shí)所需要的循環(huán)數(shù)。本試驗(yàn)的Ct值是由PCR儀自動(dòng)給出。以GADPH為內(nèi)參照，目的基因在處理組中相對(duì)于對(duì)照組的ΔΔCt 值是由下列公式求得：

ΔΔCt= (Ct目的基因-Ct參照基因)處理組- (Ct目的基因-Ct參照基因)對(duì)照組。

處理組中目的基因相對(duì)于對(duì)照組表達(dá)水平的變化是由下列公式求得:

目的基因表達(dá)水平的差異倍數(shù)=2-ΔΔCt。

1.6 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean ± SD)表示。采用SAS 9.4(SAS Institute Incorporated，Cary，North Carolina，USA)統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，并檢驗(yàn)數(shù)據(jù)是否呈正態(tài)分布以及是否方差齊，如果方差齊則采用SNK(Student-Newman-Keuls)多重比較法分析，如果方差不齊則采用Dames-Howell法。以P<0.05表示為有顯著相關(guān)性。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 SCD mRNA在肝臟中的表達(dá)情況

圖1表示同一時(shí)間不同處理和同一處理不同時(shí)間SCDmRNA在肝臟的相對(duì)表達(dá)量。在14 d以前，不攝食組顯著高于攝食組且CU組高于NU組。NF組在4個(gè)處理組中表達(dá)量最低(P<0.05)。在第14天，表達(dá)量最高的是NU組，其次是CF組，NF組和CU組最低。由圖1 B可知，隨著實(shí)驗(yàn)時(shí)間的增加，NF組和NU組變化不顯著(P>0.05)；CF組在3 d時(shí)SCD的表達(dá)量顯著上升(P<0.05)，但在第5天顯著下降(P<0.05)，此后變化不顯著(P>0.05)。CU組在5 d之前SCD的表達(dá)量一直較高，在第7天后開(kāi)始顯著下降(P<0.05)，第14天時(shí)表達(dá)量最低。

2.2 Δ6 Fad mRNA在肝臟中的表達(dá)情況

圖2表示同一時(shí)間不同處理和同一處理不同時(shí)間Δ6FadmRNA在肝臟的相對(duì)表達(dá)量。由圖2 A可知，在5 d以前，Δ6FadmRNA的表達(dá)量在低溫組顯著高于正常溫度組(P<0.05)，在14 d時(shí)，CU組最低。在第7天時(shí)，CF組顯著高于其他3個(gè)處理組(P<0.05)；在第14天時(shí)，CU組顯著低于正常溫度組(P<0.05)，而CF組顯著高于正常溫度組(P<0.05)。由圖2 B可知，隨著實(shí)驗(yàn)時(shí)間的增加，NF組變化不顯著(P>0.05)；NU組在7 d后出現(xiàn)顯著下降(P<0.05)；CF在第3天顯著上升(P<0.05)，然后在第5天顯著下降(P<0.05)，在7 d后變化不顯著(P>0.05)；CU組在第3天后顯著下降，第7天后變化不顯著(P>0.05)。

(數(shù)值以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示(n=3)。NF：正常溫度攝食組；NU：正常溫度不攝食組；CF：低溫?cái)z食組；CU：低溫不攝食組。A圖表示同一時(shí)間不同處理SCDmRNA的表達(dá)量，不同的小寫(xiě)字母代表同時(shí)間中不同處理存在顯著差異(P<0.05)；B圖表示同一處理不同時(shí)間SCDmRNA的表達(dá)量，不同的小寫(xiě)字母代表同處理中不同時(shí)間存在顯著差異(P<0.05)。Data were presented as mean ± SD (n=3). NF: Normal temperature and feeding treatment; NU: Normal temperature and no feeding treatment; CF: Cold and feeding treatment; CU: Cold and no feeding treatment. The different letters in A mean significant difference between the different treatment for each specific sample time (P<0.05) and the different letters in B mean significant difference between the different sampling times for each specific treatment (P<0.05). )

圖1 溫度和攝食對(duì)虹鱒肝臟組織SCDmRNA表達(dá)的影響
Fig.1 The effect of temperature and feeding on the level ofSCDmRNA in liver

