乙醇體系中D-阿洛酮糖的結(jié)晶工藝優(yōu)化

郭元亨1,呂 哲1,丁子元1,王小艷1,李皓然1,鄧?yán)虼?,劉穎慰1,陳 博1,佟 毅

(1.中糧營養(yǎng)健康研究院有限公司,營養(yǎng)健康與食品安全北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 老年?duì)I養(yǎng)食品研究北京市工程實(shí)驗(yàn)室,北京 102209; 2.中糧生物科技股份有限公司,玉米深加工國家工程研究中心,吉林長春 130033)

隨著人們生活水平提高和生活方式的變化,全球范圍內(nèi)肥胖、糖尿病、“三高”等慢性疾病的發(fā)病率逐年增長。2017年國務(wù)院辦公廳發(fā)布的《中國防止慢性病中長期規(guī)劃》(2017～2025年)呼吁,以健康促進(jìn)和健康管理為手段,到2020年降低慢性病導(dǎo)致的過早死亡率較2015年降低10%。積極開展慢病防治是推動(dòng)由疾病治療向健康管理轉(zhuǎn)變的重要手段,因此,飲食中糖分的“健康攝取”成為新時(shí)代的健康課題,其中,低熱量甜味劑的開發(fā)和應(yīng)用是最為有效的途徑之一。

阿洛酮糖(D-psicose,Psi)是D-果糖(D-fructose,Fru)C-3的差向異構(gòu)體,甜度相當(dāng)于蔗糖的70%,熱量相當(dāng)于蔗糖0.3%[1],容積特性及口感與蔗糖相近,且同樣能與食物中的氨基酸或蛋白質(zhì)發(fā)生美拉德反應(yīng),可作為食藥行業(yè)中蔗糖的替代品[2-4]。另外,與蔗糖相比,D-阿洛酮糖可同等程度的滿足消費(fèi)者對(duì)甜味的味覺需求[5]。研究人員發(fā)現(xiàn),相對(duì)于高果糖漿具有引發(fā)肥胖和糖尿病的風(fēng)險(xiǎn),D-阿洛酮糖具有控制肥胖和糖尿病的功效,能明顯抑制體重的增加和腹部脂肪的堆積[6-8]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,D-阿洛酮糖能夠有效降低試驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)脂肪積累,并可能減少肥胖所引起的其他并發(fā)癥[9]。以健康人為研究對(duì)象,研究阿洛酮糖對(duì)血糖的影響發(fā)現(xiàn),每天攝入超過6.7%總碳水化合物的D-阿洛酮糖,可以明顯抑制餐后血糖水平[10]。

圖1 制備D-阿洛酮糖的工藝流程圖Fig.1 Process flow chart of D-psicose preparation

日本學(xué)者Shirai和Kamimura利用大鼠做為研究對(duì)象[11],Nishii等利用健康狗做為研究對(duì)像[12],驗(yàn)證阿洛酮糖安全性,結(jié)果均顯示阿洛酮糖無不良影響。韓國希杰第一制糖株式會(huì)社于2011年向美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)申請(qǐng)D-阿洛酮糖的“一般認(rèn)為安全”(GRAS)認(rèn)定,于2012年6月得到“沒有問題”的答復(fù)(GRAS Notice No.GRN000400)。認(rèn)可甜味劑D-阿洛酮糖可以作為食品添加劑使用。松谷集團(tuán)于2013年向FDA申請(qǐng)其產(chǎn)品D-阿洛酮糖的GRAS認(rèn)定,并于2014年6月得到“沒有問題”的回復(fù)(GRAS Notice No.GRN000498)。該報(bào)告總結(jié),人體實(shí)驗(yàn)每日攝入31～33 g D-阿洛酮糖是沒有任何副作用的。因此,D-阿洛酮糖被歸類為一種常規(guī)的碳水化合物替代品,且不會(huì)構(gòu)成任何安全問題。

