蒙古黃芪根系分泌物的化感自毒效應(yīng)研究

，，

(甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 土壤肥料與節(jié)水農(nóng)業(yè)研究所，甘肅 蘭州 730070)

0 引 言

蒙古黃芪(AstragalusmembranaceusBge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao)為豆科黃芪屬多年生植物，根入藥，性微溫，味甘，是我國中醫(yī)常用的滋補藥材[1]。由于社會對黃芪需求量的不斷增加，使黃芪的輪作周期縮短，重茬和迎茬面積增加，黃芪的連作障礙現(xiàn)象日益突出，病害越來越嚴(yán)重，產(chǎn)量開始逐年銳減[2]。國內(nèi)外的研究表明，造成連作障礙的原因主要有土壤理化性質(zhì)惡化、土壤生物學(xué)環(huán)境惡化以及自毒作用等[3-5]。有學(xué)者從蠶豆、大蒜及地黃等作物的根系分泌物中分離出化感自毒物質(zhì)，并發(fā)現(xiàn)根系分泌物的逐年累積將會對作物生長產(chǎn)生越來越大的影響[6-8]。自毒作用是由植物莖、葉及凋落物的淋溶、植株殘體的腐解以及根系分泌物等釋放出的物質(zhì)，對同茬或下茬同種植物的生長和發(fā)育產(chǎn)生抑制作用[9]。由于幼苗期的植物通常比較脆弱，容易受到自毒物質(zhì)的影響，所以植物的自毒作用一般發(fā)生在幼苗階段[10]。相對于普通作物，藥用植物自毒作用更強[11]。已有學(xué)者對三七、人參、地黃、蒼耳及當(dāng)歸等藥用植物的化感自毒作用進行了研究[12-15]，但關(guān)于黃芪根系分泌物對其種子和幼苗的自毒作用報道較少。因此，本研究采用水培法收集蒙古黃芪根系分泌物，盡可能排除外界環(huán)境的干擾，研究蒙古黃芪根系分泌物對其種子萌發(fā)和幼苗生長的自毒效應(yīng)，以期揭示根系分泌物在蒙古黃芪連作障礙中的作用機制，并為蒙古黃芪的科學(xué)種植及可持續(xù)發(fā)展提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

蒙古黃芪種子2016年10月購自隴西縣中藥材市場，為健康、飽滿、無病蟲害、無霉變當(dāng)年產(chǎn)的蒙古黃芪種子。

1.2 試驗方法

1.2.1 采用水培法收集黃芪的根系分泌物。選取大小均勻、飽滿、無蟲子的種子，用濃硫酸浸泡5 min，取出種子并用蒸餾水沖洗干凈，將蒙古黃芪種子播于含有石英砂(高溫高壓滅菌，70 ℃烘干)的育苗盤，待蒙古黃芪根長到8～10 cm時，拔出蒙古黃芪幼苗。拔苗前向育苗盤中加入過量蒸餾水，使基質(zhì)濕潤，盡可能不要弄傷幼苗根系。將拔出的幼苗用蒸餾水洗干凈，定植于均勻打孔的泡沫板上，移入蒙古黃芪水培培養(yǎng)箱(高20 cm，長30 cm，寬20 cm)。培養(yǎng)箱中加入1L改良Hoagland 營養(yǎng)液[16]，將蒙古黃芪幼苗懸浮于營養(yǎng)液上進行培養(yǎng)。每個培養(yǎng)箱種植蒙古黃芪25株，共種植8箱。每5 d更換一次營養(yǎng)液，每天通氣和光照12 h(7:30-19:30)。移栽30 d 后，開始收集蒙古黃芪根系分泌物，具體收集方法為[17]：光照3 h后，將每個培養(yǎng)箱中的蒙古黃芪植株取出，用去離子水將根系沖洗5次，盡量不要傷到根。洗完后將蒙古黃芪移入裝有1L 去離子水的水培培養(yǎng)箱中，收集分泌物12 h。用遮光布將水培培養(yǎng)箱的四周包裹，保證蒙古黃芪根部處于避光條件。將收集的根系分泌物合并后過0.45 μm的微孔濾膜(采購自上海新亞凈化器件廠)，濾液在50 ℃條件下真空濃縮至50 mL，得到200株蒙古黃芪根系分泌物的濃縮液，即每0.4 mL蒙古黃芪根系分泌物濃縮液相當(dāng)于單株蒙古黃芪12 h的根系分泌量。隔3 d收集濃縮一次根系分泌物，共收集4次，最后共得到200 mL蒙古黃芪根系分泌物濃縮液，貯于-20 ℃冰箱備用。

