三維細(xì)胞培養(yǎng)的研究進(jìn)展*

程 華，劉素生 綜述，韓 瑋 審校

(1.河北省科學(xué)院生物研究所，石家莊 050081；2.河北大學(xué)藥學(xué)院，河北保定 071002；3.河北省石家莊市第五醫(yī)院結(jié)核門診 050000)

細(xì)胞培養(yǎng)是指從生物體取出部分組織分散成單個(gè)細(xì)胞或直接從機(jī)體取出單個(gè)細(xì)胞，在體外條件下培養(yǎng)，細(xì)胞能繼續(xù)存活與增殖。從1885年德國學(xué)者ROUX用生理鹽水培養(yǎng)雞胚組織開始算起，細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)發(fā)展到今天已有一百三十多年的歷史了。在這一百多年里細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)不斷發(fā)展，特別是20世紀(jì)60年代末期培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)入鼎盛階段，在培養(yǎng)器皿、培養(yǎng)液和培養(yǎng)方法等方面取得突破性進(jìn)展。由于操作簡單、周期短、費(fèi)用低等特點(diǎn)，細(xì)胞培養(yǎng)在基礎(chǔ)研究和應(yīng)用領(lǐng)域中使用越來越廣泛[1]。

經(jīng)過多年的發(fā)展，細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)已成為生命科學(xué)研究、疾病機(jī)制研究、藥物篩選及生物制品生產(chǎn)等多個(gè)領(lǐng)域中基礎(chǔ)且不可替代的技術(shù)手段[2]。在腫瘤機(jī)制研究方面，通過在體外進(jìn)行腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)的方式，來揭示腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移過程中分子調(diào)控行為和機(jī)制[3]。在藥物篩選方面，外源化合物可以直接作用于靶細(xì)胞，特別是大量候選藥物的初始篩選階段，可以根據(jù)篩選目的設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)條件，短期內(nèi)獲得大量包括藥物反應(yīng)和細(xì)胞毒性在內(nèi)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。同時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)化的細(xì)胞培養(yǎng)流程使得自動化設(shè)備的使用成為可能，效率大大提高[4-5]。在生物制品方面，目前多種疫苗由細(xì)胞發(fā)酵生產(chǎn)，特別是流感疫苗，細(xì)胞培養(yǎng)已經(jīng)成為其最主要的生產(chǎn)方式之一[6-7]。

隨著各領(lǐng)域研究的不斷深入，二維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的缺點(diǎn)也逐漸暴露出來。在很多情況下某些細(xì)胞在培養(yǎng)過程中逐漸喪失了原有的特性，導(dǎo)致研究結(jié)果與體內(nèi)的實(shí)際情況不符合。分析其原因，考慮細(xì)胞在體外進(jìn)行二維培養(yǎng)時(shí)，無法生成細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)，進(jìn)而無法形成立體結(jié)構(gòu)。而在活體組織中，細(xì)胞通常在三維微環(huán)境中生長，這個(gè)三維微環(huán)境提供了細(xì)胞生存所需的各種條件，在物理方面起到支撐作用。在化學(xué)方面則是氧氣等多種氣體的傳遞、各種糖類營養(yǎng)物質(zhì)的代謝及各種激素等信號分子的傳導(dǎo)。所以空間結(jié)構(gòu)和外部的微環(huán)境對于細(xì)胞的形狀、增殖、分化和遷移等具有至關(guān)重要的作用[8]。

因此如何填補(bǔ)單層細(xì)胞培養(yǎng)和生物活體間的鴻溝，為細(xì)胞提供與體內(nèi)相似的支架系統(tǒng)，創(chuàng)造與體內(nèi)相似的生長環(huán)境，促使細(xì)胞增殖、分化及呈現(xiàn)出類似體內(nèi)的功能成為體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)迫切需要解決的難題和發(fā)展趨勢[9]。近幾年，隨著組織工程的發(fā)展，三維細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)運(yùn)而生。

1 三維細(xì)胞培養(yǎng)的出現(xiàn)

1972年，ELSDALE等[10]發(fā)現(xiàn)細(xì)胞在含有細(xì)胞外基質(zhì)的三維空間中生長時(shí)，表現(xiàn)出與在平面生長中不同的特性。這一發(fā)現(xiàn)引起了研究人員極大的興趣，隨之相關(guān)的研究逐漸展開[11]。三維細(xì)胞培養(yǎng)是指將不同種類的細(xì)胞培養(yǎng)在不同三維結(jié)構(gòu)的載體中，使細(xì)胞能夠在載體的空間結(jié)構(gòu)中增殖和分化，構(gòu)成細(xì)胞-載體復(fù)合物[12]。三維細(xì)胞培養(yǎng)作為體外單層細(xì)胞培養(yǎng)和體內(nèi)天然生長環(huán)境的橋梁，具有傳統(tǒng)單層細(xì)胞培養(yǎng)不可比擬的優(yōu)勢，既能創(chuàng)造體內(nèi)細(xì)胞微環(huán)境的物質(zhì)及結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),使得細(xì)胞在形態(tài)學(xué)、基因表達(dá)及其他生理過程中都更接近于體內(nèi)的狀況，同時(shí)又具有細(xì)胞培養(yǎng)的直觀性及條件可控性的優(yōu)勢。

