銅綠假單胞菌OprF/I融合蛋白疫苗研制現(xiàn)狀

梁誠誠，李文桂

重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 傳染病寄生蟲病研究所，重慶400016

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，Pa）是一種革蘭陰性非發(fā)酵和需氧的機會性致病菌，其表型多樣，廣泛存在于自然界和人類生活環(huán)境中，常感染免疫防御機制受損的患者，如囊性纖維化、嚴重燒傷和腫瘤病人[1]。Pa也是醫(yī)院獲得性感染的主要病原體之一，尤其是在燒傷科和ICU，感染后住院時間較長、醫(yī)療費用較高，甚至危及生命[2-3]。Pa具有強大主動外排機制協(xié)同外膜屏障作用的天然抗性，加之抗生素濫用所致多藥耐藥性增加，共同造成了發(fā)病率和死亡率的升高，是治療的一大挑戰(zhàn)[4-5]。隨著抗生素耐藥的使用限制和新抗生素的開發(fā)緩慢，補充和替代方案日益受到關(guān)注，其中疫苗成為防治Pa感染的有效替代方法。

隨著Pa疫苗的持續(xù)研發(fā)，許多抗原如外膜蛋白、脂多糖、鞭毛、菌毛、外毒素A等成為研究者用于Pa疫苗設(shè)計的靶抗原。在大多數(shù)研究中，這些靶抗原開發(fā)的疫苗能不同程度地降低免疫小鼠Pa感染的發(fā)病率，提高存活率，產(chǎn)生一定的保護力[6-7]。其中，用外膜蛋白（outer membrane pro?tein，Opr）F或I作為免疫原進行免疫接種可在動物模型或人體臨床試驗中引發(fā)交叉反應和特異性免疫應答，是有潛力的疫苗候選物[8-9]。為增強疫苗協(xié)同免疫效果，開發(fā)了基于OprF和OprI保護性抗原的重組OprF/I融合蛋白疫苗[10]，目前已進入Ⅱ期臨床試驗[11]，具有極大的研究價值。我們擬就OprF和OprI的特性、重組抗原疫苗、DNA疫苗以及重組沙門菌疫苗的研制現(xiàn)狀進行綜述。

1 外膜蛋白F和I的特性

外膜蛋白鑲嵌在Pa脂多糖和磷脂層外膜上，是細胞表面的孔蛋白和其他結(jié)構(gòu)功能組分。OprF和OprI是Pa表面暴露和抗原高度保守的2種重要的外膜蛋白[12]。OprF是Pa細胞表面非特異性通道孔，富含β螺旋結(jié)構(gòu)。其基因全長1157 bp，存在1050 bp的開放讀框（ORF），編碼326個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)。OprF離子通道存在少數(shù)單域構(gòu)象異構(gòu)體和多數(shù)雙域構(gòu)象異構(gòu)體的2種構(gòu)象，其中單域構(gòu)象異構(gòu)體的缺乏和該構(gòu)象異構(gòu)體中弱導電亞構(gòu)象與OprF的低滲性有關(guān)[13]。通過調(diào)節(jié)群體感應網(wǎng)絡(luò)，OprF參與Pa的毒力作用，其與α干擾素結(jié)合刺激群體感應依賴性毒力因子的表達，如Ⅲ型分泌系統(tǒng)（T3SS）分泌的ExoT和ExoS毒素、PA-1凝集素，以及抑制囊性纖維化纖毛搏動的Lec復合物凝集素基因[14-16]。另外，外膜囊泡發(fā)揮包裝蛋白質(zhì)、小分子和DNA并遞送至原核和真核細胞的作用，OprF可通過調(diào)節(jié)假單胞菌喹諾酮信號（PQS）水平影響外膜囊泡的形成[17]。研究表明，采用無細胞表達系統(tǒng)表達OprF孔蛋白，其功能表征能穩(wěn)定結(jié)合在脂質(zhì)雙層膜中，有助于分析OprF的結(jié)構(gòu)和功能[18]。已證實OprF在Pa所有致病和環(huán)境菌株中可作為安全的保護性免疫原，是Pa疫苗研制的重要候選物[19-20]。