2.3 Elovl2 mRNA在肝臟中的表達(dá)情況

圖3表示同一時(shí)間不同處理和同一處理不同時(shí)間Elovl2 mRNA在肝臟的相對(duì)表達(dá)量。由圖3 A可知，除第7天外，CF組中Elovl2 mRNA的表達(dá)量在4個(gè)組中最高，而NF組最低。在第7天時(shí)，NU組表達(dá)最高；在第14天時(shí)，CU組和NU組與NF組差異不顯著(P>0.05)且顯著低于CF組(P<0.05)。由圖3 B可知，隨著實(shí)驗(yàn)時(shí)間的增加，NF組變化不顯著(P>0.05)；NU組在第14天時(shí)顯著下降(P<0.05)；CF組在第7天顯著下降(P<0.05)，CU組在第3天顯著增加(P<0.05)，隨后在第5天顯著下降(P<0.05)。

(數(shù)值以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示(n=3)。NF：正常溫度攝食組；NU：正常溫度不攝食組；CF：低溫?cái)z食組；CU：低溫不攝食組。A圖表示同一時(shí)間不同處理Δ6FadmRNA的表達(dá)量，不同的小寫(xiě)字母代表同時(shí)間中不同處理存在顯著差異(P<0.05)；B圖表示同一處理不同時(shí)間Δ6FadmRNA的表達(dá)量，不同的小寫(xiě)字母代表同處理中不同時(shí)間存在顯著差異(P<0.05)。Data were presented as mean ± SD (n=3). NF: Normal temperature and feeding treatment; NU: Normal temperature and no feeding treatment; CF: Cold and feeding treatment; CU: Cold and no feeding treatment. The different letters in A mean significant difference between the different treatment for each specific sample time (P<0.05) and the different letters in B mean significant difference between the different sampling times for each specific treatment (P<0.05).)

圖2 溫度和攝食對(duì)虹鱒肝臟組織Δ6FadmRNA表達(dá)的影響
Fig.2 The effect of temperature and feeding on the level ofΔ6FadmRNA in liver

2.4 SCD mRNA在肌肉中的表達(dá)情況

圖4表示同一時(shí)間不同處理和同一處理不同時(shí)間SCDmRNA在肌肉中的表達(dá)水平。由圖4 A可知，7 d以前，低溫度的SCDmRNA的表達(dá)量均顯著大于正常溫度組(P<0.05)，并且除第5天外，相同溫度處理組，攝食組和不攝食組差異不顯著(P>0.05)。第14天時(shí)，NF、NU、CU三個(gè)處理組差異不顯著(P>0.05)且現(xiàn)在低于CF組。由圖4 B可知，隨著時(shí)間的變化，NF組和NU組變化不顯著(P>0.05)；CF組和CU組在實(shí)驗(yàn)初期變化不顯著(P>0.05)，分別在第3和5天顯著下降(P<0.05)。

(數(shù)值以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示(n=3)。NF：正常溫度攝食組；NU：正常溫度不攝食組；CF：低溫?cái)z食組；CU：低溫不攝食組。A圖表示同一時(shí)間不同處理Elovl2 mRNA的表達(dá)量，不同的小寫(xiě)字母代表同時(shí)間中不同處理存在顯著差異(P<0.05)；B圖表示同一處理不同時(shí)間Elovl2 mRNA的表達(dá)量，不同的小寫(xiě)字母代表同處理中不同時(shí)間存在顯著差異(P<0.05)。Data were presented as mean ± SD (n=3). NF: Normal temperature and feeding treatment; NU: Normal temperature and no feeding treatment; CF: Cold and feeding treatment; CU: Cold and no feeding treatment. The different letters in A mean significant difference between the different treatment for each specific sample time (P<0.05) and the different letters in B mean significant difference between the different sampling times for each specific treatment (P<0.05).)

