近江牡蠣糖胺聚糖的抗氧化活性及其穩(wěn)定性

戴梓茹1,,禤日翔,孔 艷3,梁慶喜,梁冬萍,吳遠(yuǎn)清

(1.廣西北部灣海洋生物多樣性養(yǎng)護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西欽州 535011; 2.北部灣大學(xué)食品工程學(xué)院,廣西欽州 535011; 3.廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院,廣西南寧 530004)

近江牡蠣俗稱(chēng)蠔、海蠣子,是一種高蛋白、低脂肪的食品。其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高并含有大量的生物活性物質(zhì)[1]。近江牡蠣被冠以“海洋牛奶”的美稱(chēng),具有其獨(dú)特的保健功能和藥用價(jià)值[2-3]。牡蠣養(yǎng)殖業(yè)快速的發(fā)展,使得牡蠣產(chǎn)量迅速增加,導(dǎo)致牡蠣的市場(chǎng)價(jià)格下跌[4],因此,高效利用牡蠣資源具有一定的商業(yè)意義。

本文以近江牡蠣為原材料,經(jīng)過(guò)酶解法獲得近江牡蠣糖胺聚糖,采用清除·OH和DPPH·法研究近江牡蠣糖胺聚糖的·OH和DPPH·清除能力,并探討近江牡蠣糖胺聚糖的抗氧化活性及穩(wěn)定性,從而為保健食品和藥品行業(yè)的開(kāi)發(fā)利用提供相關(guān)的理論基礎(chǔ)和參考依據(jù),為充分利用近江牡蠣的生態(tài)資源提供可靠的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

近江牡蠣(Conchaostrea) 采集于欽州茅尾海海域,樣品采集后冰盒中冷藏,并迅速運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室,去殼,清洗干凈后-20 ℃凍藏,備用;胰蛋白酶、枯草桿菌中性蛋白酶 5000 U/g,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;胃蛋白酶(250000 U/g) 美國(guó)西格瑪公司;磷酸鹽緩沖溶液(pH7.4) 北京索萊寶科技有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 海金穗生物科技有限公司;95%乙醇 AR,成都市科隆化學(xué)品有限公司;鄰二氮菲 AR,廣東光華科技股份有限公司;乙二胺四乙酸(EDTA) AR,廣東省化學(xué)試劑工程技術(shù)研究開(kāi)發(fā)中心;硫酸亞鐵(FeSO4) AR,天津市大茂化學(xué)試劑廠(chǎng);過(guò)氧化氫(H2O2) AR,山東顧澎化工有限公司;硅藻土 AR,寧波鼎創(chuàng)新材料有限公司;活性炭 AR,河南瑞思環(huán)?？萍加邢薰?濃硫酸 98%,西隴科學(xué)股份有限公司。

FD5-series冷凍干燥機(jī) SIM公司;ZHSY-50WS恒溫水浴振蕩培養(yǎng)箱 上海知楚儀器有限公司;TGL20臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器開(kāi)發(fā)有限公司;R-300EL旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 瑞士步琪有限公司;V-1800PC分光光度計(jì) 上海美普達(dá)儀器有限公司;XS40精密分析天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 近江牡蠣糖胺聚糖制品的制備 參考胡雪瓊等[19]的方法制備近江牡蠣糖胺聚糖:將新鮮的近江牡蠣去殼、清洗、瀝干。將近江牡蠣全臟器與純水按質(zhì)量比1∶1攪拌混合,過(guò)膠體磨得到牡蠣漿液,調(diào)節(jié)pH至7.0,先加入1.0%的枯草桿菌中性蛋白酶混勻,放置在50 ℃恒溫水浴振蕩器酶解5 h后,90 ℃滅酶15 min。再調(diào)節(jié)pH至7.8,加入1.0%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))胰蛋白酶充分混勻后,在50 ℃下酶解5 h,最后經(jīng)90 ℃滅酶15 min。將通過(guò)酶解后的近江牡蠣溶液制成3%水解液,加入1.0%(W/V)硅藻土與1.0%(W/V)活性炭混合物,65 ℃恒溫水浴45 min,利用布氏漏斗進(jìn)行抽濾,再離心取上清液。利用等電點(diǎn)除雜蛋白法精制,經(jīng)0.45 μm有機(jī)濾膜抽濾后利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮處理,最后利用冷凍干燥得到近江牡蠣糖胺聚糖。