OprI是Pa細胞外膜的內(nèi)單層中的一種脂蛋白，富含α螺旋結(jié)構(gòu)。其基因全長625 bp，ORF為249 bp，編碼64個殘基的成熟蛋白質(zhì)。OprI是疫苗接種的良好載體分子，與抗原呈遞細胞（APC）和上皮細胞的TLR2/4作用，末端脂質(zhì)尾部可引發(fā)免疫反應，其與氣管和小腸上皮的黏附有助于黏膜蛋白疫苗的開發(fā)[21-22]。OprI是陽離子抗菌肽（cationic antimicrobial peptides，AMP）的新靶點，參與Pa對hRNase7和α螺旋陽離子AMP的敏感性，通過抑制其抗菌活性，增大細菌細胞膜的滲透性而發(fā)揮作用，可用于耐藥性Pa感染的藥物篩選[23-24]。此外，Basto等[25]提出了一種新的大腸桿菌克隆系統(tǒng)，表達和克隆與OprI脂蛋白融合的異源抗原，故將OprI錨定在3種細菌細胞壁上，利用該系統(tǒng)可獲得重組細菌細胞壁衍生的免疫原性制劑，有望用于新疫苗的開發(fā)。

OprF/I是利用DNA重組技術(shù)將OprF的C端序列和整個OprI抗原決定簇融合的重組外膜蛋白。OprF/I融合蛋白是一種高度保守的保護性抗原，也是良好的Pa疫苗候選分子[26]。在人體試驗中，Mansouri等[27]用OprF/I融合蛋白免疫健康志愿者，發(fā)現(xiàn)其誘導產(chǎn)生促進補體結(jié)合和具有調(diào)理活性的特異性抗體。隨后相繼證實了重組OprF/I蛋白在病理的燒傷和囊性纖維化患者模型中也具有良好的免疫原性和耐受性，產(chǎn)生抗Pa感染的保護效力[28-29]。

2 重組抗原疫苗

重組抗原疫苗是利用DNA重組技術(shù)將保護性抗原基因插入表達載體而制備的重組蛋白。由于不含病原體的其他感染性成分，其具有高安全性、低成本、可大量生產(chǎn)等優(yōu)點。Ding等[30]編碼Pa的Met-Ala-（His）6OprF190-342-OprI21-83融合蛋白并在大腸桿菌中表達，分別制備已接種重組疫苗獲得OprF/I特異性抗體的人血清、兔血清和小鼠血清。ELISA檢測人、兔和鼠血清中OprF/I特異性IgG水平，結(jié)果表明3種類型血清均可誘導特異性抗體產(chǎn)生，其中鼠血清中的IgG水平最高。免疫印跡證實OprF/I疫苗可產(chǎn)生特異性免疫應答，血清能識別Pa的OprF和OprI蛋白。此外，結(jié)合與抑制試驗發(fā)現(xiàn)重組OprF/I和Pa以劑量依賴性方式與人的IFN-γ結(jié)合，而不結(jié)合鼠IFN-γ，OprF/I疫苗接種的人血清顯著抑制Pa與IFN-γ的結(jié)合，提示OprF/I疫苗可以從另一機制闡明其抗Pa感染的保護作用。

