天然?；撬釋Ω斡不T靜脈高壓大鼠門靜脈血流動力學(xué)及內(nèi)皮細(xì)胞的影響▲

(廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院感染一科，南寧市 530011，電子郵箱：dwx857@163.com)

肝硬化門靜脈高壓(portal hypertension，PHT)以門靜脈系統(tǒng)壓力升高為主要特點(diǎn)，常引起腹水、脾腫大、肝性腦病等并發(fā)癥，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量，是臨床死亡的主要原因之一。門靜脈系統(tǒng)血流紊亂是PHT發(fā)病機(jī)制之一，門靜脈內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)襯于脈管的內(nèi)壁，是最早感受血流變化并產(chǎn)生應(yīng)答的效應(yīng)細(xì)胞[1]。有研究表明內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)的血管活性物質(zhì)與PHT的形成及維持密切相關(guān)[2-3]。因此研究血流動力學(xué)及效應(yīng)內(nèi)皮細(xì)胞具有重要價值，也一直是PHT研究的熱點(diǎn)。我們在前期研究中發(fā)現(xiàn)，結(jié)合?；撬岷吞烊慌；撬峋幸种聘卫w維化的作用[4-7]。本研究通過觀察天然?；撬釋HT大鼠血流動力學(xué)及其效應(yīng)內(nèi)皮細(xì)胞的影響，進(jìn)一步探討PHT形成的機(jī)制及治療方法。

1 材料及方法

1.1 動物及藥物 實(shí)驗(yàn)用無特定病原體級雄性SD大鼠80只，6～7周齡，體重(180±20)g，由廣西醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供，動物合格證：SCXK桂2009-0002。天然?；撬釣椴捎脽崴崛》╗8]從烏蛤肉中提取而得，采用紅外光譜儀鑒定藥品質(zhì)量，純度要求達(dá)到98.5%以上。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 MFV-3200型電磁流量計(jì)、RM-6300型八道生理記錄儀購自日本Nihon Kohden公司，壓力換能器、SMUP-PC型生物信號處理系統(tǒng)、計(jì)算機(jī)圖像分析軟件MP-100、MFLab 2.00數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)由廣西中醫(yī)藥大學(xué)生理教研室提供(西安明克斯檢測設(shè)備有限公司)，MT-2型熒光倒置顯微鏡、顯微攝像及錄像系統(tǒng)購自O(shè)lympus公司，TSD145型激光多普勒組織灌注圖像儀購自美國BIOPAC公司，H-7650型透射電子顯微鏡購自日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 建立動物模型：采用復(fù)合因素法建立肝硬化PHT大鼠模型，首次按0.5 ml/100 g體重給予大鼠腹部皮下注射60%橄欖油+40%四氯化碳混合液后，每隔3 d按0.3 ml/100 g體重皮下注射給藥1次(配方同上)，15%酒精為唯一飲料，同時輔以20%豬油、0.5%膽固醇、79.5%玉米面混合飼料喂養(yǎng)。造模8周后，按隨機(jī)數(shù)字表法抽3只大鼠行門靜脈血流及肝臟組織病理學(xué)檢測，確定肝硬化PHT模型制備成功(以肝臟組織病理學(xué)檢查可見大小不等的假小葉形成為制備成功)后進(jìn)行后續(xù)干預(yù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 分組與干預(yù)：建模成功后按隨機(jī)數(shù)字表法抽取45只肝硬化PHT大鼠，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為結(jié)合?；撬峤M(A組)、天然?；撬峤M(B組)和對照組，每組15只，A組按0.6 g/(kg·d)給予?；撬峁辔?，B組按0.6 g/(kg·d)給予天然牛磺酸灌胃，對照組大鼠給予相同劑量0.9%氯化鈉溶液灌胃，療程均為21 d。

