枸杞總黃酮提取工藝優(yōu)化及其體外抗氧化活性分析

祿 璐,米 佳,羅 青,李越鯤,梁曉婕,閆亞美

(寧夏農(nóng)林科學(xué)院枸杞工程技術(shù)研究所,寧夏銀川 750002)

黃果枸杞是近年來新發(fā)掘的枸杞品種,屬于寧夏枸杞的變種[1],果實(shí)呈黃色,酸甜可口,含氨基酸、多糖、類胡蘿卜素、多酚等多種營養(yǎng)及功效成分,目前主要集中在寧夏地區(qū)示范推廣種植[2-3]。

黃酮是一類重要的天然有機(jī)化合物,結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣,具有很強(qiáng)的藥理作用。大量研究表明,黃酮類化合物具有較強(qiáng)的抗氧化作用,可廣泛影響心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和消化系統(tǒng)[4-7],對保護(hù)肝損傷亦有顯著療效[8]。黃果枸杞富含黃酮類化合物,如蘆丁、柚皮素、香葉木素、兒茶素、表兒茶素、槲皮素、山奈酚、柚皮素-7-O-葡萄糖苷等。一般提取黃酮的方法有水提法、醇提法、超聲波/微波輔助提取法、亞臨界乙醇提取法、生物酶提取法等等[9-11],通過對溶劑的選擇、提取水溫、提取時(shí)間的調(diào)控與優(yōu)化,提高黃酮得率[12-14]。但目前由于黃果枸杞尚未形成規(guī)?；N植和管理,因此,黃果枸杞的諸多基礎(chǔ)研究,如功效成分的提取與鑒定、功效評價(jià)等方面的工作還未開展。

本研究基于黃果枸杞中豐富的黃酮物質(zhì),采用響應(yīng)面方法優(yōu)化黃酮提取工藝,并對不同種質(zhì)枸杞黃酮提取物進(jìn)行體外抗氧化活性測定分析,以期為枸杞的基礎(chǔ)研究及資源的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)和理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃果枸杞(“寧農(nóng)杞4號”、“寧農(nóng)杞5號”、“寧夏黃果”)、紅果枸杞(“寧杞1號”)、黑果枸杞 國家枸杞工程技術(shù)研究中心種質(zhì)資源圃(寧夏,銀川),經(jīng)國家枸杞工程技術(shù)研究中心種質(zhì)資源室鑒定。取樣時(shí),隨機(jī)摘取枸杞樹不同位置的果實(shí),果實(shí)八成熟,并保持成熟度相對一致,采后迅速置于-80 ℃超低溫冰箱速凍備用;維生素C、沒食子酸、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品 成都曼思特生物科技有限公司;無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、福林酚、丙酮、濃鹽酸、醋酸鈉、冰乙酸、過硫酸鉀、ABTS、DPPH、甲醇、三吡啶三吖嗪(TPTZ)等 均為國產(chǎn)分析純。

BS224S分析天平 德國賽多利斯公司;TU1810紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;恒溫水浴鍋 北京長源實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠;SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式多用真空泵 天津華鑫儀器廠;全數(shù)字超聲波發(fā)生器 武漢嘉鵬電子有限公司;Centrifuge 5810 R冷凍型臺式大容量高速離心機(jī) 德國艾本德公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 黃果枸杞黃酮提取工藝優(yōu)化 以“寧農(nóng)杞5號”黃果枸杞作為優(yōu)化提取黃酮工藝的試驗(yàn)材料。稱取超低溫速凍的黃果枸杞3.0 g于研缽中,迅速研磨至果泥狀,轉(zhuǎn)入燒杯中,加入一定濃度、一定體積倍數(shù)的乙醇溶液溶解,攪拌混合均勻后在一定的水浴溫度下加熱一定時(shí)間,再置于300 W超聲波下輔助提取30 min,冷卻后,3000 r/min離心5 min,取上清液,得到黃酮提取液,隨即測定總黃酮的含量。

1.2.2 單因素試驗(yàn) 采用控制變量法,按照1.3.1黃酮提取工藝,考察乙醇濃度(50%、60%、70%、80%、90%)、乙醇體積倍數(shù)(乙醇添加體積與樣品質(zhì)量的倍數(shù),10、20、30、40、50)、水浴溫度(40、50、60、70和80 ℃)、水浴時(shí)間(30、50、70、90和110 min,)對提取總黃酮含量的影響。考察某一因素時(shí),其他因素條件固定為:乙醇濃度70%,乙醇體積倍數(shù)40,水浴溫度70 ℃,水浴時(shí)間90 min。