2 三維細(xì)胞培養(yǎng)的模式

實(shí)現(xiàn)三維細(xì)胞培養(yǎng)，目前有兩種常用模式，第1個(gè)是細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，第2個(gè)是三維支架培養(yǎng)。細(xì)胞懸浮培養(yǎng)是指在懸浮條件下細(xì)胞逐漸聚集，經(jīng)過數(shù)天培養(yǎng)后形成一個(gè)直徑數(shù)百微米的多細(xì)胞球狀體。這種培養(yǎng)模式操作簡單、費(fèi)用低，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于多種研究中。VINCI等[13]對40種不同的腫瘤細(xì)胞系(包括肝癌、肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌和前列腺癌等)進(jìn)行了細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)球狀體的形成大致可以分為3種，即緊密的規(guī)則球形、緊湊的不太規(guī)則球形和松散的不規(guī)則球形。其中后兩種類型可以通過往培養(yǎng)基中加入一定量的細(xì)胞外基質(zhì)而改善球形結(jié)構(gòu)。雖然細(xì)胞懸浮培養(yǎng)操作簡單，但用途較為單一，不能用于細(xì)胞的遷移研究等。

三維支架培養(yǎng)則是將細(xì)胞培養(yǎng)在具有空間結(jié)構(gòu)的支架上，該模式關(guān)鍵在于細(xì)胞空間支架的獲得。這些支架在生物體內(nèi)由細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成，主要成分是細(xì)胞膜外蛋白和多糖類物質(zhì)[14]。其中蛋白主要是膠原蛋白和層粘連蛋白，多糖類物質(zhì)則主要是糖胺聚糖，包括硫酸軟骨素和硫酸乙酰肝素等。在體外構(gòu)建和體內(nèi)相同的三維支架非常困難，因?yàn)檫@涉及高分子合成、表面修飾、生物耦聯(lián)、細(xì)胞生物學(xué)等多個(gè)學(xué)科和領(lǐng)域。經(jīng)過多年的研究這一領(lǐng)域已經(jīng)取得了一些進(jìn)展，目前可用于制備三維支架的材料主要來自純天然及人工合成。

其中純天然的材料有膠原蛋白、水凝膠、層粘連蛋白及透明質(zhì)酸等[15-17]。這些材料是從植物、動物及人體組織中提取出來的，與生物體內(nèi)的細(xì)胞外基質(zhì)相似或完全相同，具有非常好的生物相容性，不容易引起細(xì)胞的排異反應(yīng)。但天然材料也有一些缺點(diǎn)，如提取困難、整體質(zhì)量較難控制等。

人工合成的三維支架材料有聚苯乙烯、聚己內(nèi)酯、聚乳酸和聚乙二醇等[18-20]。這些合成材料具有良好的可塑性，生物化學(xué)及物理特性，以及高度的穩(wěn)定性。但其生物相容性稍差，有可能引起細(xì)胞的排異反應(yīng)。

3 三維與二維細(xì)胞培養(yǎng)的區(qū)別

由于培養(yǎng)條件等諸多因素的改變，同一種細(xì)胞在三維與二維細(xì)胞培養(yǎng)下，其形狀、基因的表達(dá)及細(xì)胞侵襲等特性都有可能發(fā)生改變。LI等[21]用芯片比較了平滑肌細(xì)胞9 600個(gè)基因在三維及二維細(xì)胞培養(yǎng)的表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)至少有77個(gè)基因在三維細(xì)胞培養(yǎng)的表達(dá)水平比二維細(xì)胞培養(yǎng)高一倍以上。除了上述基因表達(dá)的差異外，在兩種不同的培養(yǎng)模式下，細(xì)胞在形狀、培養(yǎng)花費(fèi)、細(xì)胞間相互作用及細(xì)胞耐藥性方面都表現(xiàn)出了巨大的差異[13-20]。

4 三維細(xì)胞培養(yǎng)在腫瘤研究中的應(yīng)用

細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在研究腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、侵襲及壞死過程中的機(jī)制和分子調(diào)控行為具有重要的作用，隨著三維細(xì)胞培養(yǎng)的出現(xiàn)，腫瘤(特別是實(shí)體瘤)相關(guān)研究進(jìn)入一個(gè)更高的水平。因?yàn)樵谌S細(xì)胞培養(yǎng)過程中，細(xì)胞增殖趨于緩慢，氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)的傳遞遞減會形成一個(gè)中空的核心，這與體內(nèi)的腫瘤組織非常相似。

