響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助提取代代花總黃酮的工藝及其抗氧化活性研究

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(1.大連民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,遼寧大連 116600; 2.生物技術(shù)與資源利用教育部重點實驗室,遼寧大連 116600; 3.大連理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,遼寧大連 116024)

代代花(CitrusaurantiumL.var daidai)隸屬蕓香科、柑橘屬,又名回青橙、玳玳花等。代代花為常綠小喬木,喜溫暖濕潤的生長環(huán)境,原產(chǎn)地為我國浙江省,現(xiàn)我國東南、華北及長江流域中下游地區(qū)均有栽培[1]。代代花氣香,味微苦,據(jù)《浙江中藥手冊》載:可“調(diào)氣疏肝,治胸膈及脘宇痞痛”。代代花食用和藥用歷史悠久,主要用于胸悶、腹痛、積食、少食、痰飲、嘔吐?，F(xiàn)代化學(xué)成分研究表明,代代花含有揮發(fā)油、黃酮、生物堿及多糖類成分[2-4]?，F(xiàn)代藥理研究表明,代代花中黃酮類化合物具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、抗補體和抑制脂肪生成等活性[5-8]。因此,開發(fā)一種高效實用的代代花總黃酮提取技術(shù)就顯得十分必要。

目前,關(guān)于代代花揮發(fā)油提取的研究較多[9-11],而對黃酮的提取卻鮮有研究,劉海林等[12]采用煎煮法對代代花總黃酮的提取進行了研究,傳統(tǒng)的提取黃酮的方法還有浸漬法、滲漉法、回流法、索氏提取法等,但是這些方法均存在耗時較長,得率低等缺點[13]。近年來,超聲輔助提取技術(shù)作為一種新型的提取方法廣泛應(yīng)用于植物中黃酮類化合物的提取[14-16],該技術(shù)是利用超聲波的機械效應(yīng)、空化效應(yīng)和熱效應(yīng),強化黃酮類物質(zhì)的溶出,從而達到快速高效提取的目的。與傳統(tǒng)的提取技術(shù)相比,超聲輔助提取技術(shù)具有操作簡易、得率高、節(jié)能環(huán)保等優(yōu)點[17-18]。

因此,本研究采用超聲輔助法提取代代花中的總黃酮,以乙醇濃度、提取時間、溫度、料液比為考察因素,通過Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計法探究其最佳的提取工藝條件,并對其體外抗氧化活性進行初步研究,以期為代代花的高值化開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

代代花 采購于河北安國中藥材批發(fā)市場,經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)佳木斯學(xué)院陳效忠副教授鑒定為代代花CitrusaurantiumL.var daidai的干燥花蕾;蘆丁對照品 中國藥品生物制品檢定所;2,2-二苯基-1-苦基苯肼(DPPH) 美國Sigma公司;硫酸亞鐵、水楊酸鈉、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

UV-2600紫外可見分光光度計 日本Shimadzu公司;KQ-100DB數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;LK-800A中藥粉碎機 北京北拓儀器設(shè)備有限公司;ME204E分析天平 瑞士Mettler Toledo公司;RV 10旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國IKA公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品預(yù)處理 將代代花藥材于25 ℃下自然風(fēng)干至恒重,粉碎,過60目篩,備用。

1.2.2 代代花總黃酮的提取 取1.2.1中處理好的代代花藥材粉末10 g,按一定的料液比加入一定濃度的乙醇溶液,然后利用超聲波清洗器進行輔助提取(40 kHz,100 W),在一定的提取溫度下提取一定的時間。重復(fù)提取3次,提取結(jié)束后,將提取液過濾,合并,搖勻備用。

1.2.3 單因素優(yōu)化實驗

1.2.3.1 乙醇濃度對代代花黃酮得率的影響 精確稱量10 g 代代花藥材粉末6份,分別加入30%、40%、50%、60%、70%、80%乙醇溶液(v/v),控制液料比為20∶1 (g/mL)、超聲提取時間為30 min、提取溫度為55 ℃、提取3次,合并、過濾提取液,計算代代花黃酮的得率。

1.2.3.2 液料比對代代花黃酮得率的影響 精確稱量10 g代代花藥材粉末6份,加入不同體積的60%乙醇溶液(v/v),使液料比分別為5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1 (mL/g),并控制超聲提取時間為30 min、提取溫度為55 ℃、提取3次,合并過濾提取液,并計算代代花黃酮的得率。