1.2.2 根系分泌物對種子萌發(fā)的化感自毒效應(yīng)測定。以不同濃度蒙古黃芪根系分泌物溶液對其種子進行處理，共設(shè)對照(CK)無提取液、提取液稀釋0.8倍、提取液稀釋0.6倍、提取液稀釋0.4倍、提取液稀釋0.2倍和提取液未稀釋6個處理。取5 mL不同濃度的根系分泌物溶液加入鋪有2 層定性濾紙的培養(yǎng)皿中進行種子發(fā)芽試驗，每皿放大小均勻的蒙古黃芪種子20粒，每個處理放5皿，共100粒種子。將放好種子的培養(yǎng)皿移入到30 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察并記錄發(fā)芽數(shù)，補充1 mL蒸餾水。發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)在種子培養(yǎng)第7 d時統(tǒng)計，發(fā)芽率在種子培養(yǎng)第14 d時統(tǒng)計，種子芽長是種子長度的一半為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)。計算公式如下[18]。

發(fā)芽率(%)=(發(fā)芽14 d后正常發(fā)芽的種子數(shù)/供試種子數(shù))×100%

(1)

發(fā)芽勢(%)=(7 d內(nèi)發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù))×100%

(2)

發(fā)芽指數(shù)=Σ(Gt/Dt)

(3)

式中：Gt為培養(yǎng)第t天的發(fā)芽種子數(shù)；Dt為相應(yīng)的培養(yǎng)天數(shù)。

1.2.3 根系分泌物對幼苗生長的化感自毒效應(yīng)測定。種子培養(yǎng)14 d時，測定蒙古黃芪幼苗的胚芽長、胚根長、幼苗鮮重。將所有幼苗的胚根、胚芽從種子結(jié)合部切下后測定其長度，并計算平均值。

幼苗活力指數(shù)=Gi×S

(4)

式中：Gi代表發(fā)芽指數(shù)；S代表培養(yǎng)結(jié)束時的胚芽長度與胚根長度之和[19]。

1.2.4 蒙古黃芪根系分泌物的化感效應(yīng)通過化感效應(yīng)值(RI)評價[20]。若T≥C，則RI=1-C/T；若T0，則表示根系分泌物對受體作物有促進作用；如果化感效應(yīng)值(RI)<0，則表示根系分泌物對受體作物有抑制作用；絕對值越大，化感作用越強。如果某一指標(biāo)與化感效應(yīng)值呈負相關(guān)關(guān)系，則化感促進或抑制作用相反。根系分泌物的綜合化感效應(yīng)評價，通過計算各指標(biāo)的化感效應(yīng)值累加值大小確定[18]。

1.2.5 幼苗保護酶活性及丙二醛(MDA)含量測定。

待測酶液的提?。悍Q取0.2 g蒙古黃芪幼苗放入冷卻的研缽中，加入5 mL磷酸緩沖液(pH 7.8，0.05 mol·L-1)研磨成勻漿，移入5 mL離心管，在4 ℃條件下，4 000 r·min-1離心10 min，將上清液移入10 mL容量瓶并定容，放入冰箱備用。

幼苗保護酶活性測定：超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮藍四唑法(NBT)[21]測定。取待測酶液30 μL加入10 mL刻度試管，然后依次加入甲硫氨酸溶液(30 mmol·L-1)、氮藍四唑溶液(750 μmol·L-1)、乙二胺四乙酸溶液(1 mmol·L-1)和核黃素(20 μmol·L-1)各0.3 mL，再依次加入0.27 mL蒸餾水和1.5 mL磷酸緩沖液(pH值7.8、0.05 mol·L-1)，混勻后將1支對照管置于暗處，測定管在4 000 lx日光燈下反應(yīng)20 min，對照調(diào)零，560 nm下測定OD值。以抑制NBT光化還原的50%為1個SOD活力單位(U)，以每克酶制劑所具有的酶活力單位數(shù)(U·g-1)表示SOD活性大小。過氧化氫酶(CAT)采用紫外吸收法測定[22]，取0.2 mL待測酶液加入比色管，然后加入2.8 mL H2O2(0.067 mol·L-1)啟動反應(yīng)，在240 nm下測OD值，每1 min讀OD值1次，讀3 min。以1 min內(nèi)OD240 nm減少0.1的酶量為1個酶活力單位(U)。過氧化物酶(POD)采用愈創(chuàng)木酚比色法[23]測定。取1 mL待測酶液加入刻度試管，然后加入3 mL反應(yīng)混合液，反應(yīng)混合液由100 mL 0.05 mol·L-1的磷酸緩沖液(pH 6)，56 μL愈創(chuàng)木酚和38 μL 30%的過氧化氫配置而成，搖勻后，在470 nm下測定OD值，以每1 min內(nèi)OD470nm值變化0.01為1個酶活性單位(U)。

