基于尋峰算法的熒光檢測(cè)設(shè)備的設(shè)計(jì)與實(shí)現(xiàn)

傅成杰 閆維新 趙言正

關(guān)鍵詞： 熒光免疫層析; C反應(yīng)蛋白; 尋峰算法; 單光路結(jié)構(gòu); 雙閉環(huán)反饋; LED光源

中圖分類號(hào)： TN247?34; TH776 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A ? ? ? ? ? ? ? ? 文章編號(hào)： 1004?373X（2019）03?0148?04

Abstract： A small?sized fluorescence detection device is designed to simply and accurately acquire the location of [T]?peak and [C]?peak in C?reactive protein （CRP） detection， and a window shifting peak?searching algorithm is proposed. This detection device includes the design and optimization of optical path and circuit. The design of single optical path structure can maintain the compact structure and small overall size of the device. The inner current feedback and outer light intensity feedback can make the output light excited by LED stable. The detection experiment results of CRP show that the window shifting peak?searching algorithm has easy operation and high precision， and the obtained location accuracy of [T]?peak and [C]?peak is increased by 50.0% and 52.9% respectively than that of the general polynomial fitting method.

Keywords： fluorescent immune chromatography; C?reactive protein; peak?searching algorithm; single optical path structure; double closed?loop feedback; LED light source

0 ?引 ?言

免疫學(xué)檢驗(yàn)包括定性、半定量、定量等檢測(cè)模式，前兩種模式無(wú)需知道精確的待檢物質(zhì)含量。然而，隨著社會(huì)的發(fā)展和醫(yī)學(xué)診斷的完善，定量檢測(cè)模式的需求日漸增加。熒光免疫層析技術(shù)是一種快速定量檢測(cè)技術(shù)，該技術(shù)建立在熒光免疫分析技術(shù)與免疫層析技術(shù)的基礎(chǔ)上[1]，可以被運(yùn)用于血樣中C反應(yīng)蛋白（CRP）[2]濃度的定量檢測(cè)。熒光免疫層析技術(shù)利用熒光物質(zhì)標(biāo)記待測(cè)抗體或抗原的特異性反應(yīng)過(guò)程[3]，熒光物質(zhì)在激發(fā)光的照射下產(chǎn)生特定波長(zhǎng)的熒光，通過(guò)光電檢測(cè)模塊采樣收集光強(qiáng)信息，并通過(guò)處理算法將熒光信號(hào)量轉(zhuǎn)換為待檢物的濃度信息。

CRP是一種急性時(shí)相反應(yīng)蛋白，對(duì)于鑒定感染及多種結(jié)締組織病、判斷疾病嚴(yán)重性或活動(dòng)性等具有十分重要的意義[4]。在CRP檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中，向試紙條滴加血樣，CRP在[T]線處發(fā)生反應(yīng)，而游離標(biāo)記物則在[C]線處發(fā)生相應(yīng)反應(yīng)。使用熒光掃描采樣得到熒光光強(qiáng)信號(hào)數(shù)據(jù)，處理該數(shù)據(jù)之后，可獲得具有一定峰特征的波形曲線，其含有2個(gè)明顯峰，分別反映了[T]線和[C]線處對(duì)應(yīng)熒光標(biāo)記物的濃度。在一定范圍內(nèi)，[T]峰與[C]峰的峰面積比值[TC]與血樣中待測(cè)物質(zhì)的濃度成正相關(guān)，這是血樣檢測(cè)的理論基礎(chǔ)。計(jì)算峰面積比值[TC]主要涉及原始數(shù)據(jù)的濾波算法和曲線的尋峰算法。而峰面積值比[TC]依賴于峰的具體位置，因此高精度的尋峰算法是保證系統(tǒng)檢測(cè)精度的關(guān)鍵。