Westritschnig等[31]編碼Pa OprF和OprI的保 護性表位，在大腸桿菌中表達重組雜合蛋白Met-Ala-（His）6OprF190-342-OprI21-83，即構(gòu)建IC43疫苗。將受試者隨機均分至5個治療組（50、100或200 μg IC43含佐劑，100μg IC43不含佐劑，安慰劑組），2次間隔7 d肌注接種。ELISA分析免疫原性，顯示免疫后2周，各治療組組間的OprF/I特異性抗體水平存在顯著差異，4個IC43治療組較安慰劑組誘導免疫應答增強，并且在所有IC43治療組中＞90%的受試者的OprF/I特異性IgG水平增加≥4倍，有42.6%觀察到50倍水平的增加，免疫后3～6個月，各組IgG水平逐漸下降，但仍比安慰劑組高。調(diào)理吞噬測定（OPA）評估抗體功能性表明，免疫后2周，54.5%的IC43治療受試者的OPA滴度增加≥2倍，其OPA比值與OprF/I特異性IgG抗體存在相關(guān)性，觀察抗體親和指數(shù)發(fā)現(xiàn)，免疫后2周，所有IC43治療組＞96%的受試者可檢測到OprF/I特異性IgG抗體，且抗組氨酸IgG抗體水平可增加到最大，54.5%的IC43受試者抗體水平增加≥4倍，免疫后3個月開始下降。免疫后6個月，在所有IC43治療組中仍可檢測到ASC反應的特異性IgG抗體。疫苗安全性評估表明IC43疫苗安全耐受，最大耐受劑量為400μg。另外Ⅱ期臨床研究表明，IC43疫苗在機械通氣的ICU患者中產(chǎn)生了顯著的免疫原性，初免后2周誘發(fā)更高水平的特異性抗體，IC43免疫各組之間的Pa感染率無明顯差異[11]。

Cui等[32]以Pa標準株（ATCC27853）基因組為模板，擴增外膜融合蛋白OprF190-342-OprI21-83的663 bp基因，將其插入載體pGEX-2T-1，經(jīng)純化和去除GST標簽，表達可溶性無標簽的外膜融合蛋白FI，將甘露糖修飾的殼聚糖（MC）制成微球（MPs），采用三聚磷酸鹽離子交聯(lián)法構(gòu)建甘露糖修飾的殼聚糖微球載體疫苗（FI-MCS-MPs）。共聚焦和免疫組化結(jié)果表明FI-MCS-MPs結(jié)合巨噬細胞甘露糖受體。分別用30μg FI溶液、FI-AL、FI-CS-MP、FI-MCS-MPs鼻滴免疫BALB/c小鼠，檢測產(chǎn)生的FI特異性抗體水平，結(jié)果顯示肺組織漿液早期產(chǎn)生局部IgM抗體，鼻洗液、BAL和腸道灌洗液中免疫中后期均可產(chǎn)生較高水平的IgA，整個免疫過程中，F(xiàn)I-MCS-MPs組與FI-CS-MP組無顯著差異；而在全身性免疫應答中FI-MCSMPs組的血清IgA和IgG水平在免疫后6周顯著增加，且高于其他免疫組水平。FI-CS-MP組和FIAL組產(chǎn)生更多IgG1，傾向于Th2反應；而FIMCS-MPs組顯示高IgG2a/IgG1比值，提示傾向產(chǎn)生Th1反應。FI-MCS-MPs免疫組還可激活肺和脾組織中的T淋巴細胞亞群，刺激IFN-γ和IL-4的高表達，提示誘導免疫小鼠產(chǎn)生混合Th1/Th2應答。此外，用1.8×109CFU/mL的Pa對免疫小鼠進行鼻內(nèi)致死性攻擊，F(xiàn)I-MCS-MPs免疫組顯示75%的最高存活率，對Pa感染產(chǎn)生明顯保護作用，但與FI-CS-MP組無顯著差異。

Weimer等[33]將PA01株的OprF311-341、OprI21-85和鞭毛蛋白Flic的基因亞克隆到質(zhì)粒pET29a，構(gòu)建重組質(zhì)粒OprF311-341-OprI-flagellins并在大腸桿菌中表達融合蛋白。用5μg融合蛋白肌肉注射免疫BALB/c小鼠，4周后加強1次，加強后2周采血。檢測結(jié)果顯示，免疫小鼠血清誘導高水平和高親和力的抗原OprF、OprI和鞭毛蛋白的特異性IgG抗體，但未產(chǎn)生可檢測的IgE抗體；IgG亞類結(jié)果顯示高水平的IgG2a和主要以IgG1為主的免疫反應；融合蛋白可刺激大量漿細胞產(chǎn)生，15%在脾臟，85%在骨髓，且在骨髓中鞭毛蛋白的漿細胞數(shù)高于OprF和OprI的漿細胞數(shù)；對3種抗原產(chǎn)生的IgG抗體具有相等水平的相對親和力；產(chǎn)生的特異性IgG具有高功能活性，促進最高水平的IgG依賴性C3廣泛沉積；免疫血清顯示融合蛋白能有效激活補體活性，增強殺傷非黏液性Pa的能力，但殺傷黏液性Pa的能力較弱，僅18%。用3.5×106CFU的瓊脂糖嵌入的PA01株呼吸道攻擊疫苗免疫后的DBA/2小鼠，攻擊后1、3和5 d收集肺組織并計數(shù)細菌負荷，結(jié)果表明，與對照組相比，免疫小鼠的細菌負荷明顯下降，顯示出最輕的肺組織病理損傷，攻擊后5 d組織即恢復正常，減輕繼發(fā)性組織損傷。這些研究在用該疫苗免疫的年輕非洲綠猴中也得到證實[34]，提示該融合蛋白疫苗是有望用于人類的潛在疫苗。

