MEG8-DMR對人肝癌Huh7細(xì)胞DLK1表達(dá)水平的影響

史嘯坤 楚晨

【摘要】目的 DLK1-DIO3印記區(qū)間位于人14號(hào)染色體、小鼠12號(hào)染色體上，在兩者的表達(dá)中高度保守，其間有三個(gè)父本控制的蛋白質(zhì)編碼區(qū)域，以及多個(gè)母本控制的非編碼轉(zhuǎn)錄本，還有大量的C/D snoRNA和microRNA。其間有三個(gè)差異甲基化區(qū)，分別為父本甲基化的IG-DMR和MEG3-DMR，以及母本甲基化的MEG8-DMR。先前關(guān)于對MEG8-DMR的研究集中于腫瘤方面的較少，因此探究差異甲基化區(qū)MEG8-DMR對腫瘤發(fā)生的影響以及其調(diào)控機(jī)制，深入分析印記基因參與腫瘤的發(fā)病機(jī)理，具有重要的意義。方法 本實(shí)驗(yàn)通過CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，先依據(jù)脫靶位點(diǎn)少的原則選擇sgRNA，構(gòu)建重組載體并通過脂質(zhì)體法將其轉(zhuǎn)染入Huh7細(xì)胞后檢測出重組載體在Huh7細(xì)胞系中對MEG8-DMR區(qū)域進(jìn)行了有效的敲除。結(jié)果 敲除MEG8-DMR后細(xì)胞形態(tài)沒有發(fā)現(xiàn)明顯變化，同時(shí)發(fā)現(xiàn)敲除MEG8-DMR導(dǎo)致上游基因DLK1表達(dá)水平的下調(diào)。結(jié)論 本實(shí)驗(yàn)中通過對MEG8-DMR的敲除，導(dǎo)致DLK1表達(dá)下調(diào)，而DLK1在幾種腫瘤包括神經(jīng)纖維瘤、骨髓增生異常綜合征和肝癌患者的血清中呈高表達(dá)，且腫瘤的形成是多因素、多基因共同參與的結(jié)果，MEG8-DMR上下游區(qū)域分布著一系列母系表達(dá)非編碼轉(zhuǎn)錄本，和大量的miRNA和C/D snoRNA，因此，MEG8-DMR及臨近基因在肝細(xì)胞性肝癌的發(fā)生過程中可能具有表達(dá)調(diào)控的重要功能。

【關(guān)鍵詞】MEG8-DMR;肝細(xì)胞性肝癌;CRISPR/Cas9;Huh7細(xì)胞;DLK1

【中圖分類號(hào)】R 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】ISSN.2095-6681.2019.1..03

【Abstract】Objective The imprinted region of DLK1-DIO3 is located on human chromosome 14 and mouse chromosome 12 and is highly conserved in the expression of both. There are three parental control protein coding regions and multiple maternal controlled non-coding transcripts，and a large number of C/D snoRNAs and microRNAs.There are three regions of differential methylation between the parental methylated IG-DMR and MEG3-DMR， and the maternal methylated MEG8-DMR. Previous a few studies on MEG8-DMR focused on tumors.Therefore，it is of great significance to explore the influence of MEG8-DMR on tumorigenesis and its regulation mechanism and to deeply analyze the pathogenesis of the imprinted genes involved in tumors.Methods In this study， CRISPR/Cas9 gene editing techniques were used to select sgRNAs based on the principle of less off-target sites，construct recombinant vectors and transfect them by liposome method.After incorporation into Huh7 cells， it was detected that the recombinant vector effectively knocked out the MEG8-DMR region in the Huh7 cell line.Results No significant changes in cell morphology were observed after knockout of MEG8-DMR.It was also found that the knockdown of MEG8-DMR resulted in the down-regulation of the expression level of the upstream gene DLK1.Conclusion In this experiment，the knockdown of MEG8-DMR resulted in the down-regulation of DLK1 expression.DLK1 was highly expressed in the serum of several tumors，including neurofibroma， myelodysplastic syndrome and liver cancer， and the tumor formation was multifactorial.As a result of multiple genes co-involved，a series of maternal expressive non-coding transcripts and a large number of miRNAs and C/D snoRNAs are distributed in the upstream and downstream regions of MEG8-DMR.Therefore，MEG8-DMR and its adjacent genes may play an important role in the regulation of hepatocellular carcinoma.

