晚期糖基化終產(chǎn)物對糖尿病及其并發(fā)癥的影響和干預的研究進展

鄭曉茂，茹 琴，陳 琳 綜述，李超英 審校

(江漢大學武漢生物醫(yī)學研究院，武漢 430056)

晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products，AGEs)由法國生物化學家美拉德于1912年將甘氨酸和葡萄糖混合一起加熱時發(fā)現(xiàn)，故此反應又稱為Maillard反應[1]。AGEs是指果糖、葡萄糖等還原糖的醛基和蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸等大分子物質(zhì)的氨基，在非酶促條件下經(jīng)過一系列復雜的反應后形成穩(wěn)定的不可逆的終末產(chǎn)物。AGEs在體內(nèi)多種細胞和組織器官中蓄積，進而誘導氧化應激和炎性反應，是參與糖尿病及其并發(fā)癥發(fā)生、發(fā)展的主要機制。研究證明，AGEs對胰島β細胞具有比高糖更強、作用時間更久的毒性作用，是糖尿病及其并發(fā)癥持續(xù)惡化的重要因素[2]。本文就AGEs形成、檢測、致病機制和干預物質(zhì)的研究進展進行綜述。

1 AGEs的形成與檢測

AGEs的生成可分為三步[3]：(1)氨基酸、蛋白質(zhì)類大分子物質(zhì)末端的還原氨基和葡萄糖上的醛基在非酶條件下反應形成席夫堿，反應迅速且可逆程度高；(2)希夫堿不穩(wěn)定，經(jīng)過一段短暫的時間后，自發(fā)重排形成相對穩(wěn)定的酮胺類化合物(Amadori產(chǎn)物)，反應相對緩慢并可逆，上述反應生成的產(chǎn)物統(tǒng)稱為早期糖基化終末產(chǎn)物；(3)Amadori產(chǎn)物進一步降解、重排形成羰基化合物，接著羰基化合物與蛋白質(zhì)上的自由氨基反應生成AGEs，此步反應生成的產(chǎn)物非常穩(wěn)定且不可逆。人體內(nèi)AGEs的來源主要有兩個方面：(1)體內(nèi)發(fā)生非酶糖基化反應，即個體在新陳代謝過程中發(fā)生糖基化反應生成一定量的AGEs，而持續(xù)高血糖條件下極大的加速了AGEs的生成；(2)除了在體內(nèi)形成，AGEs也可以通過飲食在人體內(nèi)蓄積，尤其是燒烤、油炸等方式加工的食品，AGEs含量很高，外源性AGEs已經(jīng)成為人體內(nèi)AGEs沉積的重要來源。

AGEs結構復雜且呈異質(zhì)性，檢測AGEs的主要方法有[4]：(1)AGEs具有熒光特性，因此可以通過測定熒光值來間接反映AGEs水平，熒光光譜法迅速簡便且靈敏度高，是目前檢測AGEs較為常用的方法；(2)高效液相色譜法的優(yōu)點是效率高、靈敏度高、分辨率高，缺點是操作過程繁瑣、成本高，不利于普及；(3)酶聯(lián)免疫吸附劑測定法也是檢測AGEs常用的方法，具有靈敏度高、特異性強的特點，但該法對操作的要求較為嚴格，有時需要多次重復，比較費時費力。

在臨床檢測指標與方法的研究探索中，目前一致認為測定早期糖基化終末產(chǎn)物例如糖化血紅蛋白水平，是評估糖尿病患者8～12周血糖控制情況的金標準。鑒于糖化血紅蛋白的壽命在120 d左右，有研究表明與糖化血紅蛋白相比，測定AGEs水平可反映更長時間的血糖水平控制情況[5]。通過高效液相色譜法檢測糖尿病患者血清和晶狀體蛋白中的AGEs，發(fā)現(xiàn)糖尿病患者體內(nèi)的AGEs顯著高于非糖尿病受試者[6]。還有研究發(fā)現(xiàn)，利用AGEs具有熒光的特性，通過無創(chuàng)熒光光譜法檢測皮膚中AGEs水平可以反映人體內(nèi)AGEs總體水平[4]，此方法具有快速無創(chuàng)的優(yōu)點，且具有更高的靈敏度，可用于糖尿病的篩查，且優(yōu)于檢測空腹血糖和糖化血紅蛋白，具有一定的應用前景。