阿洛酮糖的生產(chǎn)通常是以果糖為底物,在D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的催化作用下生成的[13-15],但D-阿洛酮糖在水溶液中溶解度很大,結(jié)晶難度較大。受熱容易發(fā)生玻璃態(tài)變化,難以通過噴霧干燥或者其它加熱干燥方法制成干品,限制了D-阿洛酮糖的儲(chǔ)存運(yùn)輸,嚴(yán)重制約了D-阿洛酮糖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。因此,本文將以在乙醇體系中優(yōu)化D-阿洛酮糖的結(jié)晶,以得到D-阿洛酮糖晶體,這對(duì)阿洛酮糖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展十分重要。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

果葡糖漿(F90) 中糧生化能源衡水有限公司提供;海藻酸鈉 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;基因工程菌 中糧營養(yǎng)健康研究院提供;所有高效液相色譜測(cè)定的試劑 均為色譜純級(jí);實(shí)驗(yàn)用水 均為Milli-Q水凈化系統(tǒng)制備的超純水(Millipore,Bedford,MA,USA);其余化學(xué)試劑 均為分析純級(jí)。

Centrifuge 5424恒溫水浴鍋 德國Eppendorf公司;XMTD-6000真空干燥箱 重慶長風(fēng)生物科技有限公司;TDL-5-A臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;RE-2002旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 北京神泰偉業(yè)儀器設(shè)備有限公司;Agilent 1260高效液相色譜 美國Agilent公司;PAL-1手持糖度儀 北京陽光億事達(dá)貿(mào)易有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 D-阿洛酮糖的定量分析 配制D-阿洛酮糖標(biāo)準(zhǔn)液(10.0 mg/mL),依次稀釋成濃度為10.0、8.0、6.0、4.0、2.0、1.0、0.5及0.25 mg/mL的溶液。使用高效液相色譜系統(tǒng)對(duì)測(cè)定D-阿洛酮糖標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積,以峰面積(3組平行樣取平均值)為縱坐標(biāo),以溶液濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)所需D-阿洛酮糖樣品進(jìn)行定量分析。色譜條件如下;Agilent 1260系列高效液相色譜系統(tǒng)包括G1311C四元泵,G1316A柱溫箱,G1329B自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)和G1236A示差檢測(cè)器,色譜柱為色譜柱為waters sugar-PakI(10 μm,6.5 mm×300 mm);柱溫為80 ℃,RID檢測(cè)溫度為55 ℃,流動(dòng)相為水,流速為0.4 mL/min。所有樣品進(jìn)樣前均使用0.45 μm的微濾膜過濾。

結(jié)晶工藝中,結(jié)晶率的計(jì)算如式(1)所示。

D-psicose recovery=mD-psicose%/(Vsolution×Csolution)×100

此外，大部分用戶在洗衣時(shí)，往往會(huì)糾結(jié)洗滌劑究竟該放多少，放多了怕殘留，放少了唯恐洗不干凈。東芝DGH-117X6DZ憑借超微納米氣泡(UFB)技術(shù)的應(yīng)用，能使用溶媒能高的UFB水，擴(kuò)散纖維中殘留的洗滌劑成分，提高漂洗性能，消除洗滌劑殘留，進(jìn)而呵護(hù)家人尤其是萌娃的嬌嫩皮膚。

式(1)

式中,mD-psicose表示結(jié)晶得到的D-阿洛酮糖干重(g);Vsolution表示初始D-阿洛酮糖溶液的體積(mL);Csolution表示初始糖溶液中D-阿洛酮糖的濃度(mg/mL)。

