干燥溫度對(duì)醇提余甘子多酚含量及其抗氧化活性的影響

鄧俊琳3,李晚誼,*,于麗娟2,陳 建3,李 宏2,夏 陳3,田 浩2,李智敏

(1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院藥用植物研究所,云南昆明 650205; 2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,云南昆明 650221; 3.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,四川成都 610066)

余甘子為大戟科葉下珠屬植物(PhyllanthusemblicaL.),又名油甘子、牛甘子、魚(yú)木果等,是一味重要的傳統(tǒng)民族藥材,其味苦、甘、酸、澀,性涼,主治血熱血淤、消化不良、腹脹、咳嗽、喉痛等癥[1]。衛(wèi)生部于2002年將余甘子列入“既是食品又是藥品的物品名單”之中。作為聯(lián)合國(guó)衛(wèi)生組織指定在全世界推廣種植的三種保健植物之一,余甘子廣泛分布于熱帶、亞熱帶,在我國(guó)主要分布于海南、福建、廣東、云南等地。余甘子果實(shí)含有大量的多酚類(lèi)、維生素C,黃酮類(lèi)、多糖等物質(zhì),具有抗氧化、抗癌、抗病毒、降血脂、抗缺氧等作用[2]。其中,多酚類(lèi)化合物作為植物重要的次生代謝產(chǎn)物,在種子萌發(fā)、植物生長(zhǎng)和發(fā)育、抗霜凍和防御病蟲(chóng)害等過(guò)程中均起到重要作用[3-4]。同時(shí)多酚類(lèi)化合物對(duì)人類(lèi)健康也有諸多益處,比如沒(méi)食子酸(Gallic acid)、柯里拉京(Corilagin)、鞣花酸(Ellagic acid)均具有抗氧化[5-7]、抑菌作用[5,8-9],訶子鞣酸(Chebulagic acid)具有抗血管生成[10]、改善乙醇誘導(dǎo)的胃損傷功效[11]等作用。

中藥材種類(lèi)與性質(zhì)各異,干燥方式及干燥溫度通常會(huì)影響藥材中的活性成分[12]。目前常用的干燥方式主要有曬干、陰干、熱風(fēng)干燥、真空冷凍干燥,以及新型的微波、遠(yuǎn)紅外、惰性粒子流化床等干燥技術(shù)。其中,自然干燥(曬干和陰干)易受天氣變化的影響,干燥不均勻,且長(zhǎng)時(shí)間大面積接觸自然界的昆蟲(chóng)[13];熱風(fēng)干燥較少受到受天氣、氣候等自然因素,便于根據(jù)不同藥效特性控制干燥溫度,其操作簡(jiǎn)單,生產(chǎn)成本低,適合工業(yè)化規(guī)?；a(chǎn),但因物料大面積暴露在氧氣和高溫條件下,其易發(fā)生氧化和熱降解,從而導(dǎo)致產(chǎn)品質(zhì)量下降[14];真空冷凍干燥又稱(chēng)冷凍干燥,被認(rèn)為是一種具有高提取率且可以保護(hù)多酚類(lèi)化合物結(jié)構(gòu)不被破壞的有效干燥方式[15],但是真空冷凍干燥設(shè)備昂貴、耗能大、投資成本高,在企業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)中往往受到諸多限制[16];其他新型的干燥技術(shù)均存在設(shè)備要求高、生產(chǎn)成本高等問(wèn)題,還未被大規(guī)模的廣泛應(yīng)用。

目前對(duì)余甘子的研究多集中在活性成分、藥理功能等方面,但對(duì)其品質(zhì)有較大影響的干燥方式研究甚少,尤其干燥方式對(duì)多酚類(lèi)化合物的影響未見(jiàn)報(bào)道。本文擬對(duì)干燥方式(熱風(fēng)干燥:較常用于規(guī)?；a(chǎn);冷凍真空干燥:被認(rèn)為是加工高質(zhì)量食品的最佳干燥方法)以及干燥溫度(凍干、40、60、80和100 ℃)進(jìn)行研究,考察其對(duì)余甘子醇提物中沒(méi)食子酸、柯里拉京、鞣花酸和訶子鞣酸4種活性成分的影響,以及對(duì)余甘子總多酚含量和抗氧化活性(ABTS自由基清除能力和DPPH自由基清除能力)的影響,以期為余甘子的合理加工提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

