微生態(tài)制劑對(duì)烤煙連作土壤酶活性及其產(chǎn)量的影響

李 倩，張常興，程玉淵，劉 園，牛莉莉

(河南省煙草公司 南陽市公司，河南 南陽 473000)

土壤微生態(tài)制劑是一類以有益微生物為核心的生物制品，其中的功能微生物可通過分泌土壤酶、參與有機(jī)質(zhì)降解和驅(qū)動(dòng)養(yǎng)分循環(huán)等方式，改善土壤的理化及生物學(xué)性質(zhì)，并通過競(jìng)爭(zhēng)、拮抗、寄生及溶菌等作用抑制有害病原菌的侵染和繁殖，降低病害發(fā)生率，進(jìn)而提升作物產(chǎn)量和品質(zhì)[1-2]。盆栽試驗(yàn)顯示，長(zhǎng)期連作黃瓜土壤施用復(fù)合微生態(tài)制劑，土壤脲酶、蔗糖酶和中性磷酸酶活性均顯著增強(qiáng)，黃瓜黃萎病的發(fā)生率明顯下降，土壤質(zhì)量得到有效改善[3]。大田條件下含有EM菌(Effective Microorganisms)的微生態(tài)制劑可顯著提高連作地西洋參根際微生物數(shù)量，及脲酶和多酚氧化酶的活性，抑制土傳病害的發(fā)生，改良土壤環(huán)境，實(shí)現(xiàn)提質(zhì)增產(chǎn)[4]。河南省是我國(guó)的烤煙主產(chǎn)區(qū)之一，植煙歷史悠久，連作現(xiàn)象普遍，土壤遭受嚴(yán)重破壞，如理化及生物學(xué)性質(zhì)惡化、真菌性病害加重和生產(chǎn)力下降等諸多問題，造成煙葉產(chǎn)質(zhì)量下降，嚴(yán)重阻礙了產(chǎn)區(qū)的可持續(xù)發(fā)展，亟需改良土壤，實(shí)現(xiàn)烤煙提質(zhì)增產(chǎn)。木霉菌具有廣譜抑菌性，可通過寄生或拮抗作用殺滅29種病原真菌的生長(zhǎng)[5-7]；芽孢桿菌通過快速定殖作用，能顯著干擾煙草黑脛病、根黑腐病及小麥全蝕病等病原菌的生長(zhǎng)[8-11]；放線菌能夠分泌鏈霉素和多效霉素等多種抗生素，干擾病原真菌的代謝[12]。且這些微生物在生長(zhǎng)過程中還能分泌多種有機(jī)酸、氫離子和植物內(nèi)源生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑等，活化土壤養(yǎng)分，促進(jìn)作物生長(zhǎng)。目前，微生態(tài)制劑在烤煙栽培上的應(yīng)用鮮見報(bào)道，且微生物對(duì)地域環(huán)境具有選擇性，篩選適宜當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)環(huán)境的微生態(tài)制劑具有重要意義。為此，試驗(yàn)選擇放線菌、促生芽孢桿菌和木霉菌3種主要成分的土壤微生態(tài)制劑，研究其對(duì)連作煙田土壤酶活性、根際微生物活性及其病害發(fā)生與產(chǎn)量與經(jīng)濟(jì)性狀的影響，旨在篩選出適于豫西南煙區(qū)土壤改良的微生態(tài)制劑，為其在生產(chǎn)上的推廣應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 烤煙品種 為生產(chǎn)上的主栽品種云煙87。

1.1.2 微生態(tài)制劑 微生態(tài)制劑A(放線菌及多價(jià)陰離子活性物質(zhì)復(fù)配，有效活菌數(shù)≥2.0×108cfu/g)、微生態(tài)制劑B(以防病促生芽孢桿菌為主的復(fù)合微生物菌劑，有效活菌數(shù)≥3.0×108cfu/g)和微生態(tài)制劑C(木霉菌為主的有益微生物及其次生代謝產(chǎn)物復(fù)合而成，有效活菌數(shù)≥2.5×108cfu/g)，均由西南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院提供。