丙二醛(MDA)含量參照林植芳等[24]的方法測定。稱取0.5 g幼苗放入研缽內(nèi)，依次加入3 mL冷卻的磷酸緩沖液(pH 7.8、0.05 mol·L-1)和少量石英砂，在冰浴中研磨成勻漿，然后將勻漿移入5 mL的離心管，并用磷酸緩沖液定容至5 mL，5 000 r·min-1離心10 min，保留上清液備用。取2 mL上清液于10 mL刻度試管中，加入3 mL 5%三氯乙酸溶液(含0.5%硫代巴比妥酸)，沸水浴10 min，冷卻后5 000 r·min-1離心10 min。取上清液分別在600 nm、532 nm和450 nm下測OD值。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計，采用Duncan法進行數(shù)據(jù)間的多重比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 根系分泌物對種子萌發(fā)的化感自毒作用

蒙古黃芪根系分泌物對種子萌發(fā)的化感自毒效應(yīng)，見表1。種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)隨根系分泌物濃度的升高而降低，除根系分泌物提取物稀釋0.8倍的處理外，其余稀釋0.6倍、稀釋0.4倍、稀釋0.2倍和未稀釋處理的種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)均顯著低于對照(P<0.05)，但稀釋0.4倍和稀釋0.6倍處理之間，稀釋0.2倍和未稀釋處理之間無顯著差異。與對照相比，根系分泌物提取原液處理的發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)分別顯著降低了43.6%、34.0%和59.6%(P<0.05)。

蒙古黃芪根系分泌物對種子萌發(fā)的化感效應(yīng)評價，見表2，除稀釋0.8倍處理外，其它處理發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)的化感效應(yīng)絕對值均大于發(fā)芽勢的化感效應(yīng)值絕對值；隨著根系分泌物濃度的升高，化感效應(yīng)絕對值逐漸增大，化感效應(yīng)絕對逐漸增強。

表1 根系分泌物對種子萌發(fā)的化感自毒效應(yīng)Table 1 Effects of Astragalus membranaceus root exudates on allelopathic autotoxicity of seed germination

注：同列不同字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。下同。

Note：Different letters in the same column indicate significant differentes among treatments at 0.05 level.The same is as below.

表2 根系分泌物對種子萌發(fā)的化感效應(yīng)評價Table 2 Evaluation for effects of Astragalus membranaceus root exudates on allelopathic autotoxicity of seed germination

2.2 對幼苗的化感自毒效應(yīng)

不同濃度的蒙古黃芪根系分泌物對幼苗的化感自毒效應(yīng)不同(表3)?；凶远拘?yīng)隨根系分泌物濃度的升高逐漸增強。根系分泌物提取物稀釋0.8倍處理對幼苗的生長基本沒有影響。與對照相比，稀釋倍數(shù)小于0.6的根系分泌物提取液處理顯著抑制蒙古黃芪幼苗的生長(P<0.05)，表現(xiàn)為降低幼苗鮮重，抑制胚根、胚芽生長，化感自毒效應(yīng)隨根系分泌物濃度的增加而逐漸增強。

不同測定指標(biāo)間比較，蒙古黃芪根系分泌物對胚根長度、幼苗活力指數(shù)及苗鮮重的化感效應(yīng)值絕對值較大；幼苗胚根長度、胚芽長度、苗鮮重和幼苗活力指數(shù)的化感效應(yīng)值累加值，隨根系分泌物濃度的增大而逐漸升高，變化趨勢與化感效應(yīng)值一致(表4)。

表3 根系分泌物對幼苗生長的化感自毒效應(yīng)Table 3 Effects of Astragalus membranaceus root exudates on allelopathic autotoxicity of seedling growth

表4 根系分泌物對幼苗生長化感效應(yīng)綜合評價Table 4 Evaluation for effects of Astragalus membranaceus root exudates on allelopathic autotoxicity of seedling growth

2.3 根系分泌物對幼苗抗氧化酶活性及膜脂過氧化的影響

未稀釋根系分泌物提取液處理的SOD活性、POD活性和CAT活性分別為64 U·g-1、7.0 U·g-1·min-1、21.0 U·g-1·min-1，與對照比較，SOD、POD和CAT活性分別顯著降低了24.9%、22.0%和35.0%(P<0.05)(表5)，差異達到顯著水平，說明高濃度的根系分泌物抑制了黃芪幼苗的SOD 、POD和CAT的活性，影響幼苗的生長。稀釋0.8倍處理的CAT和MDA含量與對照比，差異均不顯著。稀釋濃度大于0.6倍的處理，MDA含量顯著高于與對照(P<0.05)，由此可見，較低濃度的根系分泌物對自身幼苗細胞膜系統(tǒng)沒有傷害，而稀釋倍數(shù)小于0.6的根系分泌物則對自身幼苗細胞膜系統(tǒng)造成一定傷害，影響幼苗的生長。