余甘子 2018年3月采收于云南省大理市賓川縣,經(jīng)云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院藥用植物研究所李晚誼教授鑒定并確認(rèn),樣品存檔于四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所功能食品研究室;沒(méi)食子酸、柯里拉京、鞣花酸、訶子鞣酸標(biāo)準(zhǔn)品 色譜純,純度≥98%,北京索萊寶科技有限公司;乙腈、甲醇 色譜純,美國(guó)MREDA公司;甲酸、福林酚、AlCl3、沒(méi)食子酸、水溶性VE等 均為分析純,成都市科龍化工試劑廠;0.22 μm微孔濾膜 美國(guó)MREDA公司。

FW-100高速萬(wàn)能粉碎機(jī) 北京科偉永興儀器有限公司;TD-4Z型臺(tái)式低速離心機(jī) 四川蜀科儀器有限公司;KH2200DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司;ELX-800型號(hào)酶標(biāo)儀 美國(guó)伯騰儀器有限公司;1260型高效液相色譜儀 美國(guó)Agilent公司;UV-6100型號(hào)紫外分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 供試樣品溶液的制備 挑選新鮮無(wú)損的余甘子果,用刀去核得果肉,分別采用冷凍真空干燥,40、60、80、100 ℃熱風(fēng)干燥(干燥過(guò)程中每隔1 h稱(chēng)重,當(dāng)相隔兩次重量之差≤2%時(shí)即認(rèn)定為已烘干),打粉,過(guò)60目篩備用。

稱(chēng)取余甘子果肉粉末1.00 g,加入8 mL 80%甲醇,40 ℃超聲40 min(超聲頻率40 kHz輸入功率200 W),6000 r/min離心10 min,收集上清液,再提取2次,合并3次上清液并定容到25 mL。0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾,作為高效液相色譜檢測(cè)的待測(cè)液,其余樣品用于檢測(cè)總多酚含量和抗氧化活性。

1.2.2 余甘子果肉醇提物HPLC定量分析 色譜柱:Poroshell 120 PFP柱(4.6 mm×100 mm,2.7 μm);DAD檢測(cè)器,檢測(cè)波長(zhǎng):254、280 nm;柱溫:30 ℃;流速:0.8 mL/min;進(jìn)樣量5 μL;流動(dòng)相:1%的甲酸水溶液(A)+乙腈(B)。梯度洗脫:0～5 min,B梯度變化3%～6%;5～10 min,B 6%～8%;10～25 min,B 8%～20%;25～30 min,B 20%～30%;30～35 min,B 30%～70%;35～38 min,B 70%～90%。

標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備:沒(méi)食子酸、柯里拉京、鞣花酸、訶子鞣酸標(biāo)準(zhǔn)品20 mg,分別用甲醇溶解并定容至10 mL作為標(biāo)準(zhǔn)品母液。以二倍稀釋法用甲醇將各標(biāo)準(zhǔn)品母液配制成一系列濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液,高效液相色譜待測(cè)。以沒(méi)食子酸、柯里拉京、鞣花酸、訶子鞣酸的質(zhì)量濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)(X),峰面積為縱坐標(biāo)(Y),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得線性方程如表1所示。

樣品中多酚單體的含量計(jì)算公式如下:

多酚單體含量(mg/g)=待測(cè)液中多酚單體濃度×稀釋倍數(shù)×樣品定容體積/提取質(zhì)量/1000

1.2.3 總多酚含量測(cè)定方法 采用福林酚法[17]。取10 μL待測(cè)液(稀釋適當(dāng)倍數(shù)),加入20 μL福林酚,混勻,室溫反應(yīng)5 min,再加入160 μL 5% Na2CO3,混勻,避光反應(yīng)1 h,于酶標(biāo)儀上765 nm檢測(cè)。以沒(méi)食子酸質(zhì)量濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo),吸光值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程:Y=0.0029X+0.0263(R2=0.9982,線性范圍4.30～275 μg/mL)。

表1 沒(méi)食子酸、柯里拉京、鞣花酸、訶子鞣酸標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線(n=6)Table 1 Ctandard curve of gallic acid,corilagin,ellagic acid and chebulagic acid(n=6)

樣品中總多酚含量計(jì)算公式如下:

總多酚提取量(mg/g)=待測(cè)液濃度×稀釋倍數(shù)×樣品定容體積/提取質(zhì)量/1000

1.2.4 ABTS+自由基清除能力測(cè)定 取20 μL待測(cè)液(稀釋適當(dāng)倍數(shù)),再加20 μL超純水(樣品時(shí)改為80%甲醇),加160 μL ABTS自由基溶液(K2S2O8溶液和ABTS溶液混合配制ABTS自由基溶液,最終混合液中K2S2O8濃度為2.45 mmol/L,ABTS濃度為7 mmol/L,在室溫下混合液避光孵育16 h,再用pH=7.0的PBS緩沖液稀釋混合液,使混合液734 nm處吸光值為0.7±0.0.2)溶液,避光反應(yīng)6 min,于酶標(biāo)儀734 nm處測(cè)定吸光值。以水溶性VE的質(zhì)量濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo),吸光值為縱坐標(biāo),制作標(biāo)準(zhǔn)曲線[18]。得回歸方程:Y=-0.006X+0.471(R2=0.997,線性范圍0～47.5 μg/mL)。

ABTS+自由基清除力(mg/g)=待測(cè)液濃度×稀釋倍數(shù)×樣品定容體積/提取質(zhì)量/1000

1.2.5 DPPH自由基清除能力測(cè)定 取20 μL待測(cè)液(稀釋適當(dāng)倍數(shù)),加入80 μL超純水(樣品時(shí)改為80%甲醇),再加100 μL DPPH(0.2 mmol/L)溶液,混勻,避光反應(yīng)30 min,于517 nm處測(cè)它的吸光值。以水溶性VE的質(zhì)量濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo),清除率(%)為縱坐標(biāo),制作標(biāo)準(zhǔn)曲線[19]。得回歸方程:Y=0.9428X-0.4202(R2=0.997,線性范圍13～104 μg/mL)。

清除率計(jì)算公式為:

清除率(%)=(1-Ax/A0)×100

式中:Ax:樣品的吸光度值;A0:乙醇代替樣品時(shí)的吸光值。

DPPH自由基清除力(mg/g)=待測(cè)液濃度×稀釋倍數(shù)×樣品定容體積/提取質(zhì)量/1000

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)試驗(yàn)的平均值,應(yīng)運(yùn)Microsoft Excel 2007和SPSS 20.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC測(cè)定不同干燥溫度下余甘子果肉中沒(méi)食子酸、柯里拉京、鞣花酸和訶子鞣酸的含量

如圖1所示,沒(méi)食子酸、柯里拉京、鞣花酸、訶子鞣酸在30 min內(nèi)均得到較好分離,樣品溶液色譜圖中4個(gè)目標(biāo)峰,保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)品溶液的4個(gè)色譜峰保留時(shí)間一致。

圖1 多酚化合物標(biāo)準(zhǔn)品和余甘子醇提樣品的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of standard pdyphenol compounds and aloohol extracted samples in the P. emblica注:1:沒(méi)食子酸,2:柯里拉京,3:訶子鞣酸,4:鞣花酸;A:80 ℃干燥的余甘子,B:40 ℃干燥的余甘子,C:冷凍干燥的余甘子,D:60 ℃干燥的余甘子,E:100 ℃干燥的余甘子,F:標(biāo)準(zhǔn)品。