1.2.2 D-阿洛酮糖溶液制備 通過中試發(fā)酵罐培養(yǎng)工程菌細(xì)胞,管式離心機(jī)(18000 r/min)分離得到細(xì)胞,采用海藻酸鈉固定細(xì)胞[14]。另取F90果葡糖漿,稀釋成總糖含量為30%的溶液,通過海藻酸鈉固定的細(xì)胞催化反應(yīng),反應(yīng)結(jié)束后,LX-160離子交換樹脂脫除陽離子,D-354樹脂脫除陰離子,模擬移動(dòng)床(Ca型分離介質(zhì))分離D-阿洛酮糖(純度98.0%以上),濃縮備用。工藝流程圖如圖1所示。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn) 1.2.2節(jié)所獲得的D-阿洛酮糖。純度可達(dá)干物質(zhì)重量的98.0%以上。前期研究發(fā)現(xiàn),D-阿洛酮糖溶液的濃度與其密度呈正相關(guān)的關(guān)系,為方便操作,實(shí)驗(yàn)中密度經(jīng)常作為溶液濃度的間接指標(biāo)。在單因素實(shí)驗(yàn)中,乙醇與糖液比設(shè)定為3∶1,結(jié)晶溫度和時(shí)間設(shè)定為25 ℃和4 h,分析D-阿洛酮糖溶液的密度在1.05～1.40 g/mL之間波動(dòng)時(shí)對(duì)D-阿洛酮糖的結(jié)晶率的影響。然后,D-阿洛酮糖溶液的密度設(shè)定為1.35 mg/mL,結(jié)晶溫度和糖液密度設(shè)定為5 ℃和1.15 g/mL,研究乙醇D-阿洛酮糖濃縮液比在0.5∶1～7∶1之間變化對(duì)D-阿洛酮糖結(jié)晶率的影響。再后,D-阿洛酮糖溶液的密度設(shè)定為1.35 mg/mL,乙醇與D-阿洛酮糖濃縮液比為4∶1,結(jié)晶溫度設(shè)定為25 ℃,對(duì)比結(jié)晶時(shí)間從1～8 h內(nèi)變動(dòng)對(duì)D-阿洛酮糖的結(jié)晶率的影響。最后,乙醇與D-阿洛酮糖濃縮液比為4∶1,結(jié)晶時(shí)間和糖液密度設(shè)定為5 h 和1.35 g/mL,研究結(jié)晶溫度在-5～55 ℃之間波動(dòng)時(shí)對(duì)D-阿洛酮糖的結(jié)晶率的影響。

1.2.4 Box-Behnken(BBD)設(shè)計(jì)試驗(yàn) 為了優(yōu)化的D-阿洛酮糖結(jié)晶工藝,依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,采用Box-Behnken(BBD)中心復(fù)合設(shè)計(jì)法進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)[16-18],乙醇與D-阿洛酮糖濃縮液比(X1),結(jié)晶時(shí)間(X2)和結(jié)晶溫度(X3)設(shè)為自變量,D-阿洛酮糖結(jié)晶率(Y)設(shè)為響應(yīng)值。設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)(詳見表1)。二次回歸方程依據(jù)公式(2)模擬。

式(2)

其中：Y為因變量,β0,βi,βii,βij分別表示常數(shù)項(xiàng)、一次項(xiàng)、二次項(xiàng)和交互項(xiàng)的系數(shù);Xi和Xj表示獨(dú)立量。

表1 三因素三水平響應(yīng)面設(shè)計(jì)(Box-Behnken)Table 1 Experimental design and variables levels for Box-Behnken

1.3 數(shù)據(jù)處理

本實(shí)驗(yàn)所有數(shù)據(jù)均采用3組平行實(shí)驗(yàn)測(cè)定值的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用Design-Expert軟件(V.8.0.6,State,Inc,Minneapolis,USA),根據(jù)響應(yīng)曲面法對(duì)工藝進(jìn)行優(yōu)化。數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)以及回歸分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 D-阿洛酮糖的定量分析

D-阿洛酮糖的高效液相色譜如圖2A所示。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度和高效液相色譜測(cè)得的峰面積關(guān)系繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2B所示,所得的回歸方程如式所示。

A=470714Csolution+37806

式(3)

圖2 D-阿洛酮糖標(biāo)樣的 高效液相色譜圖(A)及標(biāo)準(zhǔn)曲線(B)Fig.2 HPIEC-RID chromatograms of mannitol(A)and standard curve(B)

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

分析D-阿洛酮糖溶液密度、乙醇與糖液比、結(jié)晶時(shí)間和結(jié)晶溫度等四個(gè)單因素對(duì)D-阿洛酮糖結(jié)晶率的影響。結(jié)果如圖3所示。