表5 根系分泌物對幼苗抗氧化酶活性和MDA含量的影響Table 5 Effects of root exudates on SOD,POD,CAT activities and MDA content in seedlings of Astragalus membranaceus

3 討 論

研究植物根系分泌物的化感作用時，必須排除土壤理化反應(yīng)、土壤微生物以及土壤原生動物分解代謝作用的影響[25]。水培收集法是目前學(xué)者們常用的植物根系分泌物收集方法之一[26]，其優(yōu)點是操作簡單，并盡可能排除了外界環(huán)境的影響，最大限度地反映了根系分泌物的本質(zhì)[27]。研究根系分泌物對植物種子萌發(fā)及幼苗生長的促進或抑制作用，可以直觀反應(yīng)根系分泌物對植物早期生長的化感自毒效應(yīng)[28]。

蒙古黃芪是根類藥材，其根系分泌物在土壤中的積累使其較易發(fā)生土傳病害，研究表明蒙古黃芪根際土提取物對其種子萌發(fā)和生長均存在一定的自毒作用[19]。本研究通過種子萌發(fā)及幼苗生長實驗評價蒙古黃芪根系分泌物的化感自毒效應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同濃度的根系分泌物對種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)，幼苗的胚根長度、胚芽長度和幼苗活力指數(shù)的化感自毒效應(yīng)不同?；芯C合效應(yīng)隨蒙古黃芪根系分泌物濃度的升高呈現(xiàn)出逐漸增加的趨勢。蒙古黃芪根系分泌物對其種子萌發(fā)和幼苗生長的抑制作用隨根系分泌物濃度的增大而加強，低濃度的根系分泌物對種子萌發(fā)和幼苗生長基本沒有抑制作用。這與劉素慧等[29]、李忠等[30]研究大蔥、洋蔥、韭菜以及花生上的根系分泌物對作物的影響獲得的結(jié)果一致。張磊等[31]研究不同濃度大蒜根系分泌物對當(dāng)歸種子萌發(fā)及幼苗生長的影響發(fā)現(xiàn)，低濃度的根系分泌物可以促進當(dāng)歸幼苗葉片糖分積累，提高當(dāng)歸種子的發(fā)芽率，增強幼苗的抗逆性，而高濃度則會抑制幼苗的生長。

作物自身的保護酶SOD和POD 可減輕活性氧對作物的傷害，保護作物細胞膜結(jié)構(gòu)，抵抗逆境脅迫的危害。有研究表明根系分泌物對作物細胞的保護酶系統(tǒng)具有一定的損害作用，使作物細胞內(nèi)活性氧動態(tài)失衡，破壞細胞膜的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)[32]。本試驗結(jié)果表明，高于40%的根系分泌物處理，SOD、POD 和CAT酶的活性隨著根系分泌處理濃度的增加而降低， MDA含量隨著根系分泌處理濃度的增加而增加，這與王闖等[33]研究黃瓜根系分泌物對黃瓜幼苗生長和生理特性的影響獲得的結(jié)果一致。根系分泌物是土壤中化感物質(zhì)和自毒物質(zhì)的主要來源之一，是影響植物連作的重要障礙因子[34]。

本研究僅通過比較不同濃度根系分泌物對蒙古黃芪種子萌發(fā)和幼苗生長的化感自毒效應(yīng)，確定根系分泌物對蒙古黃芪早期生長的影響作用。要明確根系分泌物對蒙古黃芪生長的化感自毒效應(yīng)，還需要研究根系分泌物對蒙古黃芪后期生長的影響作用?？傊?，在蒙古黃芪的種植中，不僅要利用根系分泌物對其它作物的促進作用合理安排輪作，緩解其它作物的連作障礙，而且還需要避免自身的連作以及與同屬作物的輪作，最大限度減輕根系分泌物的化感自毒效應(yīng)。

4 結(jié) 論

蒙古黃芪根系分泌物對其種子的萌發(fā)和幼苗生長的抑制作用隨根系分泌物濃度的增大而增加。高于40%的根系分泌物處理的SOD、POD 和CAT酶的活性隨根系分泌處理濃度的增加而降低，MDA含量隨根系分泌處理濃度的增加而增加，可以推斷，根系分泌物抑制了蒙古黃芪幼苗保護酶SOD、POD和CAT的活性，影響了幼苗的生長。