圖3 溫度和攝食對(duì)虹鱒肝臟組織Elovl2 mRNA表達(dá)的影響
Fig.3 The effect of temperature and feeding on the level ofElovl2 mRNA in liver

2.5 Δ6 Fad mRNA在肌肉中的表達(dá)情況

圖5表示同一時(shí)間不同處理和同一處理不同時(shí)間Δ6FadmRNA在肌肉中的表達(dá)水平。由圖5 A可知，在第5天以前，正常溫度組Δ6FadmRNA的表達(dá)量顯著低于低溫度(P<0.05)，NF和NU差異不顯著，CF組在3 d以前顯著高于CU組(P<0.05)，在第5天CU組和CF組差異不顯著(P>0.05)。在第14天，CF組顯著高于正常溫度組，CU顯著低于正常溫度組(P<0.05)。由圖5 B可知，NF組和NU組隨著時(shí)間的變化不顯著(P>0.05)，CF組和CU組在實(shí)驗(yàn)初期變化不顯著(P>0.05)，分別在第5和7天顯著降低(P<0.05)。

(數(shù)值以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示(n=3)。NF：正常溫度攝食組；NU：正常溫度不攝食組；CF：低溫?cái)z食組；CU：低溫不攝食組。A圖表示同一時(shí)間不同處理SCDmRNA的表達(dá)量，不同的小寫(xiě)字母代表同時(shí)間中不同處理存在顯著差異(P<0.05)；B圖表示同一處理不同時(shí)間SCDmRNA的表達(dá)量，不同的小寫(xiě)字母代表同處理中不同時(shí)間存在顯著差異(P<0.05。Data were presented as mean ± SD (n=3). NF: Normal temperature and feeding treatment; NU: Normal temperature and no feeding treatment; CF: Cold and feeding treatment; CU: cold and no feeding treatment. The different letters in A mean significant difference between the different treatment for each specific sample time (P<0.05) and the different letters in B mean significant difference between the different sampling times for each specific treatment (P<0.05).)

圖4 溫度和攝食對(duì)虹鱒肌肉組織中SCDmRNA表達(dá)的影響
Fig.4 The effect of temperature and feeding on the level ofSCDmRNA in muscle

(數(shù)值以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示(n=3)。NF：正常溫度攝食組；NU：正常溫度不攝食組；CF：低溫?cái)z食組；CU：低溫不攝食組。A圖表示同一時(shí)間不同處理Δ6FadmRNA的表達(dá)量，不同的小寫(xiě)字母代表同時(shí)間中不同處理存在顯著差異(P<0.05)；B圖表示同一處理不同時(shí)間Δ6FadmRNA的表達(dá)量，不同的小寫(xiě)字母代表同處理中不同時(shí)間存在顯著差異(P<0.05)。Data were presented as mean ± SD (n=3). NF: Normal temperature and feeding treatment; NU: Normal temperature and no feeding treatment; CF: Cold and feeding treatment; CU: cold and no feeding treatment. The different letters in A mean significant difference between the different treatment for each specific sample time (P<0.05) and the different letters in B mean significant difference between the different sampling times for each specific treatment (P<0.05).)

圖5 溫度和攝食對(duì)虹鱒肌肉組織中Δ6fadmRNA表達(dá)的影響
Fig.5 The effect of temperature and feeding on the level ofΔ6fadmRNA in muscle

2.6 Elovl2 mRNA在肌肉中的表達(dá)情況

圖6表示同一時(shí)間不同處理和同一處理不同時(shí)間Elovl2 mRNA在肌肉中的表達(dá)水平。由圖6 A可知，在5 d以前，正常溫度Elovl2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量顯著低于低溫組(P<0.05)，且NF組顯著低于NU組(P<0.05)，CU組在第1天時(shí)顯著低于CF組(P<0.05)。在7 d時(shí)，CF組顯著高于NF、NU、CU三個(gè)處理組(P<0.05)；在第14天時(shí)，CU組顯著低于正常溫度組(P<0.05)而CF顯著高于正常溫度組(P<0.05)。由圖6 B可知，隨著實(shí)驗(yàn)時(shí)間的增加，正常溫度組變化不顯著(P>0.05)，低溫度在實(shí)驗(yàn)初期變化不顯著(P>0.05)，CF和CU組分別在第5和7天顯著下降(P<0.05)。