1.1.3 根際土樣 根際土樣共計(jì)3份，每份由5個(gè)根際土樣混合而成。

1.1.4 培養(yǎng)基 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、馬丁氏培養(yǎng)基、高氏一號(hào)培養(yǎng)基、Ashby無氮培養(yǎng)基、磷酸鈣+植酸培養(yǎng)基和鋁土礦培養(yǎng)基。

1.1.5 儀器 SRS-SD1000便攜式土壤呼吸分析儀，英國(guó)ADC公司生產(chǎn)。

1.2 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)地位于河南省鄧州市九龍鎮(zhèn)煙葉特色基地單元，坐標(biāo)為東經(jīng)111°50，北緯32°45′，海拔153 m，年均氣溫13.5℃，年均降雨量724 mm，年均日照時(shí)數(shù)1 935 h，平均無霜期229 d。供試土壤為當(dāng)?shù)氐湫?、保水保肥性能?qiáng)的潮土，采用烤煙-玉米種植制度，已連續(xù)種植烤煙3 a，田塊土壤板結(jié)嚴(yán)重，根莖類病害多發(fā)。土壤基礎(chǔ)理化性質(zhì)：pH 6.19，有機(jī)質(zhì)16.22 g/kg，全氮0.63 g/kg，全磷0.21 g/kg，全鉀9.51 g/kg，堿解氮94.02 mg/kg，速效磷13.34 mg/kg，有效鉀196.6 mg/kg。

1.3 方法

1.3.1 土樣采集 清除表層2 cm雜物，按“S”形取樣法隨機(jī)選取長(zhǎng)勢(shì)一致的15株煙苗，采用抖根法獲得根際土壤，即將煙株連根拔起，抖掉根外圍土壤至50 g左右，收集剩余土壤，每5個(gè)土樣混合為1份樣品，共計(jì)3份樣品，自封袋封裝、標(biāo)記后置于冰盒中冷藏，迅速帶回實(shí)驗(yàn)室備測(cè)相關(guān)指標(biāo)。

1.3.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)共設(shè)4個(gè)處理。對(duì)照(CK)，不施用微生態(tài)制劑；T1，施用微生態(tài)制劑A；T2，施用微生態(tài)制劑B；T3，施用微生態(tài)制劑C。4次重復(fù)，小區(qū)面積100 m2(10 m×10 m)，行距1.2 m，株距55 cm，隨機(jī)區(qū)組排列。微生態(tài)制劑結(jié)合常規(guī)施肥施入，常規(guī)施肥：煙草專用復(fù)合肥450 kg/hm2(N∶P2O5∶K2O為10∶10∶20)，芝麻餅肥500 kg/hm2，硫酸鉀375 kg/hm2，硝酸鉀45 kg/hm2。其中，70%的鉀肥作基肥，30%的鉀肥在團(tuán)棵期追施，各土壤微生態(tài)制劑按30 kg/hm2用量，隨復(fù)合肥和芝麻餅肥全部作基肥施用?？緹熡?017年4月20日移栽，其生長(zhǎng)期不使用化學(xué)殺菌劑，其他操作均按照當(dāng)?shù)貎?yōu)質(zhì)烤煙生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。

1.4 指標(biāo)測(cè)定

1.4.1 土壤呼吸強(qiáng)度 根際土壤呼吸強(qiáng)度采用土壤呼吸分析儀測(cè)定。

1.4.2 根際土壤可培養(yǎng)微生物數(shù)的數(shù)量 取部分新鮮土樣，采用稀釋平板涂布法測(cè)定土壤可培養(yǎng)細(xì)菌(牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基)、真菌(馬丁氏培養(yǎng)基)、放線菌(高氏一號(hào)培養(yǎng)基)、自生固氮菌(Ashby無氮培養(yǎng)基)、磷細(xì)菌(磷酸鈣+植酸培養(yǎng)基)和鉀細(xì)菌(鋁土礦培養(yǎng)基)數(shù)目[13]；采用氯仿熏蒸法-0.5 mol/L K2SO4提取法測(cè)定土壤微生物量碳和微生物量氮，采用K2Cr2O7氧化法測(cè)定浸提液中的微生物量碳(MBC)，采用凱氏定氮法測(cè)定微生物生物量氮(MBN)[14]。