目前在癌癥研究中，三維細(xì)胞培養(yǎng)主要應(yīng)用于腫瘤切片培養(yǎng)物、腫瘤芯片及單細(xì)胞或多細(xì)胞共培養(yǎng)的多細(xì)胞腫瘤球體等方面[22]。腫瘤切片培養(yǎng)首先是組織標(biāo)本的機(jī)械分離，即小的活檢組織或切碎的患者組織標(biāo)本被培養(yǎng)在細(xì)胞外基質(zhì)中。KOERFER等[23]利用這一技術(shù)從胃癌患者的組織中剪下400 μm大小的標(biāo)本塊，在體外培養(yǎng)了6 d。發(fā)現(xiàn)該培養(yǎng)技術(shù)能夠很好地保存腫瘤細(xì)胞的組織形態(tài)完整性。在對該組織塊進(jìn)行5氟尿嘧啶和順鉑處理后，觀察到腫瘤細(xì)胞的失活和細(xì)胞凋亡的增加。其認(rèn)為三維細(xì)胞培養(yǎng)可用于檢測藥物的細(xì)胞毒性，也可用于研究細(xì)胞的耐藥機(jī)制。

MAGUIRE等[24]對多個(gè)乳腺癌MCF10細(xì)胞株進(jìn)行三維細(xì)胞培養(yǎng)，然后對基因組和轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)在多個(gè)基因的拷貝數(shù)上，各個(gè)細(xì)胞株存在很大的差別。SIMON等[25]利用三維細(xì)胞培養(yǎng)來研究肺癌A549細(xì)胞的3個(gè)不同亞型對電離輻射的代謝反應(yīng)。對培養(yǎng)在一種水凝膠中的細(xì)胞進(jìn)行電離輻射，然后對氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)的可用性進(jìn)行分析。隨著細(xì)胞與培養(yǎng)結(jié)構(gòu)表面距離增加，缺氧誘導(dǎo)因子1-α水平增加、細(xì)胞增殖減少，細(xì)胞對電離輻射的敏感性降低。這些反應(yīng)與實(shí)體瘤中觀察到的癌細(xì)胞的特征非常相似。

STRATMANN等[26]利用三維培養(yǎng)模式來研究肺癌HCC827細(xì)胞系對表皮生長因子受體抑制劑吉非替尼敏感性的變化情況，發(fā)現(xiàn)HCC827細(xì)胞中表皮生長因子受體的活性會被吉非替尼所抑制，從而導(dǎo)致細(xì)胞增殖的停滯及細(xì)胞凋亡的增加。該學(xué)者還研究了三維細(xì)胞培養(yǎng)下表皮生長因子受體信號網(wǎng)絡(luò)中多個(gè)基因的變化情況，以及上皮-間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程中涉及的纖維蛋白、E-鈣黏蛋白等的表達(dá)水平變化。找到了在三維模式下對腫瘤的增殖、凋亡和侵襲進(jìn)行定量測定的一些指標(biāo)，初步實(shí)現(xiàn)了定量測定。在腫瘤干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為腫瘤細(xì)胞的過程中，細(xì)胞微環(huán)境特別是細(xì)胞外基質(zhì)被認(rèn)為起了重要調(diào)節(jié)作用，為了探索這一過程，MA等[27]將膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U251細(xì)胞系培養(yǎng)在以聚苯乙烯作為基底，上面覆蓋有多種黏連蛋白的三維空間骨架上。通過檢測與干細(xì)胞特性相關(guān)的基因和蛋白的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)由二維變?yōu)槿S細(xì)胞培養(yǎng)后，一些干性標(biāo)志物有增高的趨勢，如層粘連蛋白結(jié)合整合素α6和β4有上調(diào)。這一系列試驗(yàn)結(jié)果表明，細(xì)胞微環(huán)境與腫瘤干細(xì)胞的干性關(guān)系緊密。

5 三維細(xì)胞培養(yǎng)在藥物篩選中的應(yīng)用

在候選藥物的初始篩選階段，利用體外試驗(yàn)來研究藥物對細(xì)胞的作用是一種被廣泛接受的方法。其主要目的是檢測藥物對靶細(xì)胞造成的損傷程度及其安全性。候選藥物在靶細(xì)胞中造成的損傷程度可以指示其治療價(jià)值，而安全性測試提供了可能的副作用和一些不可預(yù)測的結(jié)果。由于在三維細(xì)胞培養(yǎng)下細(xì)胞在形態(tài)學(xué)、基因表達(dá)及其他生理過程中都更接近于體內(nèi)的狀況，所以利用三維細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行藥物的篩選其效率將大大提高。