1.2.3.3 提取時間對代代花黃酮得率的影響 精確稱量10 g代代花藥材粉末6份,加入20倍(g/mL)量的60%乙醇溶液(v/v),并控制提取溫度為55 ℃,分別每次提取10、20、30、40、50、60 min,提取3次,合并過濾提取液,并計算代代花黃酮的得率。

1.2.3.4 提取溫度對代代花黃酮得率的影響 精確稱量10 g代代花藥材粉末6份,加入20倍(g/mL)量的60%乙醇溶液(v/v),并控制超聲提取時間為30 min,分別于25、35、45、55、65、75 ℃條件下提取,提取3次,合并過濾提取液,并計算代代花黃酮的得率。

1.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗 根據(jù)單因素試驗得出的最佳提取條件:乙醇濃度60(v/v),液料比20∶1 (mL/g),提取時間30 min,提取溫度55 ℃,控制提取次數(shù)為3次,根據(jù)Box-Behnken組合設(shè)計原理,以總黃酮的得率為響應(yīng)值(Y),對四個影響得率的主要因素:乙醇濃度(A)、料液比(B)、提取時間(C)、提取溫度(D)分別設(shè)定三個水平,并分別編碼為-1、0、1,進行試驗設(shè)計優(yōu)化。響應(yīng)面試驗因素與水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments

1.2.5 總黃酮含量的測定 精確稱量蘆丁標準品10 mg,用30%乙醇溶液(v/v)定容至100 mL。分別取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL標準液于10 mL容量瓶中,再加入0.3 mL的5% NaNO2溶液(w/v),搖勻,靜置6 min后,加入0.3 mL的10% Al(NO3)3溶液(w/v),搖勻,靜置6 min后,再加入2.0 mL的4% NaOH溶液(w/v),之后用30%乙醇溶液定容至刻度線,搖勻,靜置15 min。以空白試劑作對照,在510 nm處測定溶液的吸光度(A),以蘆丁濃度(C)對吸光度進行線性擬合,得回歸方程為A=11.0571C-0.0007(R2=0.9998),表明蘆丁在濃度范圍為10～60 μg/mL內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

代代花總黃酮的得率計算公式如下:

式中:n為稀釋倍數(shù),C為測量的總黃酮濃度(μg/mL),V為樣品的總體積(mL),W為代代花藥材粉末的質(zhì)量(g)。

1.2.6 抗氧化活性實驗

1.2.6.1 DPPH·清除能力 代代花提取物的DPPH·清除能力測試根據(jù)Su等報道的方法[19],并略有改動。將1.5 mL的DPPH·(86.2 μmol/L)與1.5 mL不同濃度的提取液(0.1、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mg/mL)混合,搖勻。在室溫下靜置30 min后,在517 nm處測定反應(yīng)體系的吸光度,以VC作陽性對照,DPPH·清除率按照下列公式計算:

式中:Aa為含DPPH·與樣品溶液吸光度;Ab為只含樣品溶液的吸光度;Ac為只含DPPH·溶液吸光度。

1.2.6.2 ·OH清除能力 代代花提取液的·OH清除能力測試根據(jù)Wang等報道的方法[20],并略有改動。首先,將0.5 mL的FeSO4(8 mmol/L)、0.8 mL的H2O2(6 mmol/L)與1.5 mL不同濃度的提取液(0.05、0.1、0.2、0.4、0.8和1.0 mg/mL)混合,搖勻后,加入0.2 mL的水楊酸鈉溶液(20 mmol/L)啟動反應(yīng)。然后,將反應(yīng)體系于37 ℃恒溫水浴中避光孵育1 h。以VC作陽性對照,在510 nm處測定反應(yīng)體系的吸光度,·OH清除率按照下列公式計算:

式中:A0、A1、A2分別為加入全部物質(zhì)、不加入樣品、不加入水楊酸鈉組的吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016軟件處理對單因素試驗數(shù)據(jù)進行分析,采用Design-Expert 10軟件進行響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計和數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 乙醇濃度對代代花總黃酮得率的影響 乙醇濃度對代代花總黃酮得率的影響結(jié)果見圖1,可知在乙醇濃度由30%增至60%時,代代花總黃酮的得率逐漸增大;70%和80%乙醇作為提取液時的總黃酮的得率小于60%乙醇,這可能是因為乙醇濃度過低會導(dǎo)致大量的水溶性雜質(zhì)溶出,如蛋白質(zhì)、糖類等;而乙醇濃度過高會導(dǎo)致大量的醇溶性、脂溶性雜質(zhì)溶出,從而影響黃酮類化合物的溶出,使黃酮類化合物的得率降低[21]。因此,選擇60%乙醇作為提取溶劑。

