HKU1型冠狀病毒纖突蛋白受體結(jié)合域研究進(jìn)展

陶靖隆，王玉梁，關(guān)超玲，王俊虹，趙國(guó)平 綜述 魏茂提 審校

人冠狀病毒(human coronavirus，HCoV)是引起人類感染的一類重要病毒。該類病毒危害最為嚴(yán)重當(dāng)屬2002—2003年的嚴(yán)重呼吸道綜合征冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS-CoV)[1]，SARS-CoV的傳播和流行造成世界范圍內(nèi)8422人感染，病死率為11%[2](不同國(guó)家或地區(qū)病死率為7%～24%)。SARS-CoV的傳播和流行，顛覆了冠狀病毒只引起人類輕微呼吸道感染癥狀的傳統(tǒng)觀點(diǎn)。自2012年9月起，一種感染特征與SARS相似的新冠狀病毒——中東呼吸道冠狀病毒(Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus，MERS-CoV，該病毒最初被稱為EMC)再次發(fā)生流行[3]。據(jù)WHO資料，截至2016年12月23日，全世界范圍內(nèi)發(fā)生1864例感染該種冠狀病毒，病死659例，病死率為35.35%(95% CI 33.18%-37.52%)[4]。我國(guó)部分地區(qū)在2005-2009和2009-2011年間的臨床流感樣病例監(jiān)測(cè)資料顯示，冠狀病毒檢出率分別是1%和16%[5,6]，本課題組2009-2011年監(jiān)測(cè)結(jié)果也顯示冠狀病毒檢出率在1.86%。雖然我國(guó)目前并未監(jiān)測(cè)到大規(guī)模的冠狀病毒流行或暴發(fā)，但是冠狀病毒在我國(guó)流行的風(fēng)險(xiǎn)仍然存在。HKU1型冠狀病毒(HKU1-coronavirus，HKU1-CoV)自2005年發(fā)現(xiàn)至今由于在國(guó)內(nèi)感染率較低，臨床癥狀較輕，分離鑒定難度高，研究進(jìn)展緩慢。作為唯一一種沒(méi)有確定人體細(xì)胞受體的冠狀病毒，隨著MERS-CoV流行也引起了研究者的關(guān)注，筆者主要從病毒的Spike蛋白及可能的人受體方面進(jìn)行綜述。

1 HKU1-CoV流行病學(xué)及其危害

HKU1-CoV是2005年Woo等[7]從一個(gè)由深圳返回香港的71歲肺炎患者鼻炎抽吸物中發(fā)現(xiàn)的，因香港大學(xué)率先發(fā)現(xiàn)故命名為HKU1型。時(shí)間分布上，HKU1-CoV感染無(wú)明顯季節(jié)性特征，呈四季散發(fā)狀態(tài)。資料顯示，不同地區(qū)HKU1-CoV檢出率有所差異[8-12]。如日本報(bào)道HKU1-CoV陽(yáng)性率為1.9%，美國(guó)HKU1-CoV陽(yáng)性率為0.5%，韓國(guó)HKU1-CoV陽(yáng)性率為2.5%，馬來(lái)西亞HKU1-CoV陽(yáng)性率為1.1%，肯尼亞為2.1%。我國(guó)不同時(shí)期該冠狀病毒流行狀況不一。2005-10至2006-01我國(guó)湖南資料的檢出率約為0.77%[13]，但2008-2010年北京地區(qū)檢出率約為17.9%[14]?？梢?jiàn)，HKU1型冠狀病毒在我國(guó)的流行風(fēng)險(xiǎn)較高，需要研究進(jìn)一步關(guān)注。

兒童普遍易感，多與其他病原存在共同感染。研究發(fā)現(xiàn)HKU1-CoV與上呼吸道感染及社區(qū)獲得性肺炎相關(guān)，對(duì)兒童影響較大，其他人群易感性無(wú)明顯差異[15]。同時(shí)，該病原可能造成兒童人群更加嚴(yán)重的臨床癥狀。Lau等[16]研究了625例6個(gè)月至5歲的呼吸道病毒感染住院患兒熱性癲癇發(fā)作情況, 發(fā)現(xiàn)HKU1-CoV感染患兒熱性癲癇發(fā)生率為50%, 明顯高于NL63型冠狀病毒、229E型冠狀病毒、OC43型冠狀病毒、流感病毒A、B，腺病毒等12種呼吸道病毒﹙為0 ～ 33%﹚。雖然HKU1-CoV是通過(guò)呼吸道標(biāo)本發(fā)現(xiàn)，但是該病原也可引起消化道癥狀。如，法國(guó)學(xué)者Vabret等[17]發(fā)現(xiàn), 6 例HKU1-COV陽(yáng)性患者中, 3例出現(xiàn)發(fā)熱、嘔吐、腹瀉及上呼吸道癥狀, 且以胃腸道不適為主訴入院, 并在其中2例患者的糞便發(fā)現(xiàn)該病毒。