(數(shù)值以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示(n=3)。NF：正常溫度攝食組；NU：正常溫度不攝食組；CF：低溫?cái)z食組；CU：低溫不攝食組。A圖表示同一時(shí)間不同處理Elovl2 mRNA的表達(dá)量，不同的小寫(xiě)字母代表同時(shí)間中不同處理存在顯著差異(P<0.05)；B圖表示同一處理不同時(shí)間Elovl2 mRNA的表達(dá)量，不同的小寫(xiě)字母代表同處理中不同時(shí)間存在顯著差異(P<0.05。Data were presented as mean ± SD (n=3). NF: normal temperature and feeding treatment; NU: Normal temperature and no feeding treatment; CF: Cold and feeding treatment; CU: Cold and no feeding treatment. The different letters in A mean significant difference between the different treatment for each specific sample time (P<0.05) and the different letters in B mean significant difference between the different sampling times for each specific treatment (P<0.05).)

圖6 溫度和攝食對(duì)虹鱒肌肉組織中Elovl2 mRNA表達(dá)的影響
Fig.6 The effect of temperature and feeding on the level ofElovl2 mRNA in muscle

3 討論

魚(yú)類可以直接通過(guò)去飽和作用合成單一不飽和脂肪酸。SCD是單一不飽和脂肪酸合成中的限速酶，它使得棕櫚酸(16：0)和硬脂酸(18：0)中C9和C10之間形成雙鍵變?yōu)樽貦坝退?16：1n7)和油酸(18：1n9)(Δ6 Fad和Elovl2均參與合成長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸(long-chain polyunsaturated fatty acid, LC-PUFA)途徑之一“Sprecher經(jīng)典途徑”[21]。

同其他脊椎動(dòng)物類似，魚(yú)類機(jī)體內(nèi)缺少Δ12和Δ15去飽和酶，因此無(wú)法直接將飽和脂肪酸轉(zhuǎn)化成為L(zhǎng)C-PUFA，但是可以將亞油酸(18：2n6)和亞麻酸(18：3n3)通過(guò)多種Fad和Elovl交替著相互作用合成LC-PUFA[21-24]。由于攝食環(huán)境的不同，淡水魚(yú)和洄游性魚(yú)類具有較強(qiáng)的LC-PUFA的合成能力，但是海水魚(yú)類LC-PUFA的生物合成能力較弱[25]。不同魚(yú)類主要通過(guò)兩種方式來(lái)改變磷脂中各種脂肪酸的比例，一種途徑是通過(guò)去飽和酶和延長(zhǎng)酶的交替作用逐步生成單一不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪，另一種途徑是通過(guò)脫酰作用和重?；饔脤⒛康腜UFA和MUFA取代磷脂中的SFA[12-13]。