由表2可知,隨著干燥溫度的升高,4種化合物含量呈現(xiàn)顯著增加的趨勢(shì),100 ℃烘干的余甘子中4種化合物含量均為最高。推測(cè)可能原因有以下四點(diǎn):其一,高溫造成植物組織細(xì)胞破碎促進(jìn)多酚類(lèi)物質(zhì)的釋放[19];其二,植物在遭受紫外輻射、高溫、機(jī)械傷害等逆境時(shí),苯丙烷代謝途徑中的關(guān)鍵酶苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性會(huì)迅速升高,同時(shí)積累大量酚酸、類(lèi)黃酮物質(zhì),以提高植物的抗逆性[20];其三,高溫破壞了原本與多糖、多肽等結(jié)合的結(jié)合態(tài)酚,使得釋放出更多的游離態(tài)多酚[19];其四,這4種多酚化合物對(duì)高溫有較強(qiáng)的耐受,其結(jié)構(gòu)不易被破壞。通常認(rèn)為物料大面積暴露在氧氣和高溫條件下易發(fā)生氧化和熱降解,從而導(dǎo)致產(chǎn)品質(zhì)量下降,而冷凍干燥在低溫條件下進(jìn)行,對(duì)物料的結(jié)構(gòu)、形狀及營(yíng)養(yǎng)成分破壞最小[21],因此冷凍干燥也被認(rèn)為是一種具有高提取率且可以保護(hù)多酚類(lèi)化合物結(jié)構(gòu)不被破壞的有效干燥方式[15]。但在本研究中,與熱風(fēng)干燥相比較,冷凍干燥樣品中4種多酚化合物提取率均為最低,這可能與高溫促進(jìn)游離態(tài)酚的釋放,以及這4種化合物的耐熱性有關(guān)。

表2 各溫度干燥處理后余甘子醇提物中4種多酚化合物的含量(mg/g)Table 2 Contents of 4 phenolic compounds in the alcohol extract of P. emblica under different drying temperature(mg/g)

注:小寫(xiě)字母代表不同溫度干燥的余甘子樣品中多酚化合物含量的差異顯著,P<0.05;表3同。

2.2 干燥溫度對(duì)余甘子果肉總多酚含量和抗氧化活性的影響

由表3可知,40 ℃時(shí)熱風(fēng)干燥處理下,余甘子中總多酚含量最低(149.89 mg/g);隨溫度升高,總多酚逐漸增加,當(dāng)溫度達(dá)到80 ℃時(shí),總多酚含量最高(200.92 mg/g),100 ℃熱風(fēng)干燥后余甘子總多酚含量略有下降(但差異不顯著)。冷凍干燥和60 ℃熱風(fēng)干燥獲得的余甘子總多酚含量無(wú)顯著差異。熱風(fēng)干燥可能一方面促進(jìn)植物組織細(xì)胞破碎和共價(jià)鍵的斷裂,促進(jìn)更多酚類(lèi)物質(zhì)的釋放[19],另一方面可能導(dǎo)致某些內(nèi)源酶失活,從而阻止酚類(lèi)物質(zhì)被氧化[22]。但當(dāng)熱風(fēng)干燥的溫度過(guò)高,可能破壞某些多酚化合物的結(jié)構(gòu),進(jìn)而導(dǎo)致總多酚的含量下降。

表4 余甘子醇提物中4種多酚化合物、總多酚和抗氧化活性的相關(guān)性分析Table 4 Correlation analysis of 4 phenolic compounds,total polyphenols and antioxidant activity in the alcohol extract of P. emblica