圖1 乙醇濃度對代代花總黃酮得率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on the extraction yield of total flavonoids

2.1.2 液料比對代代花總黃酮得率的影響 液料比對代代花總黃酮得率的影響結(jié)果見圖2,可知液料比在5∶1～20∶1 mL/g范圍內(nèi)時,代代花總黃酮的得率隨提取溶劑的增多而逐漸增大,可能原因是液料比增大時,會有更多的提取溶劑進入代代花的細胞組織,可以使更多的黃酮類物質(zhì)從代代花中釋放出來,從而提高了總黃酮的得率;但液料比增大到20 mL/g后,總黃酮的得率隨著提取溶劑量的增大呈現(xiàn)出平衡趨勢,這與Xiong等的報道一致[22],同時考慮到提取成本與回收效率,故確定液料比為20∶1 mL/g。

圖2 液料比對代代花總黃酮得率的影響Fig.2 Effect of liquid-solid ratio on extraction yield of total flavonoids

2.1.3 提取時間對代代花總黃酮得率的影響 提取時間對代代花總黃酮得率的影響如圖3所示,由圖3可知,當(dāng)提取時間由10 min增至30 min時,代代花總黃酮的得率逐漸增大,此后總黃酮的得率逐漸小幅度減小,可能原因是延長提取時間,可以使更多的黃酮類物質(zhì)從代代花中溶出,從而使得率增加;當(dāng)提取時間到達30 min后,總黃酮的得率呈下降趨勢,這可能是因為黃酮類物質(zhì)經(jīng)長時間的高溫浸泡,分子結(jié)構(gòu)遭到破壞,同時伴隨著其他雜質(zhì)的溶出,從而導(dǎo)致得率略微降低[23]。因此,選擇提取時間為30 min。

圖3 提取時間對代代花總黃酮得率的影響Fig.3 Effect of extraction time on extraction yield of total flavonoids

2.1.4 提取溫度對代代花總黃酮得率的影響 提取溫度對代代花總黃酮得率的影響結(jié)果見圖4。由圖4可知,當(dāng)提取溫度由25 ℃增至55 ℃時,代代花總黃酮的得率逐漸增大,溫度由55 ℃升至75 ℃時,總黃酮的得率逐漸減小,可能原因是升高提取溫度會導(dǎo)致黃酮類化合物分子擴散速率加快,從而有利于增大其溶解度;而繼續(xù)升高提取溫度時,黃酮類化合物分子結(jié)構(gòu)遭到破壞,導(dǎo)致得率降低。因此,選擇提取溫度為55 ℃。

圖4 提取溫度對代代花總黃酮得率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on extraction yield of total flavonoids

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果分析

響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計及結(jié)果如表2所示,對試驗結(jié)果進行分析,得回歸方程為:Y=2.55+0.016A+0.067B+0.20C+0.22D-2.5×10-3AB-0.020AC-0.015AD-0.13BC+0.05BD+0.082CD-0.31A2-0.14B2-0.22C2-0.28D2

由方差分析表3可知:四個因素對代代花總黃酮得率的影響從大到小依次為:提取溫度(D)、提取時間(C)、液料比(B)、乙醇濃度(A),其中提取溫度(D)、提取時間(C)、液料比(B)、液料比(B)與提取時間(C)的交互作用對得率的影響極顯著(P<0.001),提取溫度(D)與提取時間(C)的交互作用也對得率具有顯著影響(P<0.05),此外,模型P<0.0001,表明此回歸模型極顯著;失擬項P=0.1698>0.05,失擬項不顯著,表明不存在失擬因素,此模型的擬合程度較好;AdjR2=0.9636與R2=0.9818接近,表明回歸模型可靠。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Response surface experiment design and results