1.3.3 肝臟血流灌注量(hepatic perfusion volume,HPV)測定：最后一次給藥后當(dāng)晚大鼠禁食，次日用10%水合氯醛按0.3 ml/100 g腹腔注射麻醉。將大鼠以仰臥位四肢無創(chuàng)固定于實(shí)驗(yàn)臺上，腹部及頸部剪毛，消毒鋪巾，取劍突下正中切口，剪開腹壁，暴露肝臟，肝臟周圍以溫生理鹽水紗布包裹，以20滴/min的速度在紗布表面持續(xù)滴39℃的0.9%氯化鈉溶液，實(shí)驗(yàn)室溫度控制在24℃～26℃，濕度控制在35%～40%，使肝臟盡量處于接近生理的環(huán)境。打開激光多普勒組織灌注圖像儀和組織灌注圖像軟件，固定激光探頭與肝臟表面相距約10 cm，保證激光垂直照射到肝臟表面，注意控制實(shí)驗(yàn)室的光線強(qiáng)度。計(jì)算機(jī)控制激光探頭自動掃描肝臟表面，檢測記錄肝臟微循環(huán)血液灌流量3 min，連續(xù)監(jiān)測兩次，取平均值。

1.3.4 門靜脈血流動力學(xué)的測定：檢測肝臟血液灌流量后，逐層剝離門靜脈表面組織，游離出門靜脈主干，一側(cè)插入適宜的電磁探頭，電磁流量計(jì)測量門靜脈血流量(portal venous flow，PVF)，待血流穩(wěn)定后，測量5次取其平均值。游離腸系膜靜脈，插入PV-50導(dǎo)管至門靜脈主干，通過壓力換能器，應(yīng)用八道生理記錄儀測定門靜脈壓力(portal venous pressure，PVP)、門靜脈阻力(portal vein resistance，PVR)及平均動脈壓(mean arterial pressure，MAP)。操作過程室溫均保持24℃～26℃，檢測前用肝素鈉-生理鹽水溶液沖洗各種導(dǎo)管。記錄大鼠血流動力學(xué)數(shù)據(jù)并輸入計(jì)算機(jī)，采用MFLab 2.00生理學(xué)實(shí)驗(yàn)軟件包處理數(shù)據(jù)。

1.3.5 門靜脈內(nèi)皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的觀察：取相同部位新鮮門靜脈主干，切成大小約1 mm×1 mm×1 mm標(biāo)本，置于4℃預(yù)冷的4%戊二醛，固定24 h，再經(jīng)1%四氧化鋨固定2 h，常規(guī)乙醇和丙酮脫水，加丙酮-環(huán)氧樹脂812環(huán)氧樹脂包埋，修塊及切片，鈾-鉛染色，透視電鏡下觀察門靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t法。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 3組大鼠門靜脈血流動力學(xué)指標(biāo)比較 A組及B組PVP、PVR、PVF均低于對照組(均P<0.05)，見表1。對照組、A組、B組MAP、HPV水平依次升高(P<0.05)，見表2。

表1 3組大鼠PVP、PVR、PVF比較(x±s)

注：與對照組比較，*P<0.05。

表2 3組大鼠MAP及HPV比較(x±s)

注：與對照組比較，*P<0.05，與A組比較，#P<0.05。

2.2 3組大鼠門靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu) 對照組大鼠門靜脈內(nèi)皮細(xì)胞有不同程度變性，細(xì)胞核變性或脫落，基底膜完整性遭到破壞，連接松散；A組門靜脈內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核基本正常，但基底膜較厚；B組大鼠門靜脈內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，基底膜無增厚，細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核正常。見圖1。

圖1 3組大鼠門靜脈內(nèi)皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)(透視電子顯微鏡，×15 000)

3 討 論

門靜脈系統(tǒng)血流動力學(xué)的紊亂是PHT形成與進(jìn)展的重要機(jī)制之一，“后向血流”與“前向血流”是PHT發(fā)病機(jī)制的兩種學(xué)說。“后向血流”學(xué)說認(rèn)為肝內(nèi)血管收縮和舒張調(diào)節(jié)失衡導(dǎo)致門脈血管阻力的增加是PHT形成與進(jìn)展的主要決定因素?！扒跋蜓鳌睂W(xué)說認(rèn)為門靜脈高壓的始動因子是周邊血管擴(kuò)張，MAP降低，血管阻力降低，血容量增多，從而形成全身高動力循環(huán)綜合征。這兩種機(jī)制在PHT的形成中均發(fā)揮了重要的作用[9-10]。