2 HKU1-CoV 纖突蛋白

HKU1-CoV基因組全長(zhǎng)29926bp(genBank: AGW27872.1)，為無(wú)節(jié)段單股正鏈RNA。HKU1-CoV纖突蛋白(spike protein，S protein)由1356個(gè)氨基酸殘基組成，是一種典型的I型病毒膜融合蛋白，具有抗原性，位于病毒表面，能介導(dǎo)病毒與宿主受體的結(jié)合，在病毒黏附和進(jìn)入宿主細(xì)胞過(guò)程中起到重要作用，是影響冠狀病毒侵襲力最重要因素之一[18,19]。有研究表明冠狀病毒跨物種傳播也是通過(guò)S蛋白變異實(shí)現(xiàn)的[20]。已發(fā)表的冠狀病毒S蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)相吻合，即從N端到C端可分為S1段、斷裂區(qū)段、S2段、跨膜區(qū)段、包內(nèi)區(qū)段等部分[21]。S蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)呈“柄-球”樣結(jié)構(gòu)，S1段主要構(gòu)成S蛋白的球形部分，S2段主要構(gòu)成S蛋白柄狀結(jié)構(gòu)部分。HKU1 S蛋白自N端至C端可分為S1段(14-757aa)、斷裂區(qū)段(758-900aa)、S2段(901-1356aa)。HKU1-CoV S1亞結(jié)構(gòu)有兩個(gè)獨(dú)立結(jié)構(gòu)域，分別是N端結(jié)構(gòu)域(N-terminal domain，S1-NTD，14-297aa)和C端結(jié)構(gòu)域(C-terminal domain，S1-CTD，325-605aa)[22]。雖然HKU1 S蛋白結(jié)構(gòu)與其他冠狀病毒相似，但是HKU1 S蛋白是否具有與其他冠狀病毒S蛋白相似的作用尚需進(jìn)一步研究。S2上存在的HR1(heptad repeat 1，HR1)、HR2(heptad repeat 2，HR2)，這個(gè)區(qū)域的特點(diǎn)會(huì)在病毒入侵宿主細(xì)胞中起到重要作用。

冠狀病毒S1是冠狀病毒與宿主細(xì)胞受體作用的關(guān)鍵部位，也是冠狀病毒S蛋白研究的重點(diǎn)之一。目前研究發(fā)現(xiàn)冠狀病毒S蛋白與宿主作用的區(qū)域大致可以分為兩個(gè)區(qū)域：核心(Core)和延伸環(huán)(Extend Loop)兩個(gè)亞結(jié)構(gòu)域。核心區(qū)較為保守，由反向平行的β片層和短的鏈接α螺旋組成，起到支撐延伸環(huán)區(qū)結(jié)構(gòu)的作用。延伸環(huán)處于核心區(qū)外圍，由Loop結(jié)構(gòu)為邊和β片層為底的凹型結(jié)構(gòu)，具有較好的柔性；延伸環(huán)區(qū)域含有病毒與宿主受體結(jié)合的受體結(jié)合域(receptor-binding domain，RBD)，能夠單獨(dú)或共同作與宿主受體結(jié)合。RBD內(nèi)含有與宿主受體特異性識(shí)別的Motif(receptor-binding motif，RBM)，是病毒與宿主細(xì)胞受體作用的關(guān)鍵部位[21]。目前研究發(fā)現(xiàn)HKU1-CoV S1結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與其他冠狀病毒S蛋白研究結(jié)果一致。Kirchdoerfer等[22]利用電鏡三維重構(gòu)方法獲得了HKU1-CoV纖突蛋白晶體結(jié)構(gòu)，本課題組也使用同源建模方法獲得了HKU1-CoV S1-NTD、CTD模型，與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)構(gòu)比對(duì)RMSD均小于2 ?。蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)顯示HKU1-CoV S1-NTD和S1-CTD含有核心和延伸環(huán)兩個(gè)亞結(jié)構(gòu)域，見(jiàn)圖1。HKU1-CoV S1-NTD核心區(qū)由6組兩兩反向平行的β片層構(gòu)成，空間結(jié)構(gòu)顯示上3對(duì)與下3對(duì)平行；Loop區(qū)較長(zhǎng)且較雜亂，主要有單個(gè)的α螺旋和β片層及非特殊構(gòu)象殘基連接而成，包繞在核心區(qū)外圍，見(jiàn)圖1(A)；HKU1-CoV S1-CTD核心區(qū)由2對(duì)兩兩反向平行的β片層構(gòu)成基本結(jié)構(gòu)；Loop區(qū)由一對(duì)反向的β片層和4個(gè)獨(dú)立的α螺旋連接而成，位于核心區(qū)上部，見(jiàn)圖1(B)。雖然HKU1-CoV S蛋白在病毒入侵中的作用機(jī)制并不是清楚，但是這些研究為進(jìn)一步探索HKU1-CoV入侵宿主細(xì)胞提供了很好的參考和指導(dǎo)。