圖3A表明,D-阿洛酮糖溶液的密度達(dá)到1.25 g/mL之前,D-阿洛酮糖無法結(jié)晶析出。當(dāng)溶液密度超過了1.25 g/mL之后,D-阿洛酮糖結(jié)晶率隨糖溶液的密度增加而增加。但在實(shí)際生產(chǎn)中,當(dāng)D-阿洛酮糖溶液的密度達(dá)到1.35 g/mL后,若要更進(jìn)一步的升高濃度,能耗會(huì)急驟升高。另外,加熱濃縮過程中,隨著濃度升高,粘度增大,液體傳熱性能下降,局部受熱現(xiàn)象加劇,美拉德反應(yīng)促使溶液顏色褐變,影響產(chǎn)品品質(zhì)。因此D-阿洛酮糖結(jié)晶所需的適宜密度設(shè)定為1.35 g/mL之間。

圖3B顯示,在乙醇與D-阿洛酮糖濃縮液比在4∶1之前,隨著乙醇比重增加,D-阿洛酮糖的結(jié)晶率增高。當(dāng)乙醇比重超過4∶1,結(jié)晶率隨著乙醇比重增加而降低。這主要是由于D-阿洛酮糖溶液中含有少量的水,當(dāng)加入無水乙醇后,無水乙醇與水分子相互作用,進(jìn)一步降低了自由水的含量,促使D-阿洛酮糖結(jié)晶析出[19];當(dāng)乙醇比例進(jìn)一步增加時(shí),部分D-阿洛酮糖分子會(huì)溶于乙醇中,導(dǎo)致D-阿洛酮糖的結(jié)晶率降低。

圖3C顯示,在前5 h,D-阿洛酮糖的結(jié)晶收率隨著時(shí)間的處長快速增高。5 h之后,D-阿洛酮糖的結(jié)晶率隨著時(shí)間的延長略有增加,但增加速率明顯放緩。這是因?yàn)?隨著D-阿洛酮糖以固態(tài)形式結(jié)晶析出,液體中的阿洛酮糖逐漸減少,這就導(dǎo)致溶解結(jié)晶平衡過程中,結(jié)晶速率逐漸降低,溶解速率逐漸加快,最終達(dá)到結(jié)晶速率和溶解速率相同,結(jié)晶率不再增高[19]。從結(jié)晶率和時(shí)間成本兩方面考慮,適宜的結(jié)晶時(shí)間選在4～6 h。

圖3 D-阿洛酮糖溶液密度(A)、乙醇與D-阿洛酮糖濃縮液比(B)、結(jié)晶時(shí)間(C)和溫度(D)對(duì)D-阿洛酮糖結(jié)晶率的影響Fig.3 Effects of carbohydrate solution density(A),ratio of ethanol to D-psicose(B), crystallizing time(C)and temperature(D)on recovery rate of mannitol

圖3D顯示,溫度在-5～55 ℃之間變化。D-阿洛酮糖的結(jié)晶率隨著溫度增加面升高,當(dāng)溫度超過25 ℃時(shí),溫度的增加反而促使D-阿洛酮糖結(jié)晶率的降低,當(dāng)溫度達(dá)到55 ℃時(shí),溶液中的結(jié)晶收率降為零。這種現(xiàn)象的原因可能是在較低的溫度條件下,隨著溫度升高,分子運(yùn)動(dòng)加快,溶液粘度降低,有利于D-阿洛酮糖分子相互碰撞,加快D-阿洛酮糖結(jié)晶析出。當(dāng)溫度超過臨界值時(shí),D-阿洛酮糖在乙醇中的溶液度升高,使得結(jié)晶率下降[19]。從圖3D的結(jié)果表明,D-阿洛酮糖適宜的結(jié)晶溫度在15～35 ℃之間。

