高效液相色譜法測定羊奶中五種氟喹諾酮類藥物殘留量的研究

李丹,張玉潔,孫志文,王鶴佳,李倩,仲鋒*

(1、中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081；2、北京市獸藥監(jiān)察所，北京102629)

高效液相色譜法測定羊奶中五種氟喹諾酮類藥物殘留量的研究

李丹1,張玉潔1,孫志文2,王鶴佳1,李倩1,仲鋒1*

(1、中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081；2、北京市獸藥監(jiān)察所，北京102629)

建立了一種可同時檢測羊奶中五種氟喹諾酮類藥物(環(huán)丙沙星、達氟沙星、恩諾沙星、沙拉沙星、二氟沙星)殘留的高效液相色譜—熒光檢測法。羊奶樣品經(jīng)乙腈提取，正己烷去脂肪，C18柱凈化。以0.05 mol/L磷酸三乙胺溶液和乙腈溶液為流動相，流速為0.8 mL/min，激發(fā)波長280 nm，發(fā)射波長450 nm。結(jié)果表明環(huán)丙沙星、恩諾沙星、沙拉沙星、二氟沙星在10～200 ng/mL，達氟沙星在2～40 ng/mL呈良好的線性關(guān)系，R2均大于0.999。環(huán)丙沙星、恩諾沙星、沙拉沙星、二氟沙星的最低定量限為30 μg/kg，達氟沙星的最低定量限為6 μg/kg。環(huán)丙沙星、恩諾沙星、沙拉沙星、二氟沙星在30～200 μg/kg的濃度添加水平上，達氟沙星在6～40 μg/kg的濃度添加水平上其回收率均在70～100 %，批內(nèi)、批間的相對標準偏差小于20 %。該方法簡單快速、靈敏度高、重復(fù)性好，適用于羊奶中五種氟喹諾酮類藥物殘留檢測。

高效液相色譜法；氟喹諾酮類藥物；殘留；羊奶

環(huán)丙沙星、達氟沙星、恩諾沙星、沙拉沙星和二氟沙星均屬于氟喹諾酮類抗菌藥物，該類藥物具有高效、廣譜、低毒等特點，在畜牧業(yè)養(yǎng)殖業(yè)中廣泛用于預(yù)防與治療動物疾病[1]。隨著喹諾酮類藥物在人醫(yī)和獸醫(yī)應(yīng)用的增加，其各種毒副作用也逐漸顯現(xiàn)出來，美國自20世紀80年代中期至今已使用1億人次以上，氟喹諾酮類藥物的嚴重不良反應(yīng)年發(fā)生率約1/3500。日本對氟喹諾酮的開發(fā)研究中，副作用發(fā)生率為1.6%～4.8%[2]。因此通過有效的技術(shù)手段，對動物性食品中的有關(guān)氟喹諾酮類藥物殘留進行檢測，以確保人類對動物性食品消費的安全，具有十分重要的意義。為加強獸藥殘留監(jiān)控工作，保證動物性食品衛(wèi)生安全，農(nóng)業(yè)部于2002年發(fā)布第235號公告《動物性食品中獸藥最高殘留限量》中規(guī)定達氟沙星在羊奶中的最高殘留限量(MRL)為30 μg/kg；恩諾沙星和環(huán)丙沙星在羊奶中的最高殘留限量(MRL)為100 μg/kg[3]。

目前，有關(guān)FQs多殘留在動物組織中的檢測方法，國內(nèi)外已有諸多報道。主要是通過高效液相色譜法，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法及熒光檢測器檢測[4-6]，但是采用高效液相色譜法同時檢測羊奶中環(huán)丙沙星、達氟沙星、恩諾沙星、沙拉沙星和二氟沙星殘留的方法尚未見報道。本研究旨在建立一種操作步驟簡單，并可滿足同時檢測羊奶中五種氟喹諾酮類藥物的多殘留分析方法。

1 材料與方法

1.1 標準品、主要試劑及其配制 環(huán)丙沙星、達氟沙星、恩諾沙星、二氟沙星對照品,中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，含量≥99.0%；沙拉沙星對照品,中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，含量≥95.0%。乙腈(色譜純)、正己烷(色譜純)、正丙醇(色譜純),美國Fisher公司；磷酸二氫鉀(分析純)、磷酸(分析純)、三乙胺(分析純),國藥集團化學試劑有限公司；C18固相萃取柱：100 mg/mL；水,美國Millipore超純水儀制備，符合GB/T 6682-1992規(guī)定的一級水。