內(nèi)皮細(xì)胞是血流接觸的效應(yīng)細(xì)胞，其誘導(dǎo)產(chǎn)生的血管活性物質(zhì)一氧化氮(nitric oxide，NO)及一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)與PHT的形成密切相關(guān)[3]。正常情況下NO、NOS與內(nèi)皮素-1(endothelin-1，ET-1)處于相對平衡狀態(tài)[11]。我們在前期研究中發(fā)現(xiàn)[2]，PHT形成后，門靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷變性，其分泌的血管活性物質(zhì)(如NO、NOS與ET-1)平衡失調(diào)，血漿中NO、NOS水平升高而ET-1水平降低，使PHT得以維持或惡化，這與PHT的“前向血流”學(xué)說相似。本研究結(jié)果顯示：與大鼠相關(guān)指標(biāo)正常參考值[2,7]比較，肝硬化PHT大鼠PVP、PVR、PVF升高，MVP降低，門靜脈內(nèi)皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)異常，符合PHT “前向血流” 機(jī)制學(xué)說；而HPV下降，則說明肝內(nèi)血管收縮和舒張失調(diào)，符合“后向血流”機(jī)制學(xué)說。因此圍繞PHT的“后向血流”與“前向血流”機(jī)制學(xué)說，恢復(fù)和維持肝臟及門脈系統(tǒng)正常血流動力學(xué)，是預(yù)防和治療PHT的重要措施。

目前西藥治療PHT的途徑較單一，而中醫(yī)藥治療具有多途徑、多環(huán)節(jié)、多靶向干預(yù)的特點(diǎn)，針對PHT發(fā)生機(jī)制中的多個環(huán)節(jié)起作用，可彌補(bǔ)西醫(yī)作用途徑單一的缺點(diǎn)。天然?；撬釓臑醺蛉庵刑崛?，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明其具有解毒護(hù)肝抗腫瘤、增強(qiáng)機(jī)體免疫功能等作用，大劑量使用無相關(guān)不良反應(yīng)。我們的前期研究顯示，天然牛磺酸可減輕肝細(xì)胞炎癥反應(yīng)及肝臟線粒體脂質(zhì)過氧化，改善肝臟微循環(huán)，降低肝內(nèi)血管阻力，從而抑制PHT[4-7]。

本研究結(jié)果顯示，天然牛磺酸和結(jié)合?；撬峋筛纳聘斡不疨HT大鼠門靜脈血流動力學(xué)指標(biāo)(PVP、PVR、PVF)，而天然牛磺酸改善MVP及HPV的效果優(yōu)于結(jié)合?；撬?P<0.05)，改變門靜脈內(nèi)皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的效果更佳。這些提示天然?；撬嵩诟纳芇HT大鼠的“后向血流”效果優(yōu)于結(jié)合?；撬?，而其逆轉(zhuǎn)PHT的作用機(jī)制可能與同時干預(yù)“后向血流”與“前向血流”有關(guān)。

綜上所述，天然?；撬峥蓽p輕肝硬化PHT大鼠門靜脈壓力，改善效應(yīng)內(nèi)皮細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)，且其效果優(yōu)于結(jié)合?；撬帷１狙芯恐饕^察天然?；撬釋ρ鲃恿W(xué)指標(biāo)及內(nèi)皮細(xì)胞的影響，但肝硬化PHT病因及發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚，“后向血流”與“前向血流”學(xué)說蘊(yùn)含多學(xué)科的交叉融合，涉及細(xì)胞分子水平、蛋白、生物力學(xué)及各種信號傳導(dǎo)因子等，今后將從這幾方面進(jìn)一步深入研究天然?；撬嶂委煂Ω斡不疨HT的作用機(jī)制。