尋峰算法常用的方法有直接比較法、一般多項(xiàng)式擬合法、高斯多項(xiàng)式擬合法、高斯擬合法和優(yōu)化尋峰算法等。其中直接比較法應(yīng)用一階微分，該方法在熒光強(qiáng)度曲線波動(dòng)較大時(shí)尋峰精度較低，并且只適合找孤立峰。一般多項(xiàng)式法選擇一般多項(xiàng)式進(jìn)行擬合，最小二乘法進(jìn)行判定，該方法簡(jiǎn)單、易于實(shí)現(xiàn)，但是尋峰準(zhǔn)確度有限[5]。高斯多項(xiàng)式擬合法對(duì)波形曲線進(jìn)行高斯?多項(xiàng)式變換，該方法的尋峰精度高于一般多項(xiàng)式擬合法，但該方法對(duì)波形曲線數(shù)據(jù)較敏感，抗噪性能差，并且如果波峰不在波形曲線數(shù)據(jù)內(nèi)，那么得到的峰值誤差會(huì)較大[6]。高斯擬合法[7]不經(jīng)過(guò)多項(xiàng)式變換，直接作為Gaussian函數(shù)進(jìn)行擬合處理，得到最佳擬合曲線，進(jìn)而獲得波峰位置。遺傳算法[8]、基于徑向基函數(shù)網(wǎng)絡(luò)算法及蟻群算法等優(yōu)化尋峰算法可以改善精確度，但計(jì)算復(fù)雜，需要較長(zhǎng)時(shí)間的嘗試與訓(xùn)練才能確定各個(gè)參數(shù)，求解速度慢，因此不適合快速、實(shí)時(shí)的運(yùn)算[9]。

本文結(jié)合熒光波形曲線的峰特征，提出一種實(shí)施簡(jiǎn)單同時(shí)精度較高的平移窗口尋峰算法。接著設(shè)計(jì)了一種小型熒光檢測(cè)設(shè)備，目的是改善目前市場(chǎng)上相關(guān)設(shè)備體積大、操作難的現(xiàn)狀，其中著重進(jìn)行了光電檢測(cè)模塊和上下位機(jī)軟件的設(shè)計(jì)及優(yōu)化。最后通過(guò)分析比較幾種尋峰算法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，驗(yàn)證本文提出的平移窗口尋峰算法具有一定的應(yīng)用意義。

1 ?平移窗口尋峰算法

經(jīng)濾波算法處理后，熒光強(qiáng)度波形曲線表現(xiàn)出明顯的雙峰特征。平移窗口尋峰算法的總體流程如圖1所示，通過(guò)特定的峰位置可以截取獲得有效的數(shù)據(jù)區(qū)域，最后得到峰面積值比[TC]。

1.1 ?初尋[T]峰

對(duì)多種濃度區(qū)間血樣進(jìn)行檢測(cè)實(shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)，檢測(cè)帶（[T]線）區(qū)域和質(zhì)控帶（[C]線）區(qū)域的熒光強(qiáng)度，即波形曲線的縱坐標(biāo)值始終處于較高的水平，并且[T]峰的位置靠前，[C]峰的位置靠后。某次實(shí)驗(yàn)的熒光強(qiáng)度波形曲線結(jié)果如圖2所示。

1.2 ?截取有效波形段及再次尋峰

因?yàn)閇T]峰和[C]峰的位置較為固定，所以得到[T]峰位置后，截取附近的240個(gè)采樣點(diǎn)作為有效數(shù)據(jù)區(qū)，構(gòu)成新的熒光波形曲線。截取的目的一是為了減輕后續(xù)的數(shù)據(jù)計(jì)算量，二是為了后期能夠?qū)晒獠ㄐ吻€更加合理完整地展現(xiàn)出來(lái)。

現(xiàn)在有效數(shù)據(jù)區(qū)存在明顯的、跨度較為合理的雙峰特征，再次使用初尋[T]峰時(shí)使用的尋峰算法，最高峰和次高峰即為所求的兩個(gè)峰。其中[T]峰靠前，[C]峰靠后。

1.3 ?確定邊界位置及計(jì)算峰面積比[TC]

本文根據(jù)采樣點(diǎn)的微分值確定邊界位置。從[T]峰位置向前輪尋，其微分值從大于0.8到小于0.8的點(diǎn)，記為[T]峰的左邊界點(diǎn);從[C]峰位置向后輪尋，其微分值從小于-0.8到大于-0.8的點(diǎn)，記為[C]峰的右邊界點(diǎn);而[T]峰和[C]峰之間最低的點(diǎn)，記為[T]峰的右邊界點(diǎn)和[C]峰的左邊界點(diǎn)。

確定好邊界位置后，采用累加和的思想分別求得[T]峰和[C]峰的面積，兩者相除可以獲得最終的峰面積比[TC]。

2 ?系統(tǒng)設(shè)計(jì)