1.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,利用Design-Expert 8.06軟件Box-Behnken 設(shè)計(jì),進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì),以乙醇濃度(A)、乙醇體積倍數(shù)(B)、水浴溫度(C)、水浴時(shí)間(D)為因變量,以總黃酮含量為響應(yīng)值,設(shè)計(jì)四因素三水平響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn),中心試驗(yàn)重復(fù)5 次,共29 組試驗(yàn),具體如表1所示。

表1 Box-Behnken設(shè)計(jì)因素與水平表Table 1 Variables and levels in Box-Behnken central composite design

1.2.4 黃果枸杞黃酮提取物體外抗氧化活性測定

1.2.4.1 黃果枸杞黃酮提取物成分測定 以三種種質(zhì)黃果枸杞為研究對象,以紅果枸杞(寧杞1號)、黑果枸杞為對照組,按照優(yōu)化后的黃酮提取方法,進(jìn)行黃酮化合物提取,并對不同種質(zhì)的黃酮提取物進(jìn)行總黃酮、總酚含量的測定。

總黃酮含量采用硝酸鋁顯色法測定總黃酮含量[15]。取提取液10 mL于25 mL容量瓶中,加5% NaNO2溶液0.5 mL搖勻,放置6 min,加入10% Al(NO3)3溶液0.5 mL搖勻,放置6 min,加4% NaOH 4 mL,再用30%乙醇定容,搖勻,放置10 min,于510 nm處測定樣品吸光值。以不同濃度蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液繪制所得標(biāo)準(zhǔn)曲線為:y=0.1066x-0.0017,R2=1.0000,x為吸光值,y為蘆丁含量(μg/mL),以此計(jì)算樣品中總黃酮的含量(μg/g 鮮重,以蘆丁計(jì))。

總酚含量測定采用Folin-Ciocalteu法測定[16]。稱取2.00 g樣品于250 mL圓底燒瓶,加入40 mL體積分?jǐn)?shù)60%乙醇溶液,攪拌均勻,在恒溫水浴鍋中75 ℃水浴,提取50 min。提取液以3000 r/min離心200 min,取上清液1 mL加入福林酚試劑1 mL,搖勻后再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)12% Na2CO3溶液2 mL,用水定容至25 mL,搖勻,室溫下避光反應(yīng)2 h后,765 nm波長下測定吸光值。同法制備不同濃度沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液,繪制所得標(biāo)準(zhǔn)曲線為:y=0.0904x+0.0012,R2=0.9982,x為吸光值,y為沒食子酸含量(μg/mL),并由此計(jì)算總酚含量(mg/g鮮重,以沒食子酸計(jì))。

1.2.4.2 ABTS自由基清除能力測定 參照Oyaizu[15]測定方法。將7 mmol/L ABTS+溶液與2.45 mmol/L K2S2O8混合,置于暗處反應(yīng)16 h制成ABTS+儲備液,用甲醇稀釋ABTS+溶液至吸光度為0.70±0.02(波長734 nm)制成ABTS+工作液。取30 μL黃酮提取液,加入3 mL ABTS+溶液渦旋10 s混勻,6 min后測量其在波長734 nm處的吸光度,ABTS+清除率(A)計(jì)算公式如下:

式中:A2為加入提取物的吸光度;A1為本底吸收的吸光度;A0為空白溶液的吸光度。

配置不同濃度VC標(biāo)品溶液,以VC的質(zhì)量(mg)為橫坐標(biāo),清除率(%)為縱坐標(biāo),得到VC清除ABTS+自由基的標(biāo)準(zhǔn)曲線,y=9959.4485x-0.4185,R2=0.9934。將樣品清除率代入標(biāo)曲,結(jié)果表示為每克鮮黃果枸杞的VC當(dāng)量(mg VCeq./g鮮重)。

1.2.4.3 DPPH自由基清除能力測定 參照Atoui[16]測定方法。吸取黃酮提取液0.5 mL,加入 0.1 mmol/L DPPH自由基溶液4.0 mL,用甲醇定容至6 mL搖勻,放置30 min。以60%甲醇調(diào)零,517 nm處測定吸光度。DPPH自由基清除率(B)計(jì)算公式如下:

式中:A2為加入提取物的吸光度;A1為本底吸收的吸光度;A0為空白溶液的吸光度。

以VC的質(zhì)量(mg)為橫坐標(biāo),清除率(%)為縱坐標(biāo),得到VC清除DPPH自由基的標(biāo)準(zhǔn)曲線,y=2454.2697x-1.7252,R2=0.9932。將樣品清除率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)果表示為每克鮮黃果枸杞的VC當(dāng)量(mg VCeq./g鮮重)。

1.2.4.4 還原力測定(FRAP) 參照Wang[17]測定方法。取10 mmol/L TPTZ溶液 10 mL,0.3 mol/L醋酸鈉緩沖液(pH=3.6)100 mL,20 mmol/L的FeCl3溶液10 mL 混合均勻后置于35 ℃水浴中孵化30 min后使用,現(xiàn)用現(xiàn)配。吸取不同濃度VC標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.1 mL,加入TPTZ工作液0.9 mL,醋酸鈉緩沖液9 mL。于35 ℃水浴中反應(yīng)30 min,分別測定597 nm 波長處吸光值,FRAP值以吸光值表示。

以VC的質(zhì)量(mg)為橫坐標(biāo),吸光值為縱坐標(biāo),得到VC標(biāo)準(zhǔn)溶液FRAP標(biāo)準(zhǔn)曲線,y=24.5559x+0.0411,R2=0.9933。樣品的測定方法同標(biāo)曲,將樣品吸光值代入標(biāo)曲,結(jié)果表示為每克鮮黃果枸杞的VC當(dāng)量(mg VCeq./g 鮮重)。

1.2.5 相關(guān)性分析 分析比較不同黃果枸杞黃酮提取物的抗氧化活性與其總黃酮、總酚含量的相關(guān)性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件、Origin 8.5繪圖軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)方差顯著性處理和分析,測定數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 乙醇濃度對總黃酮含量的影響 如圖1所示,總黃酮含量隨著提取劑乙醇濃度的增大而升高,當(dāng)乙醇濃度為70%時(shí),總黃酮含量最高;當(dāng)其濃度大于70%時(shí),總黃酮含量逐漸減少。黃酮類物質(zhì)在一定的乙醇-水體系下容易溶出,而當(dāng)乙醇濃度過大時(shí),其他醇溶性色素、親脂溶性物質(zhì)溶出增多,這些成分與黃酮類化合物競爭同乙醇-水分子結(jié)合[9-10],從而抑制黃酮類物質(zhì)的溶出,導(dǎo)致總黃酮含量下降。

圖1 乙醇濃度對總黃酮含量的影響Fig.1 Effects of ethanol concentration on total flavonoids content注:圖中不同字母表示差異顯著(P<0.05),圖2～4同。

2.1.2 乙醇體積對總黃酮含量的影響 提取溶劑的量是提取天然產(chǎn)物過程中尤為重要的因素之一。如圖2所示,隨著乙醇體積的增加,總黃酮含量呈現(xiàn)先升高后下降趨勢,這表明溶劑體積的增加,能夠促進(jìn)物料和溶劑更加充分的接觸和反應(yīng),使黃酮類物質(zhì)更易溶出;當(dāng)乙醇體積倍數(shù)達(dá)到40時(shí),提取的總黃酮含量最高。

圖2 乙醇體積對總黃酮含量的影響Fig.2 Effects of ethanol volume on total flavonoids content

圖3 水浴溫度對總黃酮含量的影響Fig.3 Effects of water bath temperature on total flavonoids content

2.1.3 水浴溫度對總黃酮含量的影響 如圖3所示,隨著水浴溫度從40 ℃向70 ℃升高,總黃酮含量隨之升高,當(dāng)溫度達(dá)到80 ℃時(shí),黃酮含量略微下降(但不顯著),適當(dāng)水浴升溫可增加分子動能,增強(qiáng)滲透擴(kuò)散能力,利于物質(zhì)溶出。因此,水浴溫度應(yīng)控制在70 ℃。

