用生理鹽水作稀釋液解決1例血小板聚集現(xiàn)象的案例報道

粟玉鳳，李泉

（重慶市長壽區(qū)人民醫(yī)院檢驗科，重慶 401220）

血小板減少是指血液中血小板計數(shù)＜100×109/L。血小板減少見于多種血液性疾病、風濕免疫病、放化療損傷及藥物相關(guān)性血小板減少。血小板聚集（platelet aggregation, PAg）是指血小板與血小板之間的粘附，顯示活化的血小板相互作用聚集成團的特征。在富含血小板的血漿（PRP）或全血（WB）中，加入致聚劑（亦稱誘導劑）連續(xù)攪拌能誘發(fā)這種現(xiàn)象，當血小板發(fā)生聚集，臨床檢測就會顯示出血小板減少，根據(jù)血小板減少程度可出現(xiàn)不同臨床表現(xiàn)：輕者可有皮膚出血點、淤斑，牙齦滲血、鼻衄，重者可表現(xiàn)為臟器出血：如嘔血、黑便、血尿及腦出血等。因此臨床工作中，準確計數(shù)血小板對病人的病情診斷有著舉足輕重的作用。本文將臨床工作中發(fā)現(xiàn)的一例假性血小板減少及其計數(shù)分析處理方法報道如下。

1 資料

一位老年男性患者以“外院提示血小板減少：13×109/L，無皮膚散在瘀斑，無牙齦口腔出血等”在我院腎臟血液內(nèi)科收診入院，主訴類風濕關(guān)節(jié)炎10+年，右手可見鵝頸樣畸形，無其他特殊疾病或體征。入院后行常規(guī)檢查，大小便均正常，無血尿，血常規(guī)使用邁瑞B(yǎng)C 6900檢查，血小板計數(shù)為3×109/L，凝血象正常。遇到此種情況我們按照常規(guī)流程從分析前、分析中和分析后進行規(guī)范處理。

2 診療經(jīng)過

首先分析前，釆血試管為EDTA抗凝管，顛倒試管無凝塊，故排除分析前因抽血等操作問題。其次分析中：（1）操作原因，檢驗者按SOP操作，白細胞紅細胞等計數(shù)均正常，故可排除因操作導致吸樣不足；（2）分析中儀器原因，因BC 6900血小板計數(shù)方法使用的是RBC通道即鞘流阻抗法[1]，為排除將大血小板誤認為紅細胞，故使用RET通道雙方法校驗血小板，排除儀器原因。復查后顯示PLT計數(shù)為5×109/L。檢測后分析血小板直方圖，存在血小板聚集可能，故手工推片，發(fā)現(xiàn)整片中存在明顯血小板成堆聚集現(xiàn)象，鏡下血小板數(shù)明顯高于儀器檢測值。

為準確計數(shù)病人血小板。與患者溝通后，我們后續(xù)均采用床旁釆血檢測。首先分別使用肝素和枸櫞酸鈉抗凝管（排除EDTA抗凝劑導致的血小板體外粘附聚集現(xiàn)象）[2]重新采取病人新鮮血液進行檢測，結(jié)果顯示PLT計數(shù)仍然極低：10×109/L，推片復查仍然存在明顯聚集成團現(xiàn)象，無法準確手工計數(shù)。與骨髓檢查中存在血小板聚集現(xiàn)象相符。血小板手工計數(shù)SOP為[3]：（1）于清潔試管中計入稀釋液0.38 mL；（2）準確吸取毛細血管血20 μL，擦去管外附著血液，置于血小板稀釋液內(nèi)，立即充分混勻；（3）取上述均勻的血小板懸液1滴，注入計數(shù)池，靜置10 min-15 min，使血小板下沉；（4）用高倍鏡計數(shù)5個中方格內(nèi)血小板數(shù)，每升血液內(nèi)血小板數(shù)=N×5×10×20×106。

此病例常規(guī)手工計數(shù)仍然存在血小板聚集現(xiàn)象。因此在此基礎(chǔ)之上，我們將含EDTA及1%草酸銨的溶血稀釋液替換成生理鹽水（等滲生理鹽水不僅可有效模擬體內(nèi)環(huán)境，且能規(guī)避紅細胞碎片對血小板影響），并加大了稀釋倍數(shù)，同時使用常規(guī)稀釋液設(shè)置對照，分別稀釋成1:20、1:50、1:100、1:200、1:400五個不同倍數(shù)，進行手工計數(shù)。多次反復操作計數(shù)后發(fā)現(xiàn)：①含EDTA及1%草酸銨的溶血稀釋液稀釋后進行血小板計數(shù)，5個稀釋濃度均在鏡下仍可見血小板聚集現(xiàn)象。②生理鹽水作稀釋液稀釋后進行血小板計數(shù)，1:20仍可見血小板聚集成堆現(xiàn)象，從1:50聚集現(xiàn)象明顯減少，但仍可見少量聚集。1:100及后續(xù)稀釋倍數(shù)均未見血小板聚集現(xiàn)象。③生理鹽水作稀釋液，稀釋倍數(shù)為1:100時能充分解聚血小板，并且每個方格分布均勻，故1:100為該患者最佳稀釋倍數(shù)。多次重復此操作，平均計數(shù)值得到血小板數(shù)為：102×109/L。此時，發(fā)出該患者報告。后連續(xù)兩日抽取該患者新鮮血液，按此方法檢查得到血小板數(shù)分別為：105×109/L和106×109/L。計數(shù)結(jié)果同鏡下顯示數(shù)量相符且穩(wěn)定，該假性血小板聚集現(xiàn)象得到了解決。