響應(yīng)面曲面圖可反映出當(dāng)其中兩個變量取零水平時,另外兩個變量的交互作用對響應(yīng)值的影響程度,響應(yīng)曲面圖坡度越陡峭,則表明兩因素交互效應(yīng)對響應(yīng)值的影響越顯著,反之,響應(yīng)曲面圖坡度平緩,說明其交互作效應(yīng)對響應(yīng)值的影響不顯著。此外,等高線的形狀及疏密程度也反映出兩因素交互效應(yīng)的強弱,若等高線密集呈橢圓形,說明其交互效應(yīng)對響應(yīng)值的影響顯著;若等高線越稀疏呈圓形,則表明其交互效應(yīng)對響應(yīng)值的影響不顯著。根據(jù)以上特征,由圖5可知,固定乙醇濃度與液料比,總黃酮得率隨著提取溫度和提取時間的同時增加呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢,且提取溫度50 ℃和提取時間30 min附近值對總黃酮得率有重要影響,且等高線圖呈橢圓形,說明兩因素之間的交互效應(yīng)顯著。固定提取時間與提取溫度,隨著乙醇濃度和液料比的同時增加,總黃酮得率呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢,且乙醇濃度60%、液料比20 mL/g附近值對總黃酮得率有重要影響,但等高線圖橢圓不明顯,說明兩因素之間的交互效應(yīng)不顯著。固定乙醇濃度與提取溫度,液料比較低時,等高線相對密集,說明在液料比低時,提取時間對總黃酮得率的影響顯著,增加提取時間可以顯著提高總黃酮得率,但當(dāng)液料比較高時,增加提取時間對總黃酮得率的影響不大。同理,可對其他兩因素的交互效應(yīng)進行分析。

表3 方差分析及顯著性檢驗結(jié)果Table 3 Analysis of variance and significance test of the regression model

注:*表示顯著(P<0.05);**表示極顯著(P<0.001)。

圖5 兩因素的交互作用對代代花總黃酮得率影響Fig.5 Effects of interaction of two factors on the extraction yield of total flavonoids

2.3 驗證試驗

采用響應(yīng)面法優(yōu)化分析得到最佳工藝條件為:乙醇濃度為59.97%、液料比為20.49∶1、提取溫度為59.72 ℃、提取時間為35.11 min,在此條件下預(yù)測代代花總黃酮的得率為2.66%。為方便實際操作,確定乙醇濃度為60%,液料比為20 mL/g、超聲溫度為60 ℃、提取時間35 min,并在此條件下平行試驗3次,得到代代花總黃酮的平均得率為2.62%,與預(yù)測值的相對誤差為1.50%,表明模型可靠,可用于代代花總黃酮的提取。

2.4 抗氧化活性結(jié)果分析

2.4.1 DPPH·清除能力分析 代代花總黃酮提取物的DPPH·清除能力結(jié)果如圖6所示,可知,當(dāng)代代花總黃酮粗提物濃度范圍在0.1～1.0 mg/mL時,對DPPH·清除率隨著樣品濃度的增加而增大,與抗壞血酸相比,代代花總黃酮提取物對DPPH·的清除能力相對較弱,當(dāng)抗壞血酸溶液濃度在0.2 mg/mL時,對DPPH·的清除率達90%,其IC50為0.078 mg/mL。當(dāng)樣品濃度為1.0 mg/mL時,對DPPH·的清除率達82.56%以上,其IC50為0.385 mg/mL,說明代代花60%乙醇提物對DPPH·具有一定的清除作用,但是略低于Karimi等[24]報道的代代花甲醇提取物的DPPH·清除能力(IC50為0.30 mg/mL)。

圖6 代代花總黃酮粗提物的DPPH·清除能力Fig.6 DPPH· scavenging capacity of crude flavonoids extracts

2.4.2 ·OH清除能力分析 代代花總黃酮粗提物的·OH清除能力如圖7所示,當(dāng)代代花總黃酮粗提物濃度范圍在0.05～0.4 mg/mL時,對·OH清除作用隨著樣品濃度的增加而快速增強,濃度大于0.4 mg/mL后,清除率隨樣品濃度的增加增幅較緩,當(dāng)濃度為1.0 mg/mL時,對·OH的清除率達86.25%,其IC50為0.255 mg/mL,而抗壞血酸的IC50為0.069 mg/mL,說明代代花總黃酮粗提物對·OH具有一定的清除作用,據(jù)報道,代代花主要的黃酮類成分,如橙皮苷、橙皮素、柚皮苷均具有較強的清除·OH的能力[25-26]。

圖7 代代花總黃酮粗提物的·OH清除能力Fig.7 ·OH scavenging capacity of crude flavonoids extracts

3 結(jié)論

本研究在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上,采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到代代花總黃酮的最佳工藝為乙醇濃度60%,液料比20∶1 (mL/g),提取溫度60 ℃,提取時間35 min。在此條件下代代花總黃酮的得率為2.62%,與模型預(yù)測值2.66%高度相符,說明本實驗采用的響應(yīng)面法優(yōu)化代代花總黃酮的超聲提取工藝,方法可行,具有實用價值。代代花總黃酮粗提物具有較好的DPPH·和·OH清除能力,其IC50分別為0.385和0.255 mg/mL,因此,代代花總黃酮粗提物有望開發(fā)為天然抗氧化劑。