另取部分風(fēng)干土樣，采用3,5-二硝基水楊酸比色法測(cè)定土壤蔗糖酶活性〔以24 h 后1 g 土壤中生成的葡萄糖(glucose)的mg數(shù)表示〕，采用苯酚鈉-次氯酸鈉顯色法測(cè)定脲酶活性〔以24 h 后1g 土中生成NH4+-N的mg數(shù)表示〕，采用TTC 比色法測(cè)定脫氫酶活性〔以24 h 后1 g 土中TPF(三苯基甲月替)的mg數(shù)表示〕，采用高錳酸鉀滴定法測(cè)定過氧化氫酶活性(以每h內(nèi)1 g 土消耗0.1mol/L KMnO4的mL數(shù)表示)[15]。

1.4.3 土壤微生物代謝熵 土壤微生物代謝熵(qCO2)為土壤微生物基礎(chǔ)呼吸與微生物量碳的比值。

qCO2=土壤微生物基礎(chǔ)呼吸/微生物量碳[16]。

1.5 烤煙主要病害的發(fā)生情況

參照煙草病蟲害分級(jí)及調(diào)查方法[17]，在煙株打頂期(移栽后60 d)調(diào)查各處理煙株主要病害的發(fā)生情況，并計(jì)算烤煙發(fā)病率和病情指數(shù)。

發(fā)病率=(發(fā)病煙株數(shù))/(調(diào)查總煙株數(shù))×100%。

病情指數(shù)=100×Σ(各級(jí)病葉數(shù)×各級(jí)代表值)/(調(diào)查總?cè)~數(shù)×最高級(jí)代表值)。

1.6 烤煙的產(chǎn)量及產(chǎn)值

煙葉烘烤后參照GB2635-1992《烤煙》對(duì)各處理煙葉進(jìn)行分級(jí)、稱重，按照2017年當(dāng)?shù)責(zé)熑~收購(gòu)價(jià)格，計(jì)算烤煙產(chǎn)量、產(chǎn)值和中上等煙比例。

1.7 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2007 處理數(shù)據(jù)，SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，Origin 8.5 作圖，Duncan's新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，不同處理間差異性顯著性水平為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 根際土壤酶活性

從表1可見，微生態(tài)制劑能顯著提高根際土壤脫氫酶、脲酶和蔗糖酶的活性，但增幅因土壤酶的種類不同而異。其中，脫氫酶和脲酶的活性為T2>T1>T3>CK。T2蔗糖酶活性最高，達(dá)31.30 mg glucose/(g·d)，與其余處理間差異顯著(P<0.05)；T1次之，為25.72 mg glucose/(g·d)，T1與T3間差異不顯著；CK最低，僅14.94 mg/(g·d)。此外，與CK相比，3種微生態(tài)制劑對(duì)連作煙田土壤過氧化氫酶活性均無顯著影響。

2.2 根際土壤的微生物數(shù)量

從表2可知，煙田施用微生態(tài)制劑后，烤煙根際土壤中的可培養(yǎng)細(xì)菌、放線菌、自生固氮菌、無機(jī)磷細(xì)菌和鉀細(xì)菌數(shù)量顯著增加，但真菌的數(shù)量變化則相反。與CK相比，T2的細(xì)菌、放線菌、自生固氮菌、無機(jī)磷細(xì)菌和鉀細(xì)菌數(shù)量增幅最大，分別增加0.62倍、2.00倍、1.52倍、1.63倍和0.84倍，T1次之，T3最低；就真菌數(shù)量而言，T1、T2和T3烤煙根際土壤真菌分別較CK下降40.36%、58.38%和24.37%。

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。
Note: Different lowercase letters in the same column indicate significance of difference atP< 0.05 level.The same below.

