對1例雞安卡拉病的診斷及病原分離鑒定研究

王 亮，韓 楠

（1.河南省鶴壁市動物衛(wèi)生監(jiān)督所，河南 鶴壁 458000；2.河南省鶴壁市畜產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測檢驗中心，河南 鶴壁 458000）

1 發(fā)病情況

2018年5月，河南省鶴壁市某養(yǎng)雞場飼養(yǎng)的商品肉雞20日齡突然以體溫升高，雞糞呈黃綠相間，形狀稀薄，含有尿酸鹽沉積。毛發(fā)松亂，出現(xiàn)嗜睡、沉郁、蹲伏等為特征的疾病，全群發(fā)病率達30%。

2 臨床診斷

經(jīng)過初步臨床診斷，對病死雞進行解剖，發(fā)現(xiàn)病死雞氣管、喉頭黏膜輕微出血，心包腔內(nèi)存在大量淡黃色積液，積液中存在膠凍樣物質(zhì)，個別黃色液體多達10ml。病死雞普遍出現(xiàn)肝臟色暗、充血、破裂、腫大等情況，病死雞心臟腫大，心肌松弛，肺部出現(xiàn)水腫、淤血等問題，部分腎臟蒼白、腫脹，病情嚴重的病死雞出現(xiàn)尿酸鹽沉積現(xiàn)象。結(jié)合臨床癥狀和剖檢結(jié)果，初步推斷為腺病毒感染，為加強防控需要進一步對病原進行分離鑒定。

3 實驗室檢驗

3.1 分離條件

將該養(yǎng)雞場病雞送檢后，采用實驗室自制大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，PCR相關(guān)試劑和連接載體pMD-19T simple對病料進行分離鑒定。操作過程中，需要將禽腺病毒hexon基因參考序列合成設(shè)計為特異性引物，約擴增1204bp目的片段。對病雞心臟、肝臟等器官組織進行采集后，利用10%福爾馬林溶液進行固定，然后進行常規(guī)石蠟切片，完成H.E染色，可以在顯微鏡下進行病理學(xué)觀察。

3.2 鑒定方法

實際進行病原鑒定時，采用PCR鑒定方法，體系為25μl體系。模板0.5μl，用滅菌ddH2O補足至25μl，上、下引物各1.5μl，10X PCR Buffer 2.5μl，dNTP 2μl，鎂離子2μl。在PCR反應(yīng)過程中，預(yù)變性溫度設(shè)定為94℃，時間為3min；變性溫度設(shè)定為94℃，時間為30s；退火溫度設(shè)定為56℃，時間為40s；延伸溫度設(shè)定為72℃，時間為1min，進行30個循環(huán)；終末延伸溫度設(shè)定為72℃，時間為10min。在電泳檢測中，采用1%瓊脂糖凝膠。針對目的條帶切膠，需要進行回收，連接pMD-19T simple載體，體系為目的片段2.5μl，solution I 2.5μl，T載體0.3μl，在16℃水浴條件下過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為DH5α后，可以采用特異性引物進行鑒定，對得到的陽性菌液進行測序處理。

3.3 鑒定結(jié)果

從鑒定結(jié)果來看，采用特異性引物從病雞肝臟組織中可以提取得到DNA，通過PCR鑒定發(fā)現(xiàn)約在1204bp位置出現(xiàn)特異性條帶，符合設(shè)計引物特異性條帶大小。從測序結(jié)果來看，擴增得到的基因大小為1204bp，符合預(yù)期情況。采用生物信息學(xué)軟件進行基因序列分析，禽腺病毒特定抗原劃分為I群、II群和III群，II群主要引起血性腸炎，III型主要引起產(chǎn)蛋下降綜合征，不符合臨床診斷結(jié)果，所以需要對I群進行分析。在I群禽腺病毒中，群抗原相同，包含傳統(tǒng)禽腺病毒和其他禽類分離物，共包含12個血清型，擁有不同血清型或毒株，具有不同的引發(fā)疾病和致死能力，作為原發(fā)病病原的作用尚不清楚，因此需要進一步分析和鑒定。通過與基因庫中FAV I群各種株病毒進行序列比對，同時進行遺傳分析，確定分離株序列與禽腺病毒I群4型的同源性最高，超出了99%，能夠達到99.2%。相比較而言，與其它血清型的相似性較低。在遺傳進化分析中，發(fā)現(xiàn)分離株與禽腺病毒I群4型擁有最小的遺傳距離，距離其它型則較遠，因此可以確定病原屬于禽腺病毒4型，屬于將會引起雞安卡拉病的特異性病原。

4 防治措施

在疫情緊急情況下，需要用組織滅活苗進行緊急接種。在防治方面，應(yīng)當遵循“護肝保腎，利水消腫”原則，使雞群死亡率得到有效降低。針對雞群，需要按照每200只雞一瓶量在飼料中加入肌苷片，采取集中拌料方式，通過控料保證在3～4h內(nèi)吃完。連用5d，能夠使雞肝臟功能得到提高。在飲水中，需要按每400只雞250g葡萄糖進行飼喂，保證2h內(nèi)飲完，連用5d。每500只雞一瓶小分子多肽，連用4d。此外，需要加強綜合衛(wèi)生管理，重點做好種雞場腺病毒防控，商品肉雞進行新腺流免疫，日常加強環(huán)境消毒，適當降低飼養(yǎng)密度，加強雞舍通風(fēng)管理，使雞群機體免疫力得到提高。

5 小結(jié)

經(jīng)過及時有效的臨床診斷和病原分離鑒定，本次治療取得了明顯效果，在第5d后雞群死亡率恢復(fù)正常，采料量得到了明顯改善。由此可見，在初步診斷雞安卡拉病基礎(chǔ)上，采用PCR技術(shù)及時進行病原分離鑒定，能夠提出有效治療方案，使疾病得到有效防控，繼而為雞養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展提供保障。