2 AGEs的致病機制

研究表明，AGEs參與的疾病包括糖尿病、動脈粥樣硬化、視網(wǎng)膜病變、阿爾茨海默病、尿毒癥、白內(nèi)障等[7]。已有研究證明，AGEs對胰島β細胞的毒性作用比高糖更強、作用時間更久，是參與糖尿病發(fā)生、發(fā)展和持續(xù)惡化的主要因素之一[2]。AGEs作為糖尿病的致病因子是導致糖尿病并發(fā)癥發(fā)生、發(fā)展的重要因素[8]，AGEs參與糖尿病及其并發(fā)癥主要通過以下幾個方面。

2.1AGEs和蛋白質(zhì)交聯(lián) AGEs修飾蛋白質(zhì)影響其結構和功能特性。AGEs通過分子間的共價鍵與機體內(nèi)的蛋白質(zhì)交聯(lián)或結合，改變蛋白質(zhì)的生物特性，從而引起生理生化性質(zhì)的變化[9-10]。如AGEs與Ⅰ型膠原蛋白及彈性蛋白發(fā)生交聯(lián)，導致細胞外基質(zhì)面積增大，造成血管硬度增加[11]。膠原蛋白和層粘連蛋白是基底膜中的關鍵蛋白，當AGEs在腎臟中蓄積后，胞外基質(zhì)Ⅳ型膠原分子之間的結合能力降低，破壞空間支架結構，同時層粘連蛋白本身的多聚性降低，與Ⅳ型膠原分子連接性減少，腎小球基底膜支架結構孔徑增大，通透性增加，從而導致蛋白尿和糖尿病腎病[12]。SINGH等[13]發(fā)現(xiàn)，AGEs在作用于基質(zhì)蛋白后可以改變其結構和生物學特性，導致機體功能性損傷，如血管增厚、彈性降低和血管內(nèi)皮功能障礙等。

2.2AGEs與其特異受體(receptor of advanced glycation end products，RAGE)結合 RAGE在多種類型的細胞上均有表達，如內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞、神經(jīng)細胞、神經(jīng)膠質(zhì)細胞、單核細胞/巨噬細胞、成纖維細胞等[14]。AGEs與RAGE相互作用后激活一系列復雜的信號轉(zhuǎn)導通路，包括ERK1/2MAPK、JAK/STAT、SAPK/JNK、MAPK、AKT、caspase-3/7和TGF-β-Smad，誘導許多細胞內(nèi)信號傳導通路產(chǎn)生活性氧和活性氮，從而進一步導致不同的病理反應[15]。免疫組織化學染色法檢測RAGE在糖尿病腎病患者腎小球中的水平，結果在腎小球系膜細胞及上皮細胞中均有明顯的陽性染色，而對照樣品中未檢測到RAGE的表達[12]。RAMASAMY等[16]發(fā)現(xiàn)高糖血癥中RAGE的上調(diào)導致體內(nèi)AGEs的加速積累，并且AGE-RAGE信號轉(zhuǎn)導通路與糖尿病血管并發(fā)癥的進展密切相關。ZHU等[2]發(fā)現(xiàn)，AGEs通過和RAGE相互作用，引發(fā)一系列氧化應激、炎癥等級聯(lián)反應，最終導致糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生。AGEs可以調(diào)節(jié)和增加RAGE的表達，健康人群的RAGE表達水平很低，當AGEs與RAGE結合后，誘導的氧化應激和炎性反應增多，導致RAGE的表達增加。

2.3AGEs對胰島β細胞的直接損傷作用 近年的研究發(fā)現(xiàn)，AGEs對胰島β細胞具有直接損傷作用。CAI等[17]通過給予小鼠長期攝入AGEs，結果發(fā)現(xiàn)小鼠表現(xiàn)出明顯的肥胖和胰島素抵抗。腺苷三磷酸(ATP)在胰島素分泌中發(fā)揮重要作用，當體內(nèi)ATP含量降低時，胰島素分泌將會受到抑制。ZHAO等[18]在分離的小鼠原代胰島β細胞中發(fā)現(xiàn)，AGEs通過阻斷細胞色素C的氧化，降低ATP的合成，從而影響胰島β細胞分泌胰島素。LIM等[19]報道，AGEs通過誘導活性氧的產(chǎn)生和增加RAGE的表達，促進胰島β細胞凋亡，而通過減少活性氧的產(chǎn)生和抑制RAGE能夠明顯減少細胞凋亡。此外還有研究報道，AGEs通過激活caspase-9和抑制抗凋亡基因Bcl-2的表達，同時引起線粒體腫脹，促進胰島β細胞凋亡[20-21]。這些報道都證明了AGEs可以直接作用于胰島β細胞，誘導胰島β細胞發(fā)生氧化應激反應，導致胰島素合成與分泌功能障礙，促使胰島β細胞凋亡。