3 DNA疫苗

DNA疫苗又稱核酸疫苗，是將抗原編碼基因克隆到質(zhì)粒DNA，將構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)注射途徑等進入機體，使重組質(zhì)粒在真核細胞中表達保護性抗原，從而誘發(fā)機體特異性免疫反應。DNA疫苗制備簡單，便于保存，可多次免疫且免疫應答持 久。Staczek等[35]將融合基因OprF/I插入pVR1020，構(gòu)建重組質(zhì)粒pVR1020O-OprF/I，用1 μg pVR1020或重組質(zhì)粒經(jīng)基因槍免疫B淋巴細胞功能缺陷的B（-）和功能正常的B（+）小鼠，共免疫3次，間隔2周。末次免疫后2周，用1.2×103～2.2×103CFU的FD4菌株攻擊小鼠左肺，攻擊當天，ELISA檢測免疫小鼠血清對OprF和Pa菌株的細胞反應，攻擊后8 d評估肺組織的病變程度，流式細胞儀檢測肺和脾組織的細胞群及血清細胞因子。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，B（-）免疫組和pVR1020免疫B（+）組血清不與OprF、FD2、FD4和KG1077反應，而F/I免疫B（+）組均可與其全部反應并產(chǎn)生OprF和OprI特異性抗體；攻擊后8 d，F(xiàn)/I或pVR1020免疫B（+）組的嚴重損傷比例分別為44.0%和68.2%，表明F/I免疫B（+）組顯示出增強的保護力，而F/I或pVR1020免疫B（-）組間保護力無明顯差異，且與F/I免疫B（+）組相當；與B（+）免疫組相比，B（-）免疫組在肺和脾組織中顯示更高水平的CD3+細胞，中性粒細胞在B（-）和F/I免疫B（+）組的脾組織中數(shù)量更多；F/I免疫B（-）和B（+）組的INF-δ水平均顯著升高，INF-ɑ在F/I免疫B（+）組中輕微升高，其余IL-10、IL-5、IL-4在攻擊前后無明顯變化，表明細胞免疫在抗Pa感染中起重要保護作用。

Saha等[36]以PA01株基因組為模板擴增OprF/I、PcrV和PilA基因，分別插入pGACAG，構(gòu)建重組質(zhì) 粒pGACAG-OprF/I、pGACAG-PcrV、pGACAGPilA并在大腸桿菌DH5中表達。分別用100μg pGACAG-OprF/I和上述3種重組質(zhì)粒組成的混合疫苗于0和28 d經(jīng)肌肉注射免疫BALB/c小鼠，初免后0、2、4和6周收集小鼠血清，免疫印跡檢測血清抗體特應性，ELISA檢測特異性抗體水平。結(jié)果表明，免疫鼠血清能特異識別OprF、OprI、PcrV和PilA蛋白，誘導產(chǎn)生的血清IgG、IgG1和IgG2水平在pGACAG-OprF/I組和多價混合疫苗免疫組中無顯著差異，提示多價混合疫苗易產(chǎn)生多價抗體且抗原間無免疫干擾。末次免疫后2周，用5×105CFU的D4鼻內(nèi)接種攻擊小鼠，發(fā)現(xiàn)多價混合疫苗組的肺組織和鼠血清中的細菌清除率最高；用2×LD50的PAK或D4鼻內(nèi)攻擊小鼠后10 d，發(fā)現(xiàn)多價混合疫苗組的存活率明顯高于其他免疫組，分別為100%和90%。純化各免疫組的血清特異性IgG，其與2×LD50的PAK或D4株混合后鼻內(nèi)接種幼稚小鼠，10 d后發(fā)現(xiàn)多價混合疫苗組的存活率仍最高，分別為100%和80%，表明多價混合疫苗可誘導產(chǎn)生較好的免疫保護力。