3 討論

該患者血小板計數(shù)得到了解決，但血小板聚集的原因尚未查出。經(jīng)查閱文獻顯示：血小板假性減少現(xiàn)象主要分為以下幾類原因；第一種原因是據(jù)文獻顯示使用國際血液學標準化委員會推薦EDTA鹽抗凝劑導致的血小板聚集現(xiàn)象的發(fā)生[4]，但形成機制并不明確，只有幾種假說進行推斷；第二種原因是大血小板被儀器誤計為紅細胞。第三種原因血小板粘附在白細胞周圍即所謂的血小板衛(wèi)星現(xiàn)象，多數(shù)認為與免疫機制有關(guān)；第四種原因是我們采血原因?qū)е碌难“灞换罨鹧旱牟糠帜斐?；近年來也有觀點認為該現(xiàn)象可能與血漿中的抗PLT抗體和抗心磷脂抗體等自身抗體，以及與血小板表面存在某種隱匿性抗原有關(guān)[5]。由于該患者有類風濕性關(guān)節(jié)炎RA病史，且其生化結(jié)果顯示類風濕因子RF為62.30 IU/mL（參考范圍0-30），Anti-CCP為45.8 U/mL（參考范圍0 U/mL-35 U/mL）明顯增高，免疫球蛋白κ和λ也顯著增高，與其自身抗體ANA結(jié)果顯示為強陽性2.36（參考范圍0-1）相吻合。因此，該患者血小板減少的可能原因是在某種狀態(tài)下，靜息的血小板被活化，活化后的血小板膜表面某種隱匿性抗原表位構(gòu)象發(fā)生改變，與存在血漿中的自身抗體相結(jié)合，激活細胞膜中的磷脂酶A2和磷脂酶C，水解血小板膜磷脂并釋放花生四烯酸、5-羥色胺、膠原、凝血酶原等活性物質(zhì)。這些活性物質(zhì)能活化血小板纖維蛋白原受體，促使血小板與纖維蛋白原聚集成堆[6,7]。這種現(xiàn)象在自身免疫性疾病及腫瘤患者人群中較為常見，而在健康體檢人群中出現(xiàn)此類現(xiàn)象甚少。這種現(xiàn)象可以一直伴隨患者，也可以是一過性的[6]。

結(jié)合該案例，患者無皮膚出血等臨床癥狀，表明是血小板在體外被激活而出現(xiàn)的體外假性血小板聚集現(xiàn)象。在該案例中我們使用生理鹽水替代含EDTA及1%草酸銨的溶血稀釋液，是由于生理鹽水同人體血液為等滲環(huán)境，能較好的還原體內(nèi)狀態(tài)；且可能在一定程度上對粘附在血小板上的相關(guān)抗體進行了洗滌；將1:20的稀釋倍數(shù)擴大為1:100，不僅可以盡可能減少紅細胞對計數(shù)血小板的影響，也能夠?qū)ρ獫{中自身抗體進行了一定的稀釋，故在此三者因素相加之下，解聚了血小板聚集現(xiàn)象，從而能有效地進行血小板鏡下計數(shù)。

隨著近年來醫(yī)療科技水平的不斷提升，自動化的血細胞分析儀已成為各級醫(yī)療機構(gòu)的標配，促進了檢驗科工作效率的成倍提升。針對血小板假性減少的問題盡管各實驗室均制定有相應復檢制度，但就此類病例來說，若我們只按常規(guī)方法、思路并且結(jié)合患者情況，又多次檢查發(fā)現(xiàn)PLT減低現(xiàn)象，而發(fā)出血小板減少報告，必定會誤導臨床將患者收治入院后輸注血小板。

該案例為我們提供了在檢驗工作應對此類血小板減少的新思路。在排除儀器、抗凝劑及人為因素后，使用生理鹽水替代含EDTA及1%草酸銨的溶血稀釋液，并適當加大手工計數(shù)稀釋倍數(shù)的計數(shù)手段也可作為一種常規(guī)的處理假性血小板聚集的新方法。該方法試劑制備簡單，操作方便，結(jié)果有據(jù)可依，可作為處理此類疑難雜癥的候選好方法[8,9]。手工鏡檢仍是金標準，我們應加以持續(xù)重視，有效的手工鏡檢是檢驗報告不可或缺的重要手段。