3 HKU1-CoV S蛋白與受體相互作用

3.1 S蛋白受體分類 冠狀病毒的S1通過(guò)RBD與宿主細(xì)胞受體識(shí)別并結(jié)合，導(dǎo)致S2由融合前結(jié)構(gòu)變構(gòu)為融合后結(jié)構(gòu)，變構(gòu)后的S2區(qū)域拉近了病毒膜與細(xì)胞膜空間距離，進(jìn)而促使病毒膜和宿主膜融合。在病毒膜與細(xì)胞膜融合過(guò)程中，冠狀病毒與宿主細(xì)胞受體特異性識(shí)別是所有后續(xù)反應(yīng)的先決步驟，是病毒入侵宿主細(xì)胞的關(guān)鍵，決定了病毒的組織嗜性和侵襲力[23]。

圖1 HKU1-CoV S1結(jié)構(gòu)

冠狀病毒常見(jiàn)受體可分為蛋白類受體和非蛋白類受體，蛋白類受體目前已知的有APN、DPP4、ACE2三種；非蛋白類受體已知唾液酸類和CEACAM1。冠狀病毒與非蛋白類受體往往是非特異性結(jié)合，而與蛋白類受體往往是特異性結(jié)合。冠狀病毒的受體選擇與冠狀病毒S蛋白結(jié)構(gòu)和冠狀病毒傳播過(guò)程中發(fā)生的進(jìn)化、變異有關(guān)[21]。冠狀病毒與非蛋白類受體的非特異性結(jié)合可以保證具有廣泛的宿主范圍，而蛋白類受體的特異性結(jié)合可以使得冠狀病毒具有特定的宿主。不同類冠狀病毒具有不同的受體喜好。目前研究認(rèn)為，α冠狀病毒通常多可與非蛋白類受體相互作用，β冠狀病毒通常與蛋白類受體相互作用(圖2)。

3.2 S蛋白與受體相互作用 S蛋白與受體相互作用的過(guò)程中由于不同部位的S蛋白作用不同，其作用大致分為3個(gè)途徑：(1)S蛋白的S1-NTD與非蛋白類分子結(jié)合。例如MHV通過(guò)S1-NTD與CEACAM1相互作用起到識(shí)別宿主作用。(2)S1-CTD與蛋白類分子結(jié)合，例如SARS-CoV、NL63-CoV通過(guò)S1-CTD上的RBM與ACE2作用起到識(shí)別宿主作用； MERS-CoV通過(guò)S1-CTD與DPP4(CD26)特異性識(shí)別特異性入侵宿主；(3)S1-NTD、S1-CTD協(xié)同作用與細(xì)胞受體結(jié)合而實(shí)現(xiàn)，例如TGEV入侵宿主細(xì)胞時(shí)， S1-NTD可與唾液酸結(jié)合，CTD可與APN相互作用[18,19,23,25,26,27]。與非蛋白類小分子作用的變體通常暴露于宿主細(xì)胞表面，便于病毒獲取并與之相互作用。病毒與蛋白類受體相互作用發(fā)生頻率較低，要求條件較為苛刻，但較病毒-非蛋白類受體具有良好的穩(wěn)定性和特異性。Li等[21]認(rèn)為，冠狀病毒與宿主細(xì)胞受體作用時(shí)，先通過(guò)S1-NTD與非蛋白類受體相互作用拉近病毒-細(xì)胞距離，進(jìn)而通過(guò)S1-CTD與蛋白類受體穩(wěn)定的相互，但這種說(shuō)法的普遍適用性還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