4 重組沙門菌疫苗

重組沙門菌疫苗是將病原體的保護性抗原基因?qū)霚p毒的沙門菌中，重組菌苗接種后在體內(nèi)增殖而表達大量所需抗原，刺激機體產(chǎn)生相應免疫抗體。這類疫苗抗原不須純化，增強免疫效果，接種方便。Arnold等[37]將OprF/I融合蛋白基因插入質(zhì)粒pMW151、pMW209和pMW210后，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入aroA突變鼠傷寒沙門菌減毒株SL3261，構(gòu)建重組OprF/I融合蛋白減毒沙門菌活疫苗。用109CFU/100μL重組疫苗菌液灌胃C57BL/6小鼠，接種7 d后計數(shù)免疫小鼠脾臟及腸系膜淋巴結(jié)中的沙門菌菌量，觀察其感染率與重組疫苗蛋白表達水平的關(guān)系，免疫后28 d收集鼠血清、腸黏膜、支氣管肺泡灌洗液和鼻洗液，檢測誘導產(chǎn)生的OprF/I特異性抗體。結(jié)果表明SL3261（pMW151）可表達最高蛋白水平，但在組織中定植不良，未產(chǎn)生可檢測到的系統(tǒng)或黏膜抗體；SL3261（pMW209）表達最低蛋白水平，感染率最高，誘導小鼠產(chǎn)生以IgA為主的中等程度的系統(tǒng)性免疫應答，其中黏膜免疫反應相對較弱；SL3261（pMW209）顯示中等水平蛋白表達和細菌感染率，在MLN中感染率略增加，在鼠血清中可獲得高水平的IgG和IgA，腸黏膜及鼻洗液中也可誘導中等程度免疫反應，但未在肺組織中檢測到有關(guān)抗體。此外，還探討了SL3261（pMW209）在初次黏膜免疫后4周肌注重組疫苗系統(tǒng)加強免疫接種的聯(lián)合策略優(yōu)于單純黏膜、單純系統(tǒng)免疫接種方式，可增強上、下呼吸道黏膜的免疫原性，誘導高水平的IgA、IgG和IgG2a水平，并保留單純黏膜免疫接種產(chǎn)生的Th1免疫反應。

Bumann等[38]將Met-Ala-（His）6OprF190-342-OprI21-83的融合基因插入載體Pyz或PpagC，重組質(zhì)粒導入傷寒腸沙門菌菌株Typhi Ty21a的thyA突變體或基因缺失突變的減毒株CVD908，構(gòu)建重組蛋白OprF/I沙門菌口服減毒活疫苗。免疫印跡證實單克隆抗體識別重組菌苗表達的重組蛋白。用制備的沙門菌菌株Typhi Ty21a或CVD908疫苗于第0、2和4 d口服免疫受試者，28 d后全身系統(tǒng)加強免疫1次，同時用融合蛋白OprF/I的全身肌注接種疫苗和鼻套管接種疫苗。在初免后0 d、4周和6周收集受試者血清和誘導痰，ELISA檢測其OprF/I特異性抗體。結(jié)果表明，單純初次口服重組疫苗未明顯誘導血清特異性抗體產(chǎn)生，而所有免疫組在全身系統(tǒng)加強后均可產(chǎn)生相當?shù)母哐錓gG和IgA抗體水平；在支氣管中，鼻和口服免疫組顯示出升高的特異性抗體水平，其中IgA抗體顯著，系統(tǒng)加強前后及口服免疫組間的抗體水平無明顯差異，而全身疫苗免疫組在初免后未產(chǎn)生明顯特異性抗體，僅在系統(tǒng)加強后有所增加，免疫反應較弱，提示較全身疫苗接種，鼻和口服疫苗更有助于誘導下呼吸道免疫應答保護。

