“通督啟神”法兩種電針對AD模型小鼠行為學及大腦皮層COX-2、TGF-β1表達的影響*

牟秋杰，嵇 波，李昱頡，劉俊彤，楊利娟，盧夢晗，李志剛

(北京中醫(yī)藥大學，北京 100029)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD),又稱為“老年性癡呆”，約占所有癡呆的60%～80%，是以進行性認知功能障礙和記憶力減退為主要臨床表現的中樞神經系統疾病[1]，其發(fā)病與年齡密切相關，在老年群體中屬常見病和多發(fā)病[2]，嚴重危害老年人的身心健康，且死亡率較高[3]。據國際阿爾茨海默病協會(ADI)發(fā)布的《2016年全球阿爾茨海默病報告》顯示，全球AD患者近4 700萬人，預計到本世紀中葉將會達到1.3億人，僅2018年全球用于治療AD的費用就會達到1萬億美元。AD的發(fā)病與環(huán)境、遺傳、年齡、機體功能狀態(tài)等諸多因素相關，其發(fā)病機制十分復雜，且各種機制相互影響，互為因果，所以AD的治療也相對復雜，而且療效不佳，只能在一定程度上改善其臨床癥狀，并不能延緩或阻止疾病的發(fā)展。因此，對AD發(fā)病機制、治療方案的探究顯得尤為緊迫和重要。

研究顯示，AD患者腦內會出現大量β-淀粉樣蛋白(Aβ)的沉積并產生具有神經毒性的老年斑(SP)；另外，AD患者腦內還會出現Tau蛋白過度磷酸化[4]，導致神經原纖維纏結(NFTs)形成。Aβ沉積形成的SP和Tau蛋白過度磷酸化形成的NFTs被認為是AD的兩大主要病理改變[5]，但隨著研究的深入，越來越多的實驗證實小膠質細胞(MG)活化所誘導的神經炎性反應已成為AD的第三大病理改變，大量Aβ的沉積會激活MG，產生具有嚴重神經毒性炎性介質[6]，導致神經元的損傷及凋亡，另外還會加速Aβ的沉積，形成惡性循環(huán)?！巴ǘ絾⑸瘛狈ㄊ潜本┲嗅t(yī)藥大學針灸推拿學院李志剛教授經過多年的臨床實踐總結出來的一套對神志類疾病有確切療效的針法，李志剛教授團隊前期研究證實，“通督啟神”法電針能夠抑制AD模型小鼠海馬炎性反應[7]、改善海馬神經元的形態(tài)結構[8]、提高大腦葡萄糖代謝水平[9]等。基于此，本實驗選取7月齡APP/PS1雙轉基因小鼠為模型小鼠，采用Morris水迷宮觀察其行為學變化，Western blot檢測其大腦皮層COX-2、TGF-β1表達情況，闡釋“通督啟神”法兩種電針治療AD的機理及療效差異。

1 材料與方法

1.1 動物

AD模型動物為7月齡、SPF級、雄性APP/PS1雙轉基因小鼠，正常對照組為同背景C57BL/6小鼠，體質量(24.6±4.3)g，由南京大學模式動物研究所提供，批號：SCXK(蘇)2015-0001。本實驗經北京中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會批準。

1.2 主要試劑、藥物及儀器

兔多克隆COX-2抗體(英國，Abcam，ab15191)；兔多克隆TGF-β1抗體(美國，Proteintech，18978-1-AP)；鹽酸多奈哌齊(中國，衛(wèi)材藥業(yè)有限公司，H20050978，5 mg/片×10片)；一次性使用無菌針灸針(中國，北京中研太和醫(yī)療器械有限公司，ZYTH2013030504，0.25 mm×13 mm)；韓氏電針儀(中國，北京華衛(wèi)產業(yè)開發(fā)公司，HANS-LH202)；音樂電針儀(中國，深圳圣祥高科技有限公司，ZJ-12H)；Morris水迷宮系統(中國，上海欣軟信息科技公司，XR-XM101)。

1.3 分組及干預

40只AD模型小鼠隨機分為模型組(AD model group，AD)、藥物組(Medicine group，M)、脈沖電針組(Electro-Acupuncture group，EA)、音樂電針組(Musical Electro-Acupuncture group，MEA)，C57BL/6小鼠為正常對照組(Normal Control Group，N)，每組10只，常規(guī)、單籠飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學動物中心屏障系統。

N組、AD組：與其他組同等條件束縛20 min；M組：鹽酸多奈哌齊0.92 mg/kg劑量灌胃給藥并同等條件束縛20 min；EA組：將小鼠固定于自制鼠套內，印堂、百會均向后15°平刺進針0.5 cm，針柄連接HANS-LH202電針儀20 min，疏密波，輸出頻率為2～50 Hz，水溝點刺不留針；MEA組：針刺同EA組，針柄連接ZJ-12H音樂電針儀20 min。每天1次，共15天。