由圖1～3可知，正常溫度下，虹鱒攝食組肝臟中SCD、Δ6Fad和Elovl2 mRNA的表達(dá)量顯著低于不攝食組，但在第14天時(shí)顯著下降(SCD下降但是不顯著)。這表明攝食顯著影響虹鱒肝臟對(duì)脂肪酸的調(diào)控，在營(yíng)養(yǎng)供給充足的情況下，主要通過(guò)脫酰和重?；饔?替代作用)來(lái)完成機(jī)體對(duì)MUFA和PUFA的需求；在營(yíng)養(yǎng)供給不足時(shí)，可以通過(guò)相關(guān)脂肪酸生物合成作用來(lái)滿足MUFA和PUFA的需求，但由于PUFA的生物合成需要C18PUFA，因此當(dāng)饑餓導(dǎo)致LC-PUFA的前體脂肪酸下降時(shí)，Δ6Fad和Elovl2 mRNA表達(dá)量也會(huì)下降。很多研究表明，在食物充足的情況下，不飽和脂肪酸的生物合成基因受到抑制[26-28]。此外，張振宇研究發(fā)現(xiàn)，大黃魚(yú)(Larimichthyscrocea)在禁食2周時(shí)，肝臟中脂肪酸去飽和酶(Fad)活性顯著下降[33]。由圖4～6可知，在正常溫度下，虹鱒肌肉攝食組中SCD、Δ6Fad和Elovl2 mRNA表達(dá)量與不攝食組差異不顯著。這可能是由于虹鱒肌肉中會(huì)沉積大量脂肪，當(dāng)營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)不足時(shí)，可以及時(shí)進(jìn)行補(bǔ)充，以滿足MUFA和PUFA的正常需要。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不論是虹鱒肌肉還是肝臟，低溫組Δ6Fad和Elovl2 mRNA表達(dá)量顯著高于正常溫度組。虹鱒肝臟中，SCDmRNA在CU組表達(dá)較高，而在CF組中表達(dá)較低；而在肌肉中，SCDmRNA在CF組和CU組均表達(dá)量顯著高于正常溫度組。低溫組中3個(gè)基因在第5或7天后顯著下降，在第14天時(shí)，CU組中的表達(dá)量甚至低于NF組。磷脂是目前已知唯一可以對(duì)溫度變化做出響應(yīng)的生物膜結(jié)構(gòu)成分。很多研究已經(jīng)證明，當(dāng)周圍水溫下降后，魚(yú)類可以通過(guò)增加生物膜磷脂的流動(dòng)性來(lái)適應(yīng)低溫，而膜流動(dòng)性增加主要體現(xiàn)在：sn-1位置中，SFA比例下降而MUFA比例上升；sn-2位置中PUFA所占比例上升[8，29-30]。Ruyter等[31]的研究發(fā)現(xiàn)大西洋鮭在低溫環(huán)境下(水溫為5 ℃)肝臟DHA的合成速率要顯著高于正常養(yǎng)殖溫度(水溫為12 ℃)。Tocher等[32]發(fā)現(xiàn)虹鱒肝細(xì)胞在5 ℃時(shí)Δ6 Fad的活性顯著高于在17 ℃時(shí)。Xu等[2]在逐漸降溫條件下大黃魚(yú)肝臟中SCDmRNA的表達(dá)水平先升高后下降，并認(rèn)為SCDmRNA表達(dá)量的下降主要是因?yàn)榈蜏睾宛囸I雙重脅迫的原因。本實(shí)驗(yàn)中虹鱒肝臟SCDmRNA的表達(dá)量在CF組較低，這可能是因?yàn)楹琪V通過(guò)攝食可以在一定程度上補(bǔ)充MUFA，由此SCDmRNA的表達(dá)量不高。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)周圍環(huán)境溫度降低時(shí)，虹鱒不論是肝臟還是肌肉，MUFA和PUFA生物合成量增加。虹鱒在攝食條件下，大約在5～7 d可以適應(yīng)低溫；在長(zhǎng)時(shí)間的饑餓和低溫脅迫下，虹鱒機(jī)體內(nèi)的脂肪酸生物合成可能會(huì)受到影響。虹鱒在低溫的適應(yīng)過(guò)程中，食物中的MUFA可以滿足肝臟的需求，但無(wú)法滿足肌肉的需求。

4 結(jié)語(yǔ)

攝食顯著影響魚(yú)類肝臟對(duì)脂肪酸的調(diào)控，在營(yíng)養(yǎng)供給充足的情況下，虹鱒主要通過(guò)脫酰和重?；饔?替代作用)來(lái)完成機(jī)體對(duì)MUFA和PUFA的需求；在營(yíng)養(yǎng)供給不足時(shí)，其可以通過(guò)相關(guān)脂肪酸生物合成作用來(lái)滿足MUFA和PUFA的需求。由于虹鱒肌肉中有大量脂肪沉積，因而短時(shí)間的不攝食對(duì)其影響較小。虹鱒肝臟SCDmRNA的表達(dá)量在CF組較低，這可能是因?yàn)楹琪V通過(guò)攝食可以在一定程度上補(bǔ)充MUFA，由此SCDmRNA的表達(dá)量不高。當(dāng)周圍環(huán)境溫度降低時(shí)，虹鱒不論是肝臟還是肌肉，MUFA和PUFA生物合成量增加。虹鱒在正常營(yíng)養(yǎng)條件下，大約在5～7 d可以適應(yīng)低溫；在長(zhǎng)時(shí)間的饑餓和低溫脅迫下，虹鱒機(jī)體內(nèi)的脂肪酸生物合成可能會(huì)受到影響。