【Key words】MEG8-DMR;Hepatocellular carcinoma;CRISPR/Cas9;Huh7 cells;DLK1

基因組印記是經(jīng)典的表觀遺傳學(xué)現(xiàn)象，常表現(xiàn)為父源或母源一方的等位基因表達(dá)，而另一方的等位基因沉默。之前的研究表明，在這樣的印記基因簇中，總分布著一些差異甲基化區(qū)，即父本和母本具有不同甲基化狀態(tài)的區(qū)域，且這些差異甲基化區(qū)對印記基因的調(diào)控有重要的作用[1]。

DLK1-DIO3印記區(qū)間位于人14號(hào)染色體、小鼠12號(hào)染色體上，在兩者的表達(dá)中高度保守，其間有三個(gè)父本控制的蛋白質(zhì)編碼區(qū)域，以及多個(gè)母本控制的非編碼轉(zhuǎn)錄本，還有大量的C/D snoRNA和microRNA。其間有三個(gè)差異甲基化區(qū)，分別為父本甲基化的IG-DMR和MEG3-DMR，以及母本甲基化的MEG8-DMR[2]。

之前的研究表明，在MEG8-DMR的上游和下游分別定點(diǎn)整合和插入AAV腺病毒載體和Sleeping Beauty 睡美人轉(zhuǎn)座子會(huì)促進(jìn)肝癌的發(fā)生[3-4]，DLK1-DIO3印記區(qū)間中的DLK1、RTL1、MEG3以及microRNA也與肝癌的發(fā)生密切相關(guān)[5]。因此，探究差異甲基化區(qū)MEG8-DMR對腫瘤發(fā)生的影響以及其調(diào)控機(jī)制，深入分析印記基因參與腫瘤的發(fā)病機(jī)理，無疑具有重要的意義。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)是目前基因組編輯領(lǐng)域最受歡迎的新方法。CRISPR/Cas9來源于簡單的細(xì)菌免疫系統(tǒng)，經(jīng)過人為改造后，可在真核細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)高度靈活且特異的基因組編輯[6]。CRISPR/Cas9系統(tǒng)已經(jīng)成功應(yīng)用于植物細(xì)菌酵母魚類以及哺乳動(dòng)物細(xì)胞，也是目前最高效的基因組編輯系統(tǒng)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

人肝癌Huh7細(xì)胞系由本實(shí)驗(yàn)室保存;CRISPR/Cas9質(zhì)粒骨架載體為本實(shí)驗(yàn)室改造后的pX458載體;質(zhì)粒提取試劑盒購自Axygen公司;轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM 2000 Reagent購自Invitrogen公司;DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司;進(jìn)口胎牛血清購自Hyclone公司;青鏈霉素購自Hyclone公司;嘌呤霉素購自Sigma公司;RNAiso Plus、SYBR?Green PCR Master Mix、PrimeScript? RT reagent Kit With gDNA Eraser試劑盒購自TaKaRa公司;MTT粉末購自北京索萊寶科技有限公司;DMSO購自Sigma公司。

1.2 重組載體的構(gòu)建以及sgRNA的設(shè)計(jì)

1.2.1 sgRNA的設(shè)計(jì)

在網(wǎng)站http：//crispr.dbcls.jp/中輸入欲敲除的片段，根據(jù)網(wǎng)站給出的結(jié)果，依據(jù)脫靶位點(diǎn)少的原則，選擇sgRNA-F和sgRNA-R，即紅色三角形所示位置，從而對MEG8-DMR進(jìn)行敲除。

1.2.2 構(gòu)建重組載體及重組載體的轉(zhuǎn)染

在本實(shí)驗(yàn)原有的pX458質(zhì)粒的基礎(chǔ)上，首先分別用限制性核酸內(nèi)切酶Bbs1與Bsa1對其進(jìn)行切割，再將sgRNA-F和sgRNA-R連入酶切位點(diǎn)，通過脂質(zhì)體法，使用Lipo2000，利用細(xì)胞膜的電性與Lipo2000相互吸引，進(jìn)而將重組載體傳染入人肝癌Huh7細(xì)胞。