圖2 冠狀病毒S蛋白與細(xì)胞表面受體關(guān)系[27]

HKU1-CoV S1-NTD與Bovine冠狀病毒S1-NTD一級(jí)結(jié)構(gòu)具有較高相似性，具備與糖類非蛋白受體相互作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，故可能與糖類分子相互作用，進(jìn)行非特異性病毒-受體結(jié)合[22]。然而，有研究者認(rèn)為[28]，雖然唾液酸參與了HKU1-CoV與宿主細(xì)胞受體結(jié)合的過(guò)程，但是不同于OC43型冠狀病毒，HKU1-CoV不能與9-O-Acetylated Sialic Acid相互作用。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，去除S1-NTD后，HKU1-CoV仍可以感染宿主細(xì)胞[29]。為此，推測(cè)HKU1-CoV可能將唾液酸作為受體入侵宿主細(xì)胞。作為生物小分子的唾液酸可能就起到媒介作用介導(dǎo)病毒與宿主細(xì)胞受體作用，即病毒與宿主細(xì)胞受體作用通過(guò)近似于“酶作用模型”的原理進(jìn)行。然而，HKU1-CoV與非蛋白類受體可能具有獨(dú)特的入侵途徑。

除了S1-NTD與非蛋白類受體的非特異性結(jié)合外，HKU1-CoV S1-CTD與SARS-CoV、MERS-CoV蛋白一級(jí)序列上具有一定的相似性。然而，三級(jí)結(jié)構(gòu)顯示HKU1-CoV S1-CTD與β冠狀病毒中的SARS-CoV、MERS-CoV S1-CTD在具有一定程度上的相似性，主鏈間RMSD分別為3.19?和2.53?。與SARS、MERS S1-CTD只有Loop存在活性位點(diǎn)不同，HKU1-CoV S1-CTD含有兩個(gè)可能與其他蛋白作用的活性結(jié)構(gòu)域，一個(gè)結(jié)構(gòu)域存在于Loop區(qū)域，被認(rèn)為是與體細(xì)胞受體相互作用的RBD；另一個(gè)是位于核心區(qū)域下方的一段有兩個(gè)α螺旋構(gòu)成的結(jié)合域，可與相鄰HKU1-CoV S1-CTD的Loop結(jié)合[18,22,26,27]。然而，HKU1-CoV S蛋白容易形成三聚體，而這種結(jié)構(gòu)特性往往會(huì)影響了該病毒S蛋白與宿主受體的相互作用[22]。本課題組通過(guò)對(duì)HKU1-CoV S1-CTD結(jié)構(gòu)活性位點(diǎn)預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，該結(jié)構(gòu)位于Loop的活性位點(diǎn)位于Loop的側(cè)面位置，而此區(qū)域在HKU1-CoV S蛋白三聚體結(jié)構(gòu)中并未暴露于表面位置。但是，當(dāng)病毒S蛋白變構(gòu)，變構(gòu)形成的融合結(jié)構(gòu)就可與細(xì)胞受體特異性識(shí)別并結(jié)合?？梢?jiàn)，空間結(jié)構(gòu)的不容易暴露可能影響了HKU1-CoV S蛋白受體的發(fā)現(xiàn)。然而，不管HKU1-CoV S蛋白結(jié)構(gòu)如何，該病毒的S1-CTD是其入侵宿主細(xì)胞的關(guān)鍵亞結(jié)構(gòu)域[29]，其詳細(xì)的入侵機(jī)理尚需進(jìn)一步探索。

總之，HKU1-CoV與宿主細(xì)胞受體作用機(jī)制可能具有一定的獨(dú)特性，也不同于過(guò)去已經(jīng)明確的冠狀病毒-受體作用機(jī)制。鑒于HKU1-CoV病原意義的重要性，探索病毒入侵、跨物種傳播的機(jī)制將為疾病防控、疫苗開(kāi)發(fā)等工作提供依據(jù)。