2.1.4 水浴時(shí)間對總黃酮含量的影響 總黃酮含量隨著水浴時(shí)間延長而不斷升高,當(dāng)高于90 min后,總黃酮含量顯著下降,分析原因可能是由于水浴時(shí)間過長,乙醇揮發(fā)較多,使總黃酮的提取下降,也可能是黃酮類物質(zhì)已經(jīng)基本溶出,此時(shí)延長水浴時(shí)間,不僅引起其他物質(zhì)溶出,還會使部分熱敏化合物發(fā)生降解反應(yīng)[17-18]。

表2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of response surface experiments

圖4 水浴時(shí)間對總黃酮含量的影響Fig.4 Effects of water bath time on total flavonoids content

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析

基于單因素試驗(yàn)確定的適宜范圍,依據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,設(shè)計(jì)四因素三水平黃果枸杞黃酮提取優(yōu)化試驗(yàn),共29組試驗(yàn),試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

經(jīng)Design-Expert 8.06軟件回歸擬合,建立提取工藝參數(shù)回歸模型,得到總黃酮含量(Y)對乙醇濃度(A)、乙醇體積倍數(shù)(B)、水浴溫度(C)、水浴時(shí)間(D)的二次多項(xiàng)回歸方程:Y=175.22+0.43A+3.36B+29.44C-2.57D-7.09AB+23.10AC+13.64AD+3.27BC+8.93BD-2.17 CD-22.15A2-14.2B2-41.75C2-32.65D2。

對上述回歸方程進(jìn)行方差分析及顯著性檢驗(yàn),如表3所示。結(jié)果表明:回歸方程模型極顯著(P<0.01);失擬項(xiàng)不顯著(P>0.05),模型相關(guān)系數(shù)為0.9957,調(diào)整確定系數(shù)為0.9914,預(yù)測模型系數(shù)為0.9873,說明模型與實(shí)際試驗(yàn)擬合程度良好,誤差較小,模型成立,可用來優(yōu)化分析、預(yù)測黃果枸杞黃酮提取工藝及其含量。

除乙醇濃度因素不顯著外,體積倍數(shù)(B)、水浴溫度(C)、水浴時(shí)間(D)均顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01);各因素對提取總黃酮的影響強(qiáng)弱順序依次為:水浴溫度(C)>乙醇體積倍數(shù)(B)>水浴時(shí)間(D)>乙醇濃度(A)。其中,乙醇濃度與體積倍數(shù)(AB)、乙醇濃度與水浴時(shí)間(AD)、乙醇濃度與水浴溫度(AC)、體積倍數(shù)與水浴時(shí)間(BD)因素之間交互作用極顯著(P<0.01),如圖5所示。

由Design-Expert 8.06軟件預(yù)測出的最佳提取工藝參數(shù)為:乙醇濃度為72.10%、體積倍數(shù)為41.17、水浴溫度為72.08 ℃、水浴時(shí)間為90.13 min,此條件下,總黃酮含量為181.556 μg/g,為驗(yàn)證模型的可靠性,考慮到實(shí)際操作條件,調(diào)整工藝參數(shù)為:乙醇濃度70%、體積倍數(shù)40倍、水浴溫度70 ℃、水浴時(shí)間90 min,進(jìn)行五組試驗(yàn),得到總黃酮含量為(175.21±1.69) μg/g,理論值與預(yù)測值相差3%,誤差較小,說明此模型可以有效用于黃果枸杞中的黃酮提取工藝優(yōu)化。

表3 回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)和結(jié)果Table 3 Test of significance for regression coefficient and results

注:**表示差異極顯著,P<0.01;*表示差異顯著,P<0.05。

圖5 黃酮提取優(yōu)化試驗(yàn)響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface plots for flavonoids extraction yield

2.3 體外抗氧化活性分析

2.3.1 不同枸杞抗氧化活性分析 “寧農(nóng)杞4號”、“寧農(nóng)杞5號”和“寧夏黃果”是黃果枸杞品系中最具代表性的三個(gè)品種,以紅果枸杞(“寧杞1號”)和黑果枸杞作為對照組,均按照上述“寧農(nóng)杞5號”響應(yīng)面優(yōu)化后的黃酮最佳提取方法制備,獲得不同品種枸杞黃酮提取液,并比較不同品種枸杞黃酮提取物的抗氧化活性,結(jié)果如圖6所示。對ABTS自由基的清除能力由強(qiáng)到弱依次為:黑果枸杞>寧農(nóng)杞5號>寧夏黃果>寧杞1號>寧農(nóng)杞4號,其中寧夏黃果與寧杞1號差異不顯著(P>0.05),DPPH清除能力結(jié)果與ABTS結(jié)果一致;Fe3+還原能力由強(qiáng)到弱依次為:黑果枸杞>寧杞1號>寧農(nóng)杞4號>寧農(nóng)杞5號>寧夏黃果,其中寧農(nóng)杞4號、寧農(nóng)杞5號和寧夏黃果差異不顯著(P>0.05)。