2.3 模型擬合與統(tǒng)計(jì)分析

基于Box-Behnken中心復(fù)合設(shè)計(jì)。通過響應(yīng)面法(RSM)進(jìn)行工藝優(yōu)化,實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如表2所示。整個(gè)設(shè)計(jì)包含17個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn),包括12個(gè)階乘點(diǎn)和5個(gè)中心點(diǎn)。5中心點(diǎn)用來估算純誤差平方和。結(jié)果表明,D-阿洛酮糖的結(jié)晶率在52.56%～71.50%之間。

表2 BBD設(shè)計(jì)表與實(shí)測(cè)的D-阿洛酮糖結(jié)晶率Table 2 Box-Behnken design matrix and response values for D-psicose recovery rate

使用統(tǒng)計(jì)軟件Design-Expert V.8.0.6對(duì)表2實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,并采用多元回歸分析,得到自變量X1、X2和X3與因變量Y1之間的模擬回歸方程,如公式(4)和(5)所示。

式(4)

式中,Y表示D-阿洛酮糖的結(jié)晶率。X1、X2、X3的編碼值分別表示乙醇與D-阿洛酮糖濃縮液比,結(jié)晶時(shí)間(h)和結(jié)晶溫度(℃)。

表3 對(duì)于D-阿洛酮糖結(jié)晶率的 響應(yīng)曲面回歸模型的單因素方差分析Table 3 Analysis of variance(ANOVA)for the response surface regression model of D-psicose recovery rate

注:*表示顯著性差異,P<0.05;**表示極顯著差異,P<0.01。

圖4 兩因素交互作用的響應(yīng)面圖Fig.4 Response surface diagram of two-factor interaction

2.4 響應(yīng)曲面及結(jié)晶工藝的優(yōu)化

采用BBD設(shè)計(jì)和響應(yīng)曲面分析,研究了三個(gè)自變量對(duì)D-阿洛酮糖結(jié)晶率影響。三維響應(yīng)曲面圖如圖4所示。保持三個(gè)自變量的其中一個(gè)在中間水平,其余兩個(gè)自變量組成了一系列同心圓或橢圓。這一系列的同心圓或者橢圓表征了變量之間的相互影響是否顯著。橢圓曲線表明,相應(yīng)的變量之間的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響是顯著的。而圓形曲線意味著變量之間的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響是不顯著的[19-20]。由此可知,乙醇阿洛酮糖濃縮液比與結(jié)晶溫度,結(jié)晶時(shí)間與結(jié)晶溫度的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響是顯著的(近似橢圓形)。

通過RSM優(yōu)化D-阿洛酮糖結(jié)晶的最佳工藝參數(shù)為:乙醇與D-阿洛酮糖濃縮液比為3.84∶1,結(jié)晶溫度和結(jié)晶時(shí)間分別為25.46 ℃和5.42 h?？紤]到實(shí)際操作條件,乙醇與D-阿洛酮糖濃縮液比設(shè)定為3.8∶1,結(jié)晶溫度設(shè)定為25 ℃,結(jié)晶時(shí)間修正為325 min。在修正的條件下,BBD預(yù)測(cè)的D-阿洛酮糖結(jié)晶率為71.10%。為驗(yàn)證該模型的可信度,進(jìn)行了3組平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),平均結(jié)晶率為71.58%?？傮w而言,該模型與預(yù)測(cè)值相對(duì)誤差為0.67%,理論預(yù)測(cè)值與實(shí)際測(cè)定值吻合度較高,對(duì)實(shí)際應(yīng)用具有較的模擬效果。

3 結(jié)論

在乙醇溶液體系中結(jié)晶D-阿洛酮糖。為獲得高結(jié)晶率D-阿洛酮糖晶體,用響應(yīng)曲面法來優(yōu)化結(jié)晶過程中的工藝參數(shù)。優(yōu)化的最佳操作條件為:D-阿洛酮糖溶液的密度為1.35 g/mL,乙醇與D-阿洛酮糖濃縮液的比例為3.8∶1,結(jié)晶時(shí)間和溫度分別為325 min和25 ℃。在此條件下,D-阿洛酮糖的結(jié)晶率可達(dá)71.58%。此工藝簡單易行,操作安全,可為D-阿洛酮糖的結(jié)晶產(chǎn)業(yè)提供依據(jù)。