MARINHO等[28]對大鼠原代肝細(xì)胞進(jìn)行三維細(xì)胞培養(yǎng)來研究奈韋拉平及其代謝物對PON1酶的作用。發(fā)現(xiàn)在三維細(xì)胞培養(yǎng)下，該藥物可以增強(qiáng)內(nèi)脂酶、對氧磷脂酶及芳基脂酶的功能。LABONIA等[29]使用3D打印的微流控裝置來進(jìn)行三維細(xì)胞培養(yǎng)，用以研究伊立替康及其活性代謝物SN-38在實(shí)體腫瘤中滲透及代謝途徑，而這一過程用二維細(xì)胞培養(yǎng)是無法做到的。LV等[30]使用三維膠原蛋白骨架來培養(yǎng)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)腫瘤干細(xì)胞的數(shù)量增加，同時(shí)細(xì)胞O6甲基鳥嘌呤脫氧核糖核酸甲基轉(zhuǎn)移酶(O6-methylguanine DNA methyltransferase,MGMT)表達(dá)水平上升及對烷化類化療藥物的耐藥性增加。其中耐藥性的表現(xiàn)與腫瘤患者的狀況十分接近，表明三維細(xì)胞培養(yǎng)用于抗神經(jīng)膠質(zhì)瘤藥物的篩選時(shí)，效果更好。

BRESLIN等[31]研究了BT474、HCC1954及EFM192A的3種不同Her-2陽性乳腺癌細(xì)胞系在三維細(xì)胞培養(yǎng)條件下對來那替尼的反應(yīng)、代謝及耐藥性。為了提高三維細(xì)胞培養(yǎng)條件下的藥物篩選速度，研究人員進(jìn)行了一系列的改進(jìn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與二維細(xì)胞培養(yǎng)比較，三維細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞存活及轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白如CYP3A4等表達(dá)均有不同的升高，考慮這些變化可能導(dǎo)致細(xì)胞對來那替尼的耐藥性增強(qiáng)了。EICHLER等[32]發(fā)明了一種三維細(xì)胞培養(yǎng)與電阻檢測相結(jié)合的辦法，來篩選抗腫瘤藥物。具體過程是先將神經(jīng)母細(xì)胞瘤SHSY5Y細(xì)胞培養(yǎng)在150～250 μm的三維骨架中，再將這些細(xì)胞團(tuán)轉(zhuǎn)移到含有候選藥物的培養(yǎng)基中，特定時(shí)間點(diǎn)取出進(jìn)行多個(gè)指標(biāo)的檢測。該篩選方法非常高效，每天可檢測800個(gè)細(xì)胞團(tuán)。

RASHEENA等[33]分別用Matrigel、Cultrex及Alvetex 3種不用的三維細(xì)胞骨架進(jìn)行前列腺癌LNCaP和DU145細(xì)胞系的培養(yǎng)，以檢測兩種細(xì)胞系對多烯紫杉醇和雷帕霉素的敏感性及耐藥性。結(jié)果顯示兩種細(xì)胞在3個(gè)不同的三維細(xì)胞培養(yǎng)條件中的生長速率各不相同，耐藥性也不一致。DU145中表皮生長因子受體的表達(dá)與雷帕霉素的耐藥性呈負(fù)相關(guān)，LNCaP中則是p53蛋白二聚體的表達(dá)與多烯紫杉醇的耐藥性呈正相關(guān)。這些結(jié)果表明，目前三維細(xì)胞培養(yǎng)對細(xì)胞的行為具有非常大的影響，為了保證數(shù)據(jù)的可靠性和準(zhǔn)確性，應(yīng)盡快建立統(tǒng)一的三維細(xì)胞培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)。

6 結(jié)語與展望

三維細(xì)胞培養(yǎng)作為體外單層細(xì)胞培養(yǎng)與體內(nèi)研究的橋梁，具有細(xì)胞培養(yǎng)的直觀性及條件可控性的優(yōu)勢，同時(shí)能最大程度地模擬體內(nèi)細(xì)胞微環(huán)境。這些優(yōu)點(diǎn)使得三維細(xì)胞培養(yǎng)迅速被應(yīng)用于生命科學(xué)、腫瘤機(jī)制研究及藥物篩選，但該技術(shù)仍然有許多不足的地方，包括標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一、使用成本較高、細(xì)胞觀察不便等。相信隨著相關(guān)技術(shù)的發(fā)展，這些問題將逐步被解決，三維細(xì)胞培養(yǎng)將獲得更為廣泛的應(yīng)用。