3 AGEs的干預

AGEs在糖尿病的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要的作用，通過抑制或裂解AGEs，阻斷AGEs與RAGE的結合，以減輕其進一步誘導的氧化應激等級聯(lián)反應，是目前保護胰島β細胞及降低糖尿病患者并發(fā)癥發(fā)生的重要手段。

3.1抑制AGEs的生成 氨基胍作為親核肼化物被廣泛地應用于抑制AGEs的形成，其主要是通過阻斷Amadori產(chǎn)物進一步形成羰基化合物，從而抑制AGEs的形成[22-24]。在體外非酶糖基化反應體系中加入200 mmol/L氨基胍后，AGEs生成明顯受到抑制，并且隨著時間的推移，抑制率最高達到84.26%[25]。但是臨床試驗發(fā)現(xiàn)氨基胍具有明顯的不良反應，目前無法繼續(xù)應用于臨床。另一個研究較多的是吡哆胺，吡哆胺是一種親核試劑，能夠清除非酶糖基化和脂質(zhì)過氧化過程中產(chǎn)生的活性羰基化合物，抑制糖基化中間產(chǎn)物轉(zhuǎn)變?yōu)锳GEs，同時減少氧化應激反應[26-27]。給予糖尿病大鼠吡哆胺灌胃12周，結果發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠視皮質(zhì)中AGEs水平明顯降低，RAGE的表達明顯受到抑制[28]。吡多胺對人體無明顯的不良反應，具有良好的應用前景，但是吡哆胺抑制AGEs的相關研究還相對較少，且對AGEs的最佳抑制濃度還需進一步探討。此外，二甲雙胍、阿卡波糖和維生素C等臨床藥物也被發(fā)現(xiàn)對AGEs具有一定的抑制作用。

3.2AGEs裂解劑 另外一種AGEs的干預手段是加入裂解劑裂解或斷裂AGEs，其優(yōu)勢在于可以逆轉(zhuǎn)已生成的AGEs及其交聯(lián)結構。如N-苯乙酰噻唑(PTB)，已被證實可以有效地裂解體外已形成的AGEs，但是PTB化學性質(zhì)不穩(wěn)定，容易發(fā)生水解而失去藥理作用[29]。4，5-二甲基-3-苯乙酰噻唑氯(ALT711)是由美國Alteon公司開發(fā)的一種AGEs及其交聯(lián)結構裂解劑，在Ⅰ、Ⅱ的期臨床試驗中，ALT711均表現(xiàn)出了對糖尿病及其慢性并發(fā)癥有良好的治療效果，但是由于經(jīng)濟問題Alteon公司已停止了ALT711的臨床試驗。

3.3阻斷AGEs與RAGE的結合 RAGE是AGEs信號轉(zhuǎn)導通路的主要受體，AGEs-RAGE信號轉(zhuǎn)導通路激活后，誘導炎癥因子的釋放及氧化應激反應的發(fā)生，從而導致了糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展。因此阻斷AGEs和RAGE的結合是一個新型治療靶點。目前研究較多的是可溶性sRAGE及抗RAGE抗體。sRAGE由RAGE的胞外域直接脫落而成，能夠競爭性的與體內(nèi)AGEs結合，阻斷了AGEs與RAGE結合引起的細胞內(nèi)信號傳導通路。糖尿病小鼠經(jīng)sRAGE治療后，蛋白尿明顯降低，動脈粥樣硬化及腎小球硬化明顯改善[30]?？筊AGE抗體是通過與RAGE胞外區(qū)域相互作用，阻斷AGEs-RAGE信號通路誘導的生物學效應[31]。給予抗RAGE抗體治療糖尿病小鼠，超聲測量小鼠后肢血流情況，發(fā)現(xiàn)抗RAGE抗體治療組小鼠血管成像信號明顯高于對照組，證明抗RAGE抗體對糖尿病足病具有良好的治療效果[32]。