注:*代表顯著相關(guān),P<0.05;**代表極顯著相關(guān),P<0.01。

本次ABTS試驗(yàn)和DPPH試驗(yàn)的結(jié)果較一致,余甘子抗氧化活性最弱均為40 ℃干燥的樣品,最強(qiáng)為80 ℃干燥的樣品。此外,本實(shí)驗(yàn)中抗氧化活性隨著干燥溫度的變化趨勢(shì)與總多酚的變化趨勢(shì)也基本一致,這表明醇提液的抗氧化活性與總多酚含量有密切關(guān)聯(lián)。多酚是氫或電子供體,具有酚類(lèi)游離基中間體的共振非定域作用和沒(méi)有適合分子氧進(jìn)攻的位置,不會(huì)引起新的游離基或因連鎖反應(yīng)而被迅速氧化[23],因此具有抗氧化作用。

表3 余甘子醇提物中總多酚含量和抗氧化活性(mg/g)Table 3 Contents of total polyphenols and antioxidant activity in the alcohol extract of P. emblica(mg/g)

2.3 相關(guān)性分析

2.3.1 多酚化合物間相關(guān)性分析 相關(guān)性分析顯示(表4),沒(méi)食子酸、柯里拉京、鞣花酸、訶子鞣酸的含量之間呈現(xiàn)極顯著(P<0.01)正相關(guān)。研究表明,沒(méi)食子酸經(jīng)莽草酸途徑代謝產(chǎn)生:莽草酸在莽草酸脫氫酶作用下生成3-脫氫莽草酸,3-脫氫莽草酸烯醇化后在3-脫氫莽草酸脫氫酶作用下生成沒(méi)食子酸[24]。鞣花酸是沒(méi)食子酸的二聚衍生物,沒(méi)食子酸經(jīng)脫氫、異構(gòu)化、聚合、烯醇化等一系列反應(yīng)后生成鞣花酸[25]?？吕锢┡c訶子鞣酸的代謝途徑有待進(jìn)一步研究。

2.3.2 多酚化合物與抗氧化活性的相關(guān)性分析 由表4可知,本研究證實(shí)余甘子醇提物總多酚含量與ABTS+自由基清除力極顯著正相關(guān)(P<0.01)。研究表明,多酚抗氧化活性的強(qiáng)弱不僅與總多酚的含量有關(guān),還與其種類(lèi)和組成有關(guān)[26]。相關(guān)性分析表明,ABTS+自由基清除力與余甘子醇提物中訶子鞣酸呈極顯著正相關(guān)(P<0.01),與柯里拉京呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。本次試驗(yàn)中,余甘子醇提液的DPPH自由基清除力雖與總多酚含量隨干燥溫度變化趨勢(shì)一致,但并未表現(xiàn)出顯著相關(guān)性。

3 結(jié)論

研究不同干燥方式和不同干燥溫度處理的余甘子中4種多酚化合物和總多酚含量、抗氧化活性,結(jié)果表明，與冷凍干燥相比,熱風(fēng)干燥處理的余甘子樣品其4種多酚化合物含量和總多酚含量更高,抗氧化活性更強(qiáng)。此外,隨著干燥溫度的升高,4種多酚化合物含量逐漸增加,100 ℃時(shí)含量均達(dá)到最高;余甘子中總多酚含量和抗氧化活性逐漸增強(qiáng),80 ℃時(shí)總多酚含量最高、抗氧化活性最強(qiáng)。綜合來(lái)說(shuō),80 ℃熱風(fēng)干燥更利于余甘子中多酚類(lèi)化合物的釋放,且不會(huì)降低其抗氧化活性。

余甘子作為我國(guó)的傳統(tǒng)民族藥材,含有豐富的生物活性物質(zhì)以及諸多的生理功效。本文僅對(duì)冷凍真空干燥和熱風(fēng)干燥對(duì)余甘子醇提液中的4種多酚化合物含量及醇提液的抗氧化活性進(jìn)行了研究,對(duì)于余甘子加工過(guò)程中的指導(dǎo)是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的,其干燥方式和干燥溫度對(duì)其它活性成分以及功效的影響還有待進(jìn)一步研究。