表2 不同處理土壤微生物的數(shù)量變化Table 2 Effect of different treatment on soil microorganism quantity cfu/g DW

2.3 根際土壤微生物的活性

從圖1看出，T2的微生物量碳和呼吸強(qiáng)度(CO2)最高，分別為271.56 mg/kg和3.29 μg CO2/(g·h)，不同處理間依次為T2>T1>T3>CK(P<0.05)。不同微生態(tài)制劑處理微生物量氮均顯著高于CK，但T1和T2差異不顯著。T1和T3的微生物代謝熵均與CK 相比無顯著差異，而T2則顯著低于CK。說明，煙株根際土壤環(huán)境得到改善，微生物的生長(zhǎng)與代謝活動(dòng)增強(qiáng)。

注：不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。Note: Different lowercase letters indicate significance of difference at P<0.05 level.圖 1 不同處理根際土壤微生物的活性Fig.1 Microbial activity in rhizosphere soils under different treatments

2.4 烤煙主要病害的發(fā)病率

從表3可知，T1和T2煙株黑脛病的發(fā)病率和病情指數(shù)均較CK顯著下降，分別降低54.59%和65.19%，但二者間差異不顯著(P<0.05)；T3煙株發(fā)病率較CK降低21.65%，但病情指數(shù)無顯著變化。此外，連作煙田增施3種土壤微生態(tài)制劑后，煙株根黑腐病的發(fā)病率和病情指數(shù)均顯著低于CK，T2降幅最大，分別下降44.41%和55.97%。說明在黑脛病和根黑腐病頻發(fā)的煙田中，增施3種微生態(tài)制劑可防治烤煙主要病害的發(fā)生。

表3 不同處理烤煙主要病害的發(fā)病率Table 3 Incidence rate of main diseases in tobacco under different treatments

2.5 煙葉經(jīng)濟(jì)性狀

從表4可知，施用土壤微生態(tài)制劑可顯著提高烤煙的產(chǎn)量、產(chǎn)值和中上等煙比例，不同處理依次為T2>T1>T3>CK(P<0.05)。產(chǎn)量、產(chǎn)值和中上等煙比例，T1較CK分別提高33.97%、35.62%和25.38%，T2較CK分別提高25.44%、35.62%和18.46%，T3較CK分別提高15.05%、17.60%和9.19%。說明連作煙田施用微生態(tài)制劑，煙株根系對(duì)養(yǎng)分的吸收量增加，最終實(shí)現(xiàn)煙葉提質(zhì)增產(chǎn)的目的。

表4 不同處理煙葉的產(chǎn)質(zhì)量及中上等煙比例Table 4 Economic traits of tobacco leaves under different treatments

3 結(jié)論與討論

土壤酶主要由土壤中的微生物、植株根系及其殘?bào)w分泌，其參與土壤多種化學(xué)反應(yīng)，驅(qū)動(dòng)土壤新陳代謝，其活性的大小可動(dòng)態(tài)指示土壤的健康程度[18]。麻耀華等[3]研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)合微生態(tài)制劑可使黃瓜根際土壤脲酶、蔗糖酶和中性磷酸酶的活性分別提高130.8%、190.5%和123.5%，土壤質(zhì)量得到有效改良。任旭琴等[19]研究報(bào)道，在淮安紅椒連作10年土壤中施用枯草芽孢桿菌制劑，可顯著提高根際土壤脫氫酶、脲酶和堿性磷酸酶的活性，有效緩解連作障礙。研究結(jié)果表明，增施微生態(tài)制劑后連作煙田煙株根際土壤脫氫酶、脲酶和酸性磷酸酶的活性顯著增強(qiáng)，表明煙田土壤質(zhì)量提高。大量研究表明，土壤微生物的數(shù)量與脫氫酶和脲酶的活性呈顯著正相關(guān)，即微生物數(shù)量越多，單位時(shí)間內(nèi)分泌的酶量越多，酶活性越強(qiáng)[20-21]。研究結(jié)果表明，煙田增施以防病促生芽孢桿菌為主要成分的微生態(tài)制劑(T2)后，土壤微生物數(shù)量最多(真菌除外)?？赡苁敲摎涿浮㈦迕负驼崽敲?種土壤關(guān)鍵酶活性均顯著高于其余2個(gè)處理(T1和T3)的主要原因之一，也可能是促生芽孢桿菌分泌胞外酶及次級(jí)代謝產(chǎn)物的能力強(qiáng)于放線菌和木霉菌等[22-25]，致使土壤酶含量增加。微生物量碳(MBC)和微生物量氮(MBN)可以指示土壤C和N的轉(zhuǎn)化和貯存能力，直接反映作物生態(tài)體系的優(yōu)劣。一定程度上，其值越大，代表土壤健康度越高[26-27]。微生物代謝熵(qCO2)是土壤基礎(chǔ)呼吸強(qiáng)度與微生物量碳的比值，反映土壤微生物對(duì)碳源的利用效率。代謝熵越小，微生物呼吸消耗的碳源就越少，用于構(gòu)造生物體的碳源越多，碳源的利用效率升高[17]。優(yōu)質(zhì)適宜的土壤環(huán)境可增強(qiáng)微生物代謝活動(dòng)，呼吸強(qiáng)度增加，代謝熵降低，碳源利用率提高[28-29]。煙田增施微生態(tài)制劑后，根際土壤微生物量碳氮增加，呼吸強(qiáng)度提高，但代謝熵卻有所下降。說明，微生態(tài)制劑可改善根際微生物的生長(zhǎng)環(huán)境，促進(jìn)根際微生物的能量代謝，提高碳源的利用率，細(xì)胞的構(gòu)建速度加快，這是根際土壤細(xì)菌、放線菌、自生固氮菌、無機(jī)磷細(xì)菌和鉀細(xì)菌數(shù)量增加的主要原因之一。