環(huán)丙沙星、達氟沙星、恩諾沙星、沙拉沙星和二氟沙星標準儲備液：分別稱取環(huán)丙沙星、恩諾沙星、沙拉沙星和二氟沙星對照品約50 mg，達氟沙星約10 mg,精密稱定，于50 mL量瓶中，用0.03 mol/L氫氧化鈉溶解并稀釋成含達氟沙星0.2 mg/mL、含環(huán)丙沙星、恩諾沙星、沙拉沙星和二氟沙星1 mg/mL的標準儲備液。

環(huán)丙沙星、達氟沙星、恩諾沙星、沙拉沙星和二氟沙星標準工作液：準確量取適量標準儲備液，用乙腈溶解并稀釋成濃度為2 μg/mL的標準工作液(達氟沙星濃度為0.4 μg/mL)。

1.2 主要儀器 Agilent 1100高效液相色譜儀(配熒光檢測器)美國安捷倫公司；AE 240型分析天平； Biofuge Stratos高速冷凍離心機德國賀利氏公司；IKEA渦動混合儀；IKA-WERKE振蕩器。

1.3 方法

1.3.1 樣品的提取 稱取(2±0.05) g試料，置50 mL離心管中，乙腈5 mL，正己烷8 mL，渦旋混勻，中速振蕩5 min，10000 r/min離心10 min，上清液轉(zhuǎn)入50 mL雞心瓶中，殘渣再用乙腈5 mL提取一遍，合并兩次提取液，加正丙醇3 mL，于55 ℃水浴下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，加pH7.0磷酸鹽緩沖液10 mL溶解，備用。

1.3.2 樣品的凈化 C18柱用甲醇2 mL、水2 mL預(yù)洗。取備用液3.0 mL過柱，用水1 mL洗，擠干。流動相1.0 mL洗脫，混勻，過濾膜，供高效液相色譜法測定。

1.3.3 色譜操作條件及參數(shù) 色譜柱: Hypersil C18(250 mm×4.6 mm,i.d )，粒徑5 μm，或相當者；流動相為0.05 mol/L磷酸三乙胺溶液—乙腈液(82∶18,v/v)；流速: 0.8 mL/min；檢測波長: 激發(fā)波長280 nm，發(fā)射波長450 nm；柱溫：30 ℃，進樣量: 20 μL。1.3.4 標準曲線的制備 準確量取適量的環(huán)丙沙星等五種標準工作液，用流動相稀釋成含環(huán)丙沙星、恩諾沙星、沙拉沙星和二氟沙星濃度分別為10、20、60、100、150、200 ng/mL，達氟沙星濃度分別為2、4、12、20、30、40 ng/mL的系列混合標準溶液，進樣分析繪制標準曲線，并計算回歸方程及相關(guān)系數(shù)。

1.3.5 回收率及精密度的測定 采用標準添加法，稱取羊奶樣品，置于50 mL離心管中，添加適宜濃度的環(huán)丙沙星等五種標準工作液，環(huán)丙沙星、恩諾沙星、沙拉沙星和二氟沙星在羊奶中的藥物濃度為30、100、200 ug/kg；達氟沙星在羊奶中的藥物濃度為6、20、40 ug/kg。每種濃度5個樣品，重復(fù)3批次，按照1.3.1和1.3.2的方法處理后，供HPLC測定，外標法定量，計算回收率、批內(nèi)、批間變異系數(shù)。

1.3.6 檢測限和定量限的測定 對環(huán)丙沙星等五種標準工作液，進行HPLC分析，并逐漸降低濃度，以溶液檢測時的信噪比(S/N)分別大于等于3和10作為藥物的檢測限和定量限。并計算定量限濃度點的回收率及批內(nèi)、批間相對標準偏差，驗證其可靠性[7]。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜分離 在優(yōu)化的色譜條件下，測得羊奶中環(huán)丙沙星、達氟沙星、恩諾沙星、沙拉沙星和二氟沙星色譜峰峰形好，峰間隔時間較長，且均達到基線分離?？瞻捉M織樣品在上述時間無干擾峰出現(xiàn)，色譜圖見圖1。

圖1 羊奶中環(huán)丙沙星、達氟沙星、恩諾沙星、沙拉沙星和二氟沙星的高效液相色譜圖

2.2 標準曲線 分別以環(huán)丙沙星、達氟沙星、恩諾沙星、沙拉沙星和二氟沙星的色譜峰面積與其對應(yīng)的對照溶液的質(zhì)量濃度作圖，得到相應(yīng)的標準曲線。環(huán)丙沙星、恩諾沙星、沙拉沙星和二氟沙星在30～200 μg/kg的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，達氟沙星在6～40 μg/kg的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，色譜峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系。線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)見表1。