1.3 目的克隆的篩選

1.3.1 藥物篩選

轉(zhuǎn)染24 h～48 h后，鑒于載體本身攜帶的Puro篩選標(biāo)簽，加入含有嘌呤霉素的培養(yǎng)液，Huh7藥篩濃度為2.5 ug/mL。藥篩三天后，有限稀釋法重新鋪于96孔板中，對所獲得單個(gè)克隆進(jìn)行繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3.2 PCR檢測

利用酚氯仿法，提取單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)后的細(xì)胞的基因組DNA，并對其進(jìn)行PCR檢測，對顯示有目的條帶的實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳回收，然后進(jìn)行測序，進(jìn)一步分析其敲除情況，敲除鑒定引物。

1.4 檢測Huh7細(xì)胞中DLK1表達(dá)水平變化

1.4.1 DLK1表達(dá)水平檢測

通過Trizol法提取細(xì)胞總RNA，并將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過實(shí)時(shí)定量PCR檢測DLK1基因在mRNA水平表達(dá)的變化。

2 結(jié) 果

2.1 重組載體成功轉(zhuǎn)入目的細(xì)胞

根據(jù)綠色熒光蛋白的表達(dá)，可以看出重組載體成功轉(zhuǎn)染入人肝癌Huh7細(xì)胞。

2.2 單克隆篩選鑒定

通過測序比對基因組敲除情況，對野生型細(xì)胞、E5號(hào)克隆、B7號(hào)克隆進(jìn)行基因組PCR鑒定，野生型條帶大小為1528 bp。電泳顯示E5號(hào)克隆在約350 bp處可見敲除帶。

測序比對顯示，重組載體在上游靶位點(diǎn)附近和下游靶位點(diǎn)外行使對MEG8-DMR敲除效應(yīng)，成功敲除1190 bp，兩敲除位點(diǎn)10 bp內(nèi)存在一定的堿基修復(fù)差異。E5號(hào)克隆確定為本研究實(shí)驗(yàn)組目的克隆細(xì)胞株。

2.3 細(xì)胞形態(tài)比對

將野生型細(xì)胞和E5號(hào)克隆進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)比較，細(xì)胞形態(tài)沒有發(fā)現(xiàn)明顯變化。

2.4 實(shí)時(shí)定量分析DLK1的表達(dá)變化

實(shí)時(shí)定量PCR檢測野生型Huh7細(xì)胞和E5號(hào)克隆DLK1表達(dá)水平變化，發(fā)現(xiàn)E5號(hào)克隆mRNA的表達(dá)與野生型細(xì)胞相比明顯較低。

3 結(jié) 論

（1）重組載體可在Huh7細(xì)胞系中對MEG8-DMR區(qū)域進(jìn)行有效敲除。（2）敲除MEG8-DMR后細(xì)胞形態(tài)沒有發(fā)現(xiàn)明顯變化。（3）敲除MEG8-DMR導(dǎo)致上游基因DLK1表達(dá)水平的下調(diào)。

4 討 論

本實(shí)驗(yàn)中通過對MEG8-DMR的敲除，導(dǎo)致DLK1表達(dá)下調(diào)，而DLK1在幾種腫瘤包括神經(jīng)纖維瘤、骨髓增生異常綜合征和肝癌患者的血清中呈高表達(dá)[7]，且腫瘤的形成是多因素、多基因共同參與的結(jié)果， MEG8-DMR上下游區(qū)域分布著一系列母系表達(dá)非編碼轉(zhuǎn)錄本，和大量的miRNA和C/D snoRNA，因此，MEG8-DMR及臨近基因在肝細(xì)胞性肝癌的發(fā)生過程中可能具有表達(dá)調(diào)控的功能，有待于進(jìn)一步進(jìn)行研究。

參考文獻(xiàn)

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本文編輯：劉欣悅