1.2.2 總糖和糖胺聚糖的測(cè)定 總糖的測(cè)定參考苯酚-硫酸法[20],準(zhǔn)確稱(chēng)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品20 mg溶解后定容至500 mL容量瓶中,分別吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6及1.8 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液至帶塞的試管中,各以蒸餾水補(bǔ)至2.0 mL,然后加入6% 苯酚1.0 mL及濃硫酸5.0 mL,靜置10 min,搖勻冷卻,室溫放置20 min以后于490 nm測(cè)光密度,以2.0 mL水按同樣顯色操作為空白,橫坐標(biāo)為葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品濃度,縱坐標(biāo)為吸光度值,得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn):y=3.0476x+0.0073(R2=0.9969)。將近江牡蠣糖胺聚糖稀釋后,取2 mL按上述步驟操作測(cè)吸光度值,參照總糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算近江牡蠣糖胺聚糖的總糖含量。

糖胺聚糖含量的測(cè)定參照阿利新藍(lán)比色法[3]繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。在比色管中分別加入0.2 mL的已經(jīng)配置好的100、200、400、600 μg/mL的糖胺聚糖標(biāo)準(zhǔn)液(肝素鈉),用0.1 mL水按同樣顯色操作為空白,在各管中精確加入1.5 mL的阿利新藍(lán)染液,混勻。靜置10 min后,于480 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值,以肝素鈉濃度為橫坐標(biāo),吸光度值為縱坐標(biāo),繪制糖胺聚糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為y=0.1332x+0.5134(R2=0.9965)。將樣品液0.2 mL按上述步驟測(cè)定其吸光度值,通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)求出樣品中糖胺聚糖的含量。

1.2.3 近江牡蠣糖胺聚糖體外抗氧化活性研究

1.2.3.1 ·OH清除率的測(cè)定 參考Li等[21]的方法測(cè)定羥基自由基(·OH)清除力(鄰二氮菲法)。

分別稱(chēng)取近江牡蠣糖胺聚糖樣品2.00 g,用水定容至100 mL,配制成20 mg/mL的化合物母液,繼而以蒸餾水稀釋制成2、4、6、8、10、12 mg/mL的一系列樣品待測(cè)液。具體測(cè)定方法如下:

樣品管:取0.6 mL鄰二氮菲溶液(5 mmol/L)加入0.4 mL磷酸鹽緩沖液(0.2 mol/L,pH7.4)混勻后,加入0.6 mL樣品溶液及0.6 mL EDTA(15 mmol/L),再次混勻后加入0.6 mL FeSO4溶液(5 mmol/L),充分混勻后加入0.8 mL H2O2(0.1%),搖勻后于37 ℃保溫1 h,536 nm處測(cè)吸光值計(jì)為As。

損傷管:以去離子水代替樣品,其余步驟同樣品管,所測(cè)吸光值計(jì)為Ad。

未損傷管:以去離子水代替H2O2,其余步驟同損傷管,所測(cè)吸光值計(jì)為Au。

樣液對(duì)·OH清除率表示為:

1.2.3.2 DPPH·清除能力 DPPH法采用Bao等[22]的方法并稍作修改。分別稱(chēng)取近江牡蠣糖胺聚糖樣品2.00 g,用水定容至100 mL,配制成20 mg/mL的化合物母液,繼而以蒸餾水稀釋制成2、4、6、8、10、12、14、16 mg/mL的一系列樣品待測(cè)液。分別往試管中加入對(duì)應(yīng)濃度樣品待測(cè)液1 mL,加入1 mL DPPH溶液(0.1 mmol/L,溶于無(wú)水乙醇),振蕩混勻,室溫避光反應(yīng) 30 min后,在517 nm處測(cè)其吸光值(AS),以1 mL無(wú)水乙醇加入1 mL蒸餾水調(diào)零,1 mL樣品待測(cè)液與1 mL無(wú)水乙醇混合物于517 nm處所測(cè)吸光記為Ac,1 mL蒸餾水與1 mL 0.1 mmol/L DPPH乙醇溶液混合后再測(cè)定波長(zhǎng)的吸光值記為A0。樣液對(duì)DPPH·的清除能力表示為:

1.2.4 近江牡蠣糖胺聚糖穩(wěn)定性研究 用蒸餾水配制濃度為6 mg/mL的近江牡蠣糖胺聚糖樣品溶液100 mL,充分溶解后靜置待用,抗氧化穩(wěn)定性研究參照孟良玉等[23]的方法并稍作修改。

1.2.4.1 溫度對(duì)糖胺聚糖穩(wěn)定性的影響 各取樣品液2 mL,分別在常溫(25 ℃,對(duì)照)、40、60、80、100 ℃下處理1 h,取出放冰上冷卻,用蒸餾水定容至5 mL,分別進(jìn)行·OH和DPPH·清除率的測(cè)定。

1.2.4.2 pH對(duì)糖胺聚糖穩(wěn)定性的影響 各取樣品液4 mL,用1 mol/L HCl溶液或1 mol/L NaOH溶液將pH分別調(diào)整至2.0、3.5、4.0、6.0、8.0、10.0,不調(diào)節(jié)pH組為對(duì)照試驗(yàn),用蒸餾水定容至5 mL,在室溫靜置1 h,分別進(jìn)行·OH和DPPH·清除率的測(cè)定。

1.2.4.3 紫外照射對(duì)糖胺聚糖穩(wěn)定性的影響 各取樣品液4 mL,在紫外燈下分別照射時(shí)長(zhǎng)為0(對(duì)照)、30、60、90、120、150 min,分別進(jìn)行·OH和DPPH·清除率的測(cè)定。

1.2.4.4 NaCl濃度對(duì)糖胺聚糖穩(wěn)定性的影響 各取樣品液4 mL,分別加入2 mL濃度為1、2、3、4、5 mmol/L的NaCl溶液,同時(shí)加2.0 mL蒸餾水做對(duì)照,充分混勻放置15 min,分別進(jìn)行·OH和DPPH·清除率的測(cè)定。

1.2.4.5 體外模擬胃腸道消化對(duì)糖胺聚糖穩(wěn)定性的影響 用蒸餾水配制濃度為6 mg/mL的近江牡蠣糖胺聚糖樣品溶液25 mL,取4 mL樣品定容至5 mL,記做未處理液A。取8 mL樣液用1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至2.00,加入胃蛋白酶1.00 mg(20.00 mg/g),37 ℃恒溫水浴90 min。用1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至7.50,定容至10 mL,收集一半反應(yīng)液,記為消化液B,冷卻至室溫,備用。向另一半反應(yīng)液中加入胰蛋白酶1.00 mg(40.00 mg/g),37 ℃恒溫水浴120 min,90 ℃水浴15 min滅酶活,定容至5 mL,記為消化液C,冷卻至室溫。分別以未處理液A、消化液B和消化液C為待測(cè)液,進(jìn)行·OH和DPPH·清除率的測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

2 結(jié)果與分析

2.1 近江牡蠣糖總糖和糖胺聚糖含量

依據(jù)1.2.2中總糖(以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品)、糖胺聚糖(以肝素鈉為標(biāo)準(zhǔn)品)的各標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)公式,計(jì)算得出近江牡蠣糖胺聚糖的總糖含量為55.99%,糖胺聚糖含量為49.05%。

2.2 近江牡蠣糖胺聚糖體外抗氧化性研究

近江牡蠣糖胺聚糖DPPH·和·OH的清除率如圖1所示。糖胺聚糖對(duì)DPPH·清除率有非常強(qiáng)的清除作用,其清除能力與質(zhì)量濃度成正比,在樣品濃度為2.00～12.00 mg/mL時(shí)隨著濃度的升高,DPPH·清除率逐漸升高,但當(dāng)樣品濃度高于14.00 mg/mL時(shí),隨濃度的增加,清除率趨于穩(wěn)定,此時(shí)近江牡蠣糖胺聚糖對(duì)DPPH·的清除率為79.15%。隨著樣品濃度增加,·OH清除率逐漸增強(qiáng)。當(dāng)樣品濃度為12 mg/mL時(shí),·OH清除率達(dá)到了100.00%。結(jié)果表明近江牡蠣糖胺聚糖具有較好的體外抗氧化活性。綜合分析近江牡蠣糖胺聚糖對(duì)·OH清除能力和DPPH·清除能力,最終選取近江牡蠣糖胺聚糖濃度為6 mg/mL進(jìn)行近江牡蠣糖胺聚糖抗氧化活性的穩(wěn)定性研究分析。