3.4通過阻斷氧化應激間接抑制AGEs的作用 通過降低氧化應激來保持體內(nèi)自由基的穩(wěn)態(tài)是治療AGEs誘導的糖尿病及其并發(fā)癥的另一個治療方向[33]。用二甲雙胍干預AGEs損傷的大鼠成骨細胞，實驗結果表明二甲雙胍呈劑量依賴性的減少成骨細胞的氧化應激反應及凋亡，對大鼠成骨細胞具有明顯的保護作用[34]。替莫普利和奧美沙坦干預AGE-BSA處理的兔主動脈平滑肌細胞，與模型組相比，二者均能夠明顯降低細胞的氧化應激反應，減少細胞凋亡，對細胞具有明顯的保護作用[35]。吡哆胺已被證明能有效抑制AGEs的產(chǎn)生，其作用機制就是通過清除非酶糖基化和脂質(zhì)過氧化過程中產(chǎn)生的活性羰基化合物，抑制AGEs生成的同時減少了氧化應激反應的發(fā)生，從而對機體具有良好的保護作用[27]。

除上述藥物外，目前開發(fā)的針對AGEs的藥物還有Glycadia公司的GLY-230和同和藥業(yè)有限公司的DW-1029M，這兩種藥物均處于臨床Ⅱ期試驗階段，未來有望用于治療以AGEs為靶點的相關疾病。然而，現(xiàn)在進入臨床的AGEs靶點藥物仍比較有限，因此需要深入研究其作用機制以利于開發(fā)新藥物。

4 天然產(chǎn)物對AGEs的干預

已有研究表明，某些天然產(chǎn)物或其活性成分對AGEs的生成具有明顯的抑制作用，如具有抗氧化抗炎作用的黃酮類化合物，對AGEs的生成也展現(xiàn)出了明顯的抑制效果[25]。如槲皮素，體外和體內(nèi)實驗中均證明能夠有效地減少AGEs的生成及蓄積，尤其是在體外非酶糖基化實驗中發(fā)現(xiàn)槲皮素對AGEs的抑制作用明顯強于氨基胍[36]。此外，還有實驗證明多種植物提取物的多糖對AGEs的生成也有抑制作用，如綠茶和蘆薈多糖提取物已被證明能夠明顯抑制對AGEs的生成，且二者對AGEs的作用時間越長，抑制率越高[37]。

另一類研究較多的是多酚類化合物，如白藜蘆醇，體外非酶糖基化體系研究發(fā)現(xiàn)600 μg/mL白藜蘆醇幾乎完全抑制了AGEs的生成[38]。采用體外制備的AGEs建立人臍靜脈內(nèi)皮細胞損傷模型給予白藜蘆醇干預后，發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇能夠明顯抑制細胞色素C的釋放和細胞caspase-3的活性，明顯降低了AGEs介導的內(nèi)皮細胞損傷[39]。ZHANG等[40]用100 mg/L的AGEs和10 μmol/L白藜蘆醇同時干預巨噬細胞24 h，與模型組比發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇能夠明顯抑制細胞內(nèi)RAGE的表達，降低了AGEs-RAGE信號通路激活引起的細胞損傷。在2型糖尿病大鼠動物模型中給予白藜蘆醇灌胃30 d，結果發(fā)現(xiàn)10 mg·kg-1·d-1劑量的白藜蘆醇能夠明顯降低糖尿病大鼠體內(nèi)丙二醛、血糖、RAGE水平，明顯提高總抗氧化能力和胰島素水平[41]，表明白藜蘆醇通過降低氧化應激和下調(diào)RAGE的表達對糖尿病大鼠具有保護作用。

5 小 結

目前，關于AGEs的干預主要包括AGEs生成抑制劑、AGEs裂解劑、RAGE阻斷劑和抗氧化劑。然而，還沒有以AGEs為靶點的臨床治療藥物，因此深入研究AGEs在糖尿病及其并發(fā)癥中的作用機制具有重要意義，可能為防治糖尿病及其并發(fā)癥提供新的靶點。