表1 環(huán)丙沙星、達氟沙星、恩諾沙星、沙拉沙星、二氟沙星的回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍

2.3 樣品的回收率及精密度

表2 環(huán)丙沙星、達氟沙星、恩諾沙星、沙拉沙星、二氟沙星在羊奶中的回收率(n=5)

由表2可以看出羊奶中環(huán)丙沙星、恩諾沙星、沙拉沙星、二氟沙星添加濃度水平分別為30、100、200 μg/kg時，平均回收率分別在70.8%～74.7%，88.6%～94.9%，74.5%～79.0%，81.4%～83.6%范圍內(nèi)，批內(nèi)、批間的RSD分別低于5.98%、6.29%；8.08%、9.69%；9.68%、10.7%；10.2%、10.8%；達氟沙星添加濃度水平分別為6、20、40 μg/kg時，平均回收率分別在71.1%～83.2%范圍內(nèi)，批內(nèi)、批間的RSD分別低于9.90%、9.93%。結(jié)果表明該方法可靠，重復(fù)性高。

2.4 靈敏度 應(yīng)用本試驗建立的檢測方法，測得羊奶中環(huán)丙沙星、恩諾沙星、沙拉沙星、二氟沙星的檢測限、定量限分別為9 μg/kg(S/N≥3)、30 μg/kg(S/N≥10)，達氟沙星的檢測限、定量限分別為1.8 μg/kg(S/N≥3)、6 μg/kg(S/N≥10)。由表2可見，添加濃度為30 μg/kg時，環(huán)丙沙星、達氟沙星(添加濃度為6 μg/kg)、恩諾沙星、沙拉沙星、二氟沙星在羊奶中的平均回收率均大于71.1 %，批內(nèi)、批間的RSD分別低于10.2%、10.8%。表明該方法在定量限水平的可靠性好，且靈敏度高，完全滿足環(huán)丙沙星、達氟沙星、恩諾沙星、沙拉沙星、二氟沙星在羊奶中殘留檢測的需要。

3 討論與小結(jié)

3.1 色譜條件的選擇 參考國內(nèi)外有關(guān)資料，經(jīng)過反復(fù)試驗摸索，氟喹諾酮類藥物在酸性條件下，具有較強的熒光吸收。因此，確立用高效液相色譜儀熒光檢測器，激發(fā)波長為280 nm；發(fā)射波長為450 nm；流動相為0.05 mol/L磷酸/三乙胺—乙腈液。為達到分離度要求，在試驗過程中調(diào)整流動相中有機相濃度比例，最后確立0.05 mol/L磷酸/三乙胺—乙腈液(82∶18)等度洗脫。

3.2 樣品提取與凈化方法的優(yōu)化 在方法的提取研究過程中，對樣品的提取液進行了實驗摸索，采用酸性乙腈、堿性乙腈及純乙腈溶液進行提取實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，純乙腈提取效果非常理想，對不同濃度的添加實驗其回收率均高于70%，達到了殘留檢測的要求，因此，確立乙腈作為提取液。在去脂過程中，對正己烷、異辛烷的去脂效果進行了對比研究，結(jié)果表明正己烷的去脂效果優(yōu)于異辛烷，同時對于正己烷的用量進行了優(yōu)化選擇，結(jié)果表明8 mL正己烷的加入去脂效果最好。此外，在樣品提取過程中，對離心機使用的轉(zhuǎn)速和時間進行了對比試驗，發(fā)現(xiàn)兩次離心過程中，離心機轉(zhuǎn)速為10000 r/min，離心時間為10 min的樣品除雜效果明顯優(yōu)于離心機轉(zhuǎn)速為10000 r/min，離心時間為5 min及轉(zhuǎn)速為5000 r/min，離心時間為5 min或10 min。

在方法的凈化研究過程中，提取液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干后，用流動相溶解，過濾膜直接進樣分析，發(fā)現(xiàn)樣品基質(zhì)干擾特別嚴重，達不到基本分離的要求，因此確定采用固相萃取技術(shù)進行樣品的凈化。實驗過程中，對HLB，C18等固相萃取柱及不同柱規(guī)格進行了摸索和比較研究，最終發(fā)現(xiàn)C18，100 mg/mL規(guī)格的萃取柱對樣品的凈化效果最好，最大程度地降低了樣品基質(zhì)對有效成分的干擾，使得環(huán)丙沙星、達氟沙星、恩諾沙星、沙拉沙星、二氟沙星在羊奶中的殘留檢測技術(shù)參數(shù)(靈敏度、精密度、準確度)均達到了獸藥殘留檢測方法的要求。