圖1 近江牡蠣糖胺聚糖對(duì)自由基的清除效果Fig.1 Scavenging effect on free radicals of glycosaminoglycan from Ostrea rivularis

2.2.1 近江牡蠣糖胺聚糖穩(wěn)定性研究分析 根據(jù)抗氧化活性·OH清除能力和DPPH·清除能力兩個(gè)指標(biāo)方法分析探討近江牡蠣糖胺聚糖在不同溫度、pH、紫外線(xiàn)照射時(shí)間、Na+濃度以及體外模擬腸胃道消化條件下的抗氧化能力的穩(wěn)定性。

2.2.2 溫度對(duì)糖胺聚糖穩(wěn)定性的影響 由圖2可知,溫度對(duì)于近江牡蠣糖胺聚糖抗氧化能力有一定的影響(對(duì)照組為常溫),隨著溫度升高,對(duì)·OH清除能力及DPPH·的清除能力均呈現(xiàn)出下降的趨勢(shì)。在溫度為40～80 ℃時(shí),與對(duì)照組相比,DPPH·清除率顯著下降(P<0.05),·OH清除能力有所下降,但其變化無(wú)顯著性差異(P>0.05),但仍保持較高的抗氧化能力,溫度為100 ℃時(shí),·OH及DPPH·清除率顯著下降(P<0.05),分別為23.63%和15.93%。左勇等[24]研究發(fā)現(xiàn)肝素鈉的效價(jià)隨溫度升高而降低。牡蠣糖胺聚糖是一類(lèi)肝素鈉含量較高的多糖物質(zhì),抗氧化活性受溫度影響較大。綜合考慮,近江牡蠣糖胺聚糖在40～80 ℃時(shí)的抗氧化作用效果最好,可以依據(jù)此特點(diǎn)設(shè)定其抗氧化作用條件。

圖2 溫度對(duì)近江牡蠣糖胺聚糖穩(wěn)定性的影響Fig.2 Effect of temperature on the stability of glycosaminoglycan from Ostrea rivularis注:不同大寫(xiě)字母表示·OH清除率有顯著性差異(P<0.05),不同小寫(xiě)字母表示DPPH·清除率 有顯著性差異(P<0.05);圖3～圖6同。

2.2.3 pH對(duì)糖胺聚糖穩(wěn)定性的影響 pH對(duì)近江牡蠣糖胺聚糖抗氧化活性影響如圖3所示。隨著pH的增大,近江牡蠣糖胺聚糖對(duì)·OH和DPPH·清除率顯著降低(P<0.05)(對(duì)照組pH為2.21),在極酸環(huán)境(pH=2.00)下,·OH和DPPH·清除率分別為57.17%和54.00%,pH為4.00時(shí)，·OH和DPPH·清除率分別為33.65%和47.43%,pH為10.00時(shí)，·OH和DPPH·清除率下降為5.64%和4.42%,原因可能是糖胺聚糖也稱(chēng)酸性多糖,是陰離子多糖鏈呈酸性,在酸性條件下結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,堿性條件下結(jié)構(gòu)被破壞。從圖3中可以看出,當(dāng)pH在2～8時(shí),隨著pH的增大,牡蠣糖胺聚糖對(duì)DPPH·和·OH的清除率呈現(xiàn)的下降趨勢(shì)具有顯著性差異(P<0.05),當(dāng)pH在8～10時(shí),其下降趨勢(shì)無(wú)顯著性變化(P>0.05),對(duì)兩種自由基都達(dá)到相對(duì)較低的清除率,其綜合分析可以得出,近江牡蠣糖胺聚糖在堿性條件下抗氧化性質(zhì)不穩(wěn)定,在偏酸環(huán)境下抗氧化作用強(qiáng),且穩(wěn)定,因此在生產(chǎn)或保存近江牡蠣糖胺聚糖時(shí),應(yīng)控制在強(qiáng)酸環(huán)境下,以發(fā)揮其最強(qiáng)的抗氧化效果。