為彌補(bǔ)市場(chǎng)上相關(guān)檢測(cè)設(shè)備體積過(guò)大、操作復(fù)雜的缺點(diǎn)，本文設(shè)計(jì)了一款小型熒光檢測(cè)設(shè)備，整體框架如圖3所示。該設(shè)備以TI的CC2640芯片作為主控單元，重點(diǎn)設(shè)計(jì)了光電檢測(cè)模塊和上下位機(jī)軟件。其中光電檢測(cè)模塊主要包括光路設(shè)計(jì)和電路設(shè)計(jì)。

2.1 ?光路設(shè)計(jì)

為減小熒光檢測(cè)設(shè)備的整體體積，本文舍棄了體積占用比大的雙通道光路結(jié)構(gòu)，選取了單光路結(jié)構(gòu)。如圖4所示是單光路模塊示意圖，包括反饋PD、檢測(cè)PD、LED光源、分光片、濾光片及凸透鏡等光學(xué)元器件。另外，為了減輕雜散光對(duì)設(shè)備檢測(cè)的影響，本文設(shè)計(jì)了光阱結(jié)構(gòu)。

圖4中箭頭所示為光路的傳播路徑，當(dāng)光路選通時(shí)，LED光源點(diǎn)亮，發(fā)出一定波長(zhǎng)范圍之間的光，主峰為檢測(cè)所需的激發(fā)光，其波長(zhǎng)記為[λ]。發(fā)出的光分成兩路進(jìn)行傳播：一路作為反饋光路;另一路作為檢測(cè)光路。反饋光路通過(guò)濾光片由反饋PD接收，本文把它作為L(zhǎng)ED的輸出光強(qiáng)反饋信號(hào)，將用于后文的雙閉環(huán)反饋電路中。而檢測(cè)光路則較為復(fù)雜，首先通過(guò)濾光片得到帶寬較窄、以[λ]為中心波長(zhǎng)的激發(fā)光譜，接著是兩塊平行放置的分光片，以[45°]入射角射向第一分光片后，產(chǎn)生的反射光同樣以[45°]射入第二分光片，產(chǎn)生的透射光即作為最終的激發(fā)光。激發(fā)光經(jīng)由凸透鏡聚焦到試紙條的熒光物質(zhì)上，產(chǎn)生主峰波長(zhǎng)為[λf]的熒光，熒光經(jīng)過(guò)凸透鏡后由第二分光片反射，產(chǎn)生的反射光通過(guò)濾光片后，檢測(cè)PD接收其中波長(zhǎng)為[λf]附近的光，熒光的光強(qiáng)信號(hào)由檢測(cè)PD轉(zhuǎn)化為電信號(hào)。

2.2 ?電路設(shè)計(jì)

為改善熒光信號(hào)檢測(cè)的精度，需要保證激發(fā)光光強(qiáng)的穩(wěn)定。而在一定范圍內(nèi)，LED光強(qiáng)與工作電流成線性關(guān)系[10]。因此，本文采用較為成熟的光強(qiáng)與電流的雙閉環(huán)反饋電路，以減輕激發(fā)光對(duì)熒光檢測(cè)的影響。LED光源本身隨著使用時(shí)間的增長(zhǎng)，溫度會(huì)發(fā)生變化，發(fā)生光衰現(xiàn)象[11]，LED發(fā)出的光強(qiáng)減弱。同時(shí)，驅(qū)動(dòng)電路自身存在電流波動(dòng)，LED光強(qiáng)隨之產(chǎn)生波動(dòng)。外閉環(huán)依靠光強(qiáng)反饋來(lái)調(diào)整電流的數(shù)值大小，使光強(qiáng)輸出達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài);內(nèi)閉環(huán)依靠電流反饋使驅(qū)動(dòng)電流輸出達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。

2.3 ?軟件設(shè)計(jì)

小型熒光檢測(cè)設(shè)備的軟件部分包含上位機(jī)和下位機(jī)。上位機(jī)包括安卓APP和Java Web服務(wù)端，實(shí)現(xiàn)了熒光波形曲線的顯示、結(jié)果的分析與存儲(chǔ)等功能。下位機(jī)選擇的是CC2640芯片，其本質(zhì)是一塊嵌入式ARM芯片，帶有A/D可編程放大的功能，主要實(shí)現(xiàn)試紙條的推送控制、熒光光強(qiáng)信號(hào)的掃描采樣以及熒光光強(qiáng)的數(shù)據(jù)傳輸?shù)裙δ堋?/p>