烤煙長(zhǎng)期連作，極易產(chǎn)生土壤有害真菌優(yōu)勢(shì)種群，提高土壤真菌病害的發(fā)生率[30]，造成烤煙嚴(yán)重減產(chǎn)，部分地塊甚至絕收。研究結(jié)果表明，增施含放線菌、促生芽孢桿菌和木霉菌的微生態(tài)制劑后，土壤真菌數(shù)量、黑脛病及根黑腐病的發(fā)病率和病情指數(shù)均顯著下降，煙葉產(chǎn)量、產(chǎn)值和中上等煙比例明顯提高，與高峰等[31-32]的研究結(jié)果一致。說明，在黑脛病和根黑腐病高發(fā)的煙田可增施3種微生態(tài)制劑防治其病害的發(fā)生，降低病害損失率。此外，微生態(tài)制劑的防病效果因其所含微生物的種類不同而異。綜合來看，以促生芽孢桿菌為主的微生態(tài)制劑對(duì)煙田的改良效果最優(yōu)，煙株黑脛病和根黑腐病的發(fā)病率最低，產(chǎn)量、產(chǎn)值和中上等煙比例最高。有研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)芽孢桿菌在生長(zhǎng)過程中，可通過分泌多種胞外酶、有機(jī)酸和氫離子等代謝產(chǎn)物，發(fā)揮促生、防病、抑菌和除臭等功效外[10,33]，一些芽孢桿菌還具有很強(qiáng)的定殖能力，其孢子不僅對(duì)非生物脅迫具有抗逆性，對(duì)于土著微生物群落也具有生物脅迫性，極易在土壤中形成優(yōu)勢(shì)種群[34-35]，試驗(yàn)中的促生芽孢桿菌也可能具備上述特性，其能夠快速在連作煙田中形成優(yōu)勢(shì)種群，大量分泌次級(jí)代謝產(chǎn)物，殺滅或抑制土壤中的病原真菌，降低煙株的發(fā)病率；同時(shí)釋放多種酶、有機(jī)酸和氫離子活化土壤養(yǎng)分，促進(jìn)煙株對(duì)養(yǎng)分的吸收，進(jìn)而提高烤煙的產(chǎn)質(zhì)量。

綜上所述，微生態(tài)制劑能顯著提高連作煙田土壤酶及根際微生物的數(shù)量與活性，減少真菌數(shù)量，降低煙株黑脛病和根黑腐病的發(fā)病率和病情指數(shù)，提高煙葉的產(chǎn)量、產(chǎn)值及中上等煙比例，但改良效果因其含有的微生物種類不同而異，以含促生芽孢桿菌的微生態(tài)制劑改良效果最優(yōu)。因此，在烤煙栽培過程中，可通過增施含促生芽孢桿菌的微生態(tài)制劑改善連作煙田，降低真菌性病害發(fā)生率，提高烤煙的產(chǎn)質(zhì)量。