圖6 不同枸杞黃酮提取物體外抗氧化能力比較Fig.6 Comparison of antioxidant activity of flavonoids extract from different wolfberry in vitro

將上述抗氧化活性結(jié)果轉(zhuǎn)換化成VC當(dāng)量,得到表4,結(jié)合圖6可知,五種枸杞中,黑果枸杞和“寧農(nóng)杞5號”黃果枸杞具有較強(qiáng)的清除ABTS+和DPPH自由基的能力。

表4 不同抗氧化指標(biāo)對應(yīng)的VC當(dāng)量 Table 4 VC equivalent of different antioxidant indexes

注:同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.3.2 不同抗氧化活性與活性成分的相關(guān)性分析 由表5可知，三種黃果枸杞中,“寧農(nóng)5號”總黃酮及總酚含量最高,其中總黃酮含量是其他兩種黃果枸杞的1.4～2.3倍,是紅果枸杞的1.7倍,對照組紅果枸杞(“寧杞1號”)總酚含量最低。黑果枸杞由于其種質(zhì)特殊性,含有豐富且獨(dú)特的花色苷成分,因此總黃酮和多酚含量在幾種枸杞果實(shí)中含量最高。已有研究表明,不同黃酮化合物組成對抗氧化活性影響較大,酚羥基及內(nèi)氫鍵數(shù)目是黃酮類化合物表現(xiàn)抗氧化活性的重要影響因素,7-O位黃酮衍生物具有較母體化合物強(qiáng)的生物活性,特別是山奈酚衍生物和槲皮素衍生物,是黃酮類化合物表現(xiàn)抗氧化、抗癌等生物活性的重要物質(zhì)組成[18-20],但目前黃果枸杞中的黃酮組成還不明晰,有待進(jìn)一步研究。

表5 不同枸杞黃酮提取物組成Table 5 Compose of flavonoids extract of different wolfberry

注:同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

表6 不同枸杞黃酮提取物組成與抗氧化能力的相關(guān)性Table 6 Correlation between flavonoids extract and antioxidant capacity of different wolfberry

注:表中“*”表示相關(guān)性顯著(P<0.05);“**”表示相關(guān)性極顯著(P<0.01)。

如表6所示,總黃酮含量與ABTS+清除率呈顯著正相關(guān)(P<0.05),相關(guān)系數(shù)為0.909,與DPPH清除率和FRAP呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)相關(guān)系數(shù)分別為0.992和0.969;總酚含量與ABTS+清除率、DPPH清除率呈顯著正相關(guān)(P<0.05),相關(guān)系數(shù)分別為0.903和0.907。綜合表明,黃酮是黃果枸杞表現(xiàn)抗氧化活性的主要成分[21-22]。

3 結(jié)論

黃酮類化合物是黃果枸杞功效物質(zhì)的重要組成,試驗(yàn)結(jié)果表明,水浴溫度是影響黃果枸杞黃酮提取的主要因素,最佳提取工藝參數(shù)為:乙醇濃度70%、乙醇體積倍數(shù)40倍、水浴溫度70 ℃、水浴時(shí)間90 min,此時(shí)黃酮含量為(175.21±1.69)μg/g;體外抗氧化活性分析表明,黃果枸杞中“寧農(nóng)杞5號”對ABTS+清除率和DPPH清除能力最強(qiáng),高于紅果枸杞(“寧杞1號”),但不及黑果枸杞;通過相關(guān)性分析可知,總黃酮含量與ABTS+清除率呈顯著正相關(guān),與DPPH清除率和FRAP值呈極顯著正相關(guān);總酚含量與ABTS清除率、DPPH清除率呈顯著正相關(guān)。綜合表明,黃酮類化合物是黃果枸杞表現(xiàn)抗氧化活性的主要成分。后續(xù)將對黃果枸杞中的黃酮化合物進(jìn)行進(jìn)一步分離鑒定,為黃果枸杞的綜合開發(fā)與利用提供理論支撐。