1.4 檢測方法

1.4.1 隱蔽平臺實驗 治療結束后第1天，為讓實驗小鼠熟悉水迷宮環(huán)境，撤除目標象限(第3象限)平臺，從第1象限將實驗小鼠放入水池中自由游泳90 s；第2天至第6天恢復目標象限平臺并正式實驗，入水前將每只實驗小鼠放于平臺上停頓10 s，然后頭朝水池壁，分別從第1象限和第2象限中點放入水池中，游泳登臺5 s停止記錄時間，即為當次的逃避潛伏期，最長為90 s，兩次游泳時間的算術平均值即為當天的逃避潛伏期。本實驗主要測試實驗小鼠的空間學習能力。

1.4.2 空間探索實驗 隱蔽平臺實驗結束次日撤除目標象限平臺，使實驗小鼠頭朝水池壁，從第1象限中點放入水池中，記錄其目標象限游泳時間/總時間和穿越平臺次數。本實驗主要測試實驗小鼠的空間記憶能力。

1.4.3 Western blot檢測 每組隨機選取5只實驗小鼠斷頭處死(剩余5只用于本課題組其他相關指標檢測)，迅速剝離大腦，取出大腦皮層置于無菌凍存管中液氮保存。每組新鮮大腦皮層加入含1 mmol/L-1PMSF的RIPA裂解液勻漿并提取總蛋白；然后4℃、10 000 r/min離心10 min，計算上樣量；SDS-PAGE電泳；把蛋白轉印至PVDF膜上，5%的脫脂奶粉37℃振蕩封閉1 h，加入一抗(COX-2 1∶1 500；TGF-β1 1∶3 000；β-actin 1∶5 000)4℃過夜；次日洗膜，加入二抗(1∶7 500)37℃振蕩孵育1 h；添加發(fā)光液，曝光顯影，標定Marker，沖洗晾干，掃描分析。

1.5 統計學方法

2 結果

2.1 各組隱蔽平臺實驗結果比較

實驗期間，各組小鼠逃避潛伏期均呈下降趨勢，其中N組最明顯，其次依次為MEA組、EA組、M組，最后為AD組。見圖1。

實驗第1天至第5天，N組與AD組的逃避潛伏期比較均有統計學差異(P<0.05或P<0.01)，且差異逐漸加大；與AD組相比，第1天至第2天M組、EA組、MEA組的逃避潛伏期均減少，但無統計學差異(P>0.05)，第3天至第5天出現了統計學差異(P<0.01)；與M組相比，第1天至第3天EA組、MEA組的逃避潛伏期均減少，但無統計學差異(P>0.05)，第4天至第5天出現了統計學差異(P<0.01)，說明3種干預方法均能改善AD模型小鼠的空間學習能力，且EA組、MEA組優(yōu)于M組，但EA組、MEA組之間無統計學差異(P>0.05)。見表1、圖1。

表1 不同組別逃避潛伏期比較

注：與N組相比，*P<0.05，**P<0.01；與AD組相比，##P<0.01；與M組相比，△P<0.01。

圖1 不同組別逃避潛伏期變化趨勢圖

2.2 各組空間探索實驗結果比較

與N組相比，AD組目標象限游泳時間/總時間、穿越平臺次數均減少(P<0.01)；與AD組相比，M組、EA組、MEA組目標象限游泳時間/總時間、穿越平臺次數均增加(P<0.05或P<0.01)；與M組相比，MEA組目標象限游泳時間/總時間增加(P<0.01)。說明3種干預方法均能改善AD模型小鼠的空間記憶能力，就目標象限游泳時間/總時間而言，MEA組優(yōu)于M組，就穿越平臺次數而言，三者無統計學差異(P>0.05)。見表2。

表2 不同組別目標象限游泳時間/總時間、穿越平臺次數比較

注：與N組相比，**P<0.01；與AD組相比，#P<0.05，##P<0.01;與M組相比，△△P<0.01。

2.3 各組Western blot結果比較

與N組相比，AD組COX-2、TGF-β1表達均增加(P<0.01)；與AD組相比，M組、EA組、MEA組COX-2、TGF-β1表達均減少(P<0.01)，說明3種干預方法均能抑制模型小鼠大腦皮層炎性因子的表達；與M組相比，EA組、MEA組大腦皮層COX-2、TGF-β1表達減少(P<0.05或P<0.01)，但兩者無統計學差異(P>0.05)。見表3、圖2。