Zhang等[39]以ZHDL9菌株基因組為模板，擴增F1和I2基因并插入質(zhì)粒pYA-F1I2，經(jīng)電穿孔轉(zhuǎn)入ΔasdLH430感受態(tài)細胞（PQ），構(gòu)建重組鼠傷寒沙門菌PQ（pYA-F1I2）疫苗，F(xiàn)1I2融合蛋白能在重組菌中有效表達。分別用2.0×1010CFU重組PQ（pYA-F1I2）灌胃、2.0×108CFU重組PQ（pYAF1I2）皮下注射和25μg His-F1I2加氫氧化鋁佐劑首次免疫加2周后皮下注射免疫小鼠，并在免疫后24、34和44 d進行眼眶取血，收集腸黏液、肺組織及脾淋巴細胞。EILSA檢測發(fā)現(xiàn)皮下注射組血清中能誘導產(chǎn)生高于口服灌胃組、與His-FII2免疫組相當?shù)母逫gG水平及肺組織內(nèi)的最高IgG水平；皮下注射組的IgA水平明顯高于口服灌胃組，但在腸液中結(jié)果相反，而肺組織內(nèi)的IgA只在皮下注射組產(chǎn)生。His-F1I2免疫組均未誘導任何可檢測的IgA。免疫后44 d，與其余免疫組相比，皮下注射組產(chǎn)生更多IL-4、IFN-γ、CD4+T細胞和更高CD4+/CD8+比值，提示其可誘發(fā)Th1/Th2混合型細胞免疫反應。用5.0×107CFU的ZHDL9強毒力菌株滴鼻攻擊初免后30 d的免疫小鼠，攻擊后15 d顯示皮下注射組、口服灌胃組及His-FIL2免疫組的小鼠存活率分別為77.78%、41.18%、66.67%，表明皮下接種重組PQ（pYAF1I2）途徑能產(chǎn)生更有效的免疫保護。

5 結(jié)語

目前，針對Pa感染的許多不同種類的疫苗已進入動物或臨床試驗階段，得到了一些有價值的實驗數(shù)據(jù)和結(jié)果，但尚未獲得許可進入市場的疫苗[40]。大部分關(guān)于銅綠假單胞菌OprF/I融合蛋白疫苗的研究表明該疫苗安全耐受，誘發(fā)具有交叉保護力的特異性免疫反應，其主動或被動免疫在Pa感染的各種動物模型或部分臨床試驗中產(chǎn)生有效保護作用。盡管OprF/I融合蛋白可能是目前最有前景的抗原之一，但這類疫苗的安全性和有效性方面仍存在不少問題：動物實驗模型并不能完全準確地模擬人體感染系統(tǒng)，其測試候選疫苗的結(jié)論有待驗證[41]；現(xiàn)有臨床試驗中的疫苗保護力仍低于人們預期水平；尚不清楚疫苗清除Pa感染的保護機制和誘導的免疫應答類型[42]；未明確疫苗的不良反應；疫苗接種的最佳給藥途徑、劑量及間隔次數(shù)仍有待摸索；未提出規(guī)范和標準的疫苗效果評價方案。

分子免疫學和基因工程技術(shù)的不斷發(fā)展提供了更多的思路用于疫苗的研發(fā)。而多抗原、多抗原表位的聯(lián)合和多基因的融合仍是Pa疫苗的重要研究趨勢和方向。一方面，要積極解決上述現(xiàn)有疫苗存在的問題，可尋找有效的佐劑或其他載體來改進疫苗的安全性和保護效力，如新發(fā)現(xiàn)的兩岐雙歧桿菌（Bifidobacerium bifidum）疫苗載體[43]；另一方面，又要進一步研究Pa的生物學特性和致病機制，鑒定新的候選抗原以研制新型疫苗，如抗生素外排泵的表面成分、伴侶通路成分等[44]。相信隨著研究的不斷深入，針對Pa感染的市場生產(chǎn)疫苗指日可待。