3.3 方法的回收率及靈敏度 本試驗中環(huán)丙沙星、恩諾沙星、沙拉沙星、二氟沙星的添加濃度范圍為30～200 μg/kg時，回收率在70.8%～94.9%范圍內(nèi)，批內(nèi)和批間RSD分別低于10.2%、10.8%，達氟沙星的添加濃度范圍為6～40 μg/kg時，回收率在71.1%～83.2%范圍內(nèi)，批內(nèi)和批間RSD分別低于9.90%、9.93%，符合農(nóng)業(yè)部對獸藥殘留試驗規(guī)范中的要求[8]。通過添加定量限濃度點對其可靠性進行驗證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)環(huán)丙沙星、達氟沙星、恩諾沙星、沙拉沙星、二氟沙星在羊奶中的回收率均大于71.1%，批內(nèi)、批間的RSD分別低于10.2%、10.8%。表明該方法在定量限水平的可靠性好，且靈敏度高，完全滿足環(huán)丙沙星、達氟沙星、恩諾沙星、沙拉沙星、二氟沙星在羊奶中殘留檢測的需要。

本研究建立了一種同時檢測羊奶中五種氟喹諾酮類藥物的多殘留分析方法。本試驗條件下，表明該方法靈敏可靠，完全滿足羊奶中環(huán)丙沙星、達氟沙星、恩諾沙星、沙拉沙星、二氟沙星的殘留檢測要求。

[1] 陳杖榴. 獸醫(yī)藥理學(第二版) [M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2002: 282.

[2] 吳永寧，邵兵，沈建忠.獸藥殘留檢測與監(jiān)控技術(shù)[M].北京，化學工業(yè)出版社，2007:402.

[3] 中華人民共和國農(nóng)業(yè)部.動物性食品中獸藥最高殘留限量[S].

[4] 董志遠，趙曉鳳，宮秀杰等. 牛奶中氟喹諾酮類藥物殘留量檢測方法研究[J]. 北京：中國獸藥雜志，2008(10): 14-16.

[5] 孫雷，朱馨樂，張驪,等. 牛奶中七種氟喹諾酮類藥物殘留檢測高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法研究[J]. 北京：中國獸藥雜志，2008(11): 16-19.

[6] 李丹，張玉潔，仲鋒等. 雞蛋中氟喹諾酮類藥物殘留量檢測方法研究[J]. 北京：中國獸藥雜志，2010(6): 1-4.

[7] 李俊鎖，邱月明，王超.獸藥殘留分析[M].上海：上?？茖W技術(shù)出版社，2002:40.

[8] 中華人民共和國農(nóng)業(yè)部.關(guān)于發(fā)布《獸藥殘留試驗技術(shù)規(guī)范(試行)》的通知[S].

(編輯：陳希)

Study on Detection Method Quinolones Residues in Sheep Milk by HPLC

LI Dan1, ZHANG Yu-jie1, SUN Zhi-wen2, WANG He-jia1, LI Qian1, ZHONG Feng1*

(1.ChinaInstituteofVerterinaryDrugControl，Beijing，100081;2.BeijingveterinarydrugmonitoringInstitute，Beijing，102629)

A method for determination of quinolones residues in sheep milk with HPLC by FLD detection was established. Ciprofloxacin、danofloxacin 、enrofloxacin、sarafloxacin and difloxacin were extracted from sheep milk with acetonitrile and degreased in hexane, dissolved with pH7.0 phosphate solution after evaporation, then the solution was purified with C18 column. The mobile phase were 0.05 mol/L triethylammonium phosphate solution and acetonitrile, the flow rate was 0.8 mL/min .Fluorescence detection was carried out at excitation and emission wavelengths of 280 nm and 450 nm . A good linearity of the calibration curve was obtained with the range of 10～200 ng/mL for ciprofloxacin、enrofloxacin、sarafloxacin and difloxacin, and 2～40 ng/mL for danofloxacin(R2>0.999). The limit of quantification of ciprofloxacin、enrofloxacin、sarafloxacin and difloxacin was 30 μg/kg, and danofloxacin was 6 μg/kg. The average recoveries of quinolones residues from spiked sheep milk at the three concentrations of 30、100、200 μg/kg(ciprofloxacin、enrofloxacin、sarafloxacin and difloxacin)and 6、20、40 μg/kg(danofloxacin)ranged from 70-100 %(n=5) respectively. In day-between days batch variation coefficients were both less than 20 %.This method can be applied for the determination of quinolones residues in sheep milk.

HPLC；quinolones ；residues；sheep milk

李丹，碩士，從事獸藥殘留方法學研究及殘留檢測工作。

2015-12-02

A

1002-1280 (2016) 01-0031-05

S859.84