注：1為N組；2為AD組；3為M組；4為EA組；5為MEA組。圖2 不同組別大腦皮層COX-2、TGF-β1表達情況

表3 不同組別大腦皮層COX-2、TGF-β1表達比較

注：與N組相比，**P<0.01；與AD組相比，##P<0.01；與M組相比，△P<0.05，△△P<0.01。

3 討論

AD屬中醫(yī)學“呆證”范疇，病機為“督脈受阻，神機失用”“髓消腦減”[10]?！澳X為元神之府”，與人的精神、神志功能密切相關；“督脈者，貫脊屬腎……入絡腦……”，督脈是貫通腦與腎的橋梁；腦為髓海，其源于腎之真陰真陽，緣督脈貫注于腦，若督脈受阻，則會髓消腦減、神機失用?！巴ǘ絾⑸瘛狈ǖ奈镔|基礎為“督脈-腦”系統，以“通督”為治療方案，達到“啟神”的目的，主要治療精神、神志類疾病[11]。“通督啟神”法由印堂、百會、水溝3穴組成：印堂屬于督脈穴，位于兩眉連線的中點，主要有通督安神的功效；百會位于頭的巔頂部位，為手太陽經、足太陽經、督脈、足厥陰經的交會處，又稱為三陽五會,直接與腦髓相通，對頭部疾病具有很好的療效；水溝穴位于人中溝中，又稱人中穴，為督脈穴位，對癔癥、呆證、癲狂癇、急慢驚風等神志病癥療效較好，屬“十三鬼穴”。3穴皆位于頭部督脈循行線上，與腦髓相通，由“病變在腦，首取督脈”[12]“經脈所過，主治所及”可知，印堂、百會、水溝3穴合用具有“通督啟神”之效。

APP/PS1雙轉基因小鼠是國際公認的AD模型小鼠，廣泛用于AD的相關機理研究[13]。該模型小鼠大腦皮層Aβ沉積速度最快[14]，學習記憶功能隨著Aβ的沉積逐漸下降[15]；其腦內Aβ沉積的分布區(qū)與AD患者的分布區(qū)比較相似[16]，在4、5月齡時大腦皮層就已經出現了SP的沉積并出現了認知功能障礙[17]，且漸進性加重，對AD患者的病理變化和行為學改變有很好的模擬作用[18]，較10月齡而言，6～7月齡APP/PS1雙轉基因小鼠對認知功能的模擬作用更優(yōu)，其可能是電針干預AD的最佳時期[19]，因此本實驗的研究對象為7月齡APP/PS1雙轉基因小鼠。另外，通過長期臨床實踐和實驗評估，第二代膽堿酯酶抑制劑鹽酸多奈哌齊具有高選擇性、可逆性優(yōu)勢，可提高膽堿系統的活性和藥物的敏感性[20]、減少乙酰膽堿的水解、降低Aβ的神經毒性等，從而起到改善患者臨床癥狀的作用，是治療輕、中度AD的經典有效藥和首選藥，因此本實驗選取鹽酸多奈哌齊為藥物組的治療用藥。

Aβ在AD患者腦內的大量沉積會激活MG，產生能夠導致神經元損傷及凋亡的炎性介質。由前列腺素(PGs)合成的誘導型限速酶環(huán)氧化酶2(COX-2)是環(huán)氧化酶(COX)的一種亞型，當小膠質細胞激活后其表達水平顯著增加，催化花生四烯酸產生PGs參與神經系統的炎性反應，是炎性反應介導的細胞毒性的決定因素之一，與AD的發(fā)病密切相關，能促進SP的形成并加速MG的活化。研究證實，APP轉基因小鼠中COX-2表達的增加會引起小膠質細胞和神經元的變性，產生慢性炎癥和神經毒性作用，損傷神經系統[21]。由于COX-2與AD關系密切，神經元中COX-2的早期表達是AD患者發(fā)展為癡呆的重要標志，揭示其可能增加AD的易感性，可能成為治療AD的新靶點。轉化生長因子β1(TGF-β1)是TGF-β的一種亞型，其在正常腦組織中的表達水平不高，僅少量表達于大腦皮質、腦膜及脈絡膜叢細胞，但在病理條件下，病變部位的表達水平就明顯增加[22]，研究證實，APP轉基因小鼠如果同時表達TGF-β1，其腦內Aβ的沉積便會加速，同時還會誘導APP的高表達，加速腦內Aβ的沉積[23],因此，TGF-β1在Aβ的沉積和SP的形成中具有重要作用。本實驗研究結果顯示，“通督啟神”法兩種電針均能改善模型小鼠的認知功能，降低大腦皮層COX-2、TGF-β1的表達，說明兩種電針均是治療AD行之有效的方法，但兩者的療效并無統計學差異，其治療AD的機理可能與抑制MG活化、降低大腦皮層COX-2、TGF-β1的表達有關，但其深層機理還有待于進一步研究。