該設(shè)備忽略暗電流的影響，直接進(jìn)入檢測(cè)流程。血樣首先在試紙條上完成層析反應(yīng)，接著傳送裝置推送試紙條勻速通過(guò)光電檢測(cè)模塊，完成掃描采樣最終得到熒光波形曲線。熒光光強(qiáng)信號(hào)的掃描采樣流程如圖5所示。

設(shè)備進(jìn)行初始化后，掃描采樣分三步完成：

1） 預(yù)采樣，熒光光強(qiáng)信號(hào)由檢測(cè)PD轉(zhuǎn)換為電壓量，經(jīng)A/D轉(zhuǎn)換可得到數(shù)字量，通道增益選擇默認(rèn)值;

2） 調(diào)整增益，根據(jù)滿量程的數(shù)字量和預(yù)采樣得到的數(shù)字量，調(diào)整增益的大小，保證再采樣得到的數(shù)字量比滿量程的數(shù)字量大于0.5，假如兩者比值偏小，那么需調(diào)大增益來(lái)提高分辨率;

3） 再采樣，增益值調(diào)整之后得到更準(zhǔn)確的熒光光強(qiáng)信號(hào)并記錄數(shù)值大小。判斷采樣點(diǎn)數(shù)是否達(dá)到目標(biāo)采樣點(diǎn)數(shù)，若已達(dá)到，則停止采樣，將其作為有效的熒光光強(qiáng)信號(hào)數(shù)據(jù)，否則返回步驟1）。

有效光強(qiáng)信號(hào)數(shù)據(jù)通過(guò)藍(lán)牙傳輸給安卓手機(jī)，安卓APP再上傳到網(wǎng)站W(wǎng)eb服務(wù)端，經(jīng)處理后可得到熒光波形曲線，其數(shù)據(jù)分析結(jié)果可保存到本地MySQL數(shù)據(jù)庫(kù)中。

3 ?尋峰算法的實(shí)驗(yàn)對(duì)比分析

為了驗(yàn)證平移窗口尋峰算法的精確度，本文選擇一般多項(xiàng)式擬合法和高斯擬合法作為對(duì)比算法，并以高斯擬合法求得的峰位置作為標(biāo)準(zhǔn)值。

本文選取8種CRP濃度不同的校準(zhǔn)血樣，其CRP濃度分別為0.50 mg/L，1.84 mg/L，3.00 mg/L，9.09 mg/L，18.18 mg/L，72.72 mg/L，145.44 mg/L，205.00 mg/L，每種濃度做3組實(shí)驗(yàn)，取其平均值作為實(shí)際檢測(cè)值。各個(gè)尋峰算法的尋峰位置檢測(cè)值如表1所示，其中每一個(gè)數(shù)據(jù)記錄中包含兩個(gè)數(shù)字，上面代表[T]峰位置，下面代表[C]峰位置。

根據(jù)表1數(shù)據(jù)，以高斯擬合法求得的結(jié)果作為標(biāo)準(zhǔn)，分析計(jì)算可得，一般多項(xiàng)式擬合法求得的[T]峰和[C]峰的平均偏差分別是[δ1T=2.25]，[δ1C=2.125]，而平移窗口尋峰算法求得的[T]峰和[C]峰的平均偏差分別是[δ2T=1.125]，[δ2C=1.0]。對(duì)比可知，平移窗口尋峰算法的精度相較于一般多項(xiàng)式擬合法，[T]峰精度提升50.0%，[C]峰精度提升52.9%。本文設(shè)計(jì)的平移窗口尋峰算法的尋峰精確度滿足要求。

4 ?結(jié) ?語(yǔ)

小型熒光檢測(cè)設(shè)備采用單光路結(jié)構(gòu)、雙閉環(huán)反饋電路，既保證了設(shè)備體積小，也保證了激發(fā)光的穩(wěn)定。針對(duì)影響設(shè)備檢測(cè)精度關(guān)鍵之一的尋峰算法，本文采用操作簡(jiǎn)單的平移窗口尋峰算法，通過(guò)初尋[T]峰、截取有效波形段以及再次尋峰等步驟，實(shí)現(xiàn)對(duì)[T]峰和[C]峰的尋找。對(duì)CRP的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該尋峰算法的精度介于一般多項(xiàng)式擬合法和高斯擬合法之間，達(dá)到了熒光檢測(cè)設(shè)備的設(shè)計(jì)要求。

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