圖3 pH對(duì)近江牡蠣糖胺聚糖穩(wěn)定性的影響Fig.3 Effect of pH on the stability of glycosaminoglycan from Ostrea rivularis

2.2.4 紫外線(xiàn)照射對(duì)糖胺聚糖穩(wěn)定性的影響 紫外線(xiàn)照射對(duì)近江牡蠣糖胺聚糖的抗氧化活性的影響如圖4所示(對(duì)照照射時(shí)長(zhǎng)為0 min)。隨著紫外線(xiàn)照射時(shí)間的增加,近江牡蠣糖胺聚糖對(duì)DPPH·的清除能力緩慢減弱,照射時(shí)間在0～150 min時(shí),對(duì) DPPH·的清除無(wú)顯著性變化(P>0.05),在照射時(shí)間為150 min時(shí),清除率降到最低,為42.90%,此時(shí),糖胺聚糖仍具有較強(qiáng)的抗氧化活性。隨著紫外線(xiàn)照射時(shí)間的增加,糖胺聚糖對(duì)·OH的清除能力呈現(xiàn)出緩慢上升并在照射時(shí)間≥60 min時(shí),對(duì)·OH的清除率無(wú)顯著性變化(P>0.05),趨于穩(wěn)定,清除能力最高達(dá)到76.84%。因此,紫外線(xiàn)照射條件下,糖胺聚糖能保持較好的抗氧化活性。

圖4 紫外線(xiàn)照射時(shí)間對(duì)近江牡蠣糖胺聚糖穩(wěn)定性的影響Fig.4 Effect of ultraviolet irradiation time on the stability of glycosaminoglycan from Ostrea rivularis

2.2.5 氯化鈉對(duì)糖胺聚糖穩(wěn)定性的影響 NaCl對(duì)近江牡蠣糖胺聚糖的抗氧化能力影響如圖5所示(對(duì)照為蒸餾水)。添加濃度分別為1～5 mmol/L的NaCl溶液后,近江牡蠣糖胺聚糖對(duì) DPPH·清除率顯著下降(P>0.05),但仍保持較強(qiáng)抗氧化活性,且添加不同濃度NaCl對(duì)DPPH·清除率影響無(wú)顯著差異。添加NaCl后,·OH清除率與對(duì)照組無(wú)顯著差異(P>0.05)。說(shuō)明了Na+的存在,近江牡蠣糖胺聚糖仍保持較好的抗氧化活性。

圖5 氯化鈉對(duì)近江牡蠣糖胺聚糖穩(wěn)定性的影響Fig.5 Effect of NaCl concentration on stability of glycosaminoglycan from Ostrea rivularis

2.2.6 體外模擬胃腸道消化對(duì)糖胺聚糖穩(wěn)定性的影響 體外模擬胃腸道消化對(duì)糖胺聚糖抗氧化活性的影響如圖6所示。在體外模擬胃腸道消化后,近江牡蠣糖胺聚糖抗氧化活性顯著下降(P<0.05)。DPPH·清除能力在胃腸道消化后,消化液B與未處理液A無(wú)顯著差異,腸道消化液C 的DPPH·清除率顯著下降(P<0.05),但具有一定的清除能力(26.43%)。與未處理液A相比,在胃腸道消化后消化液B和消化液C的·OH清除能力顯著下降(P<0.05),消化液B和消化液C無(wú)顯著差異,仍具有一定的·OH清除能力,分別為12.06%、10.07%。近江牡蠣糖胺聚糖抗消化能力較弱,在加工過(guò)程中可經(jīng)過(guò)穩(wěn)定前處理以更好發(fā)揮其抗氧化活性。

圖6 體外模擬胃腸道消化 對(duì)近江牡蠣糖胺聚糖穩(wěn)定性的影響Fig.6 Effect of gastrointestinal digestion on stability of glycosaminoglycan from Ostrea rivularis in vitro

3 結(jié)論

本研究以近江牡蠣全臟器為原料,通過(guò)酶解法得到近江牡蠣糖胺聚糖,通過(guò)測(cè)定·OH清除率和DPPH·清除率探討其抗氧化能力及其穩(wěn)定性。結(jié)果表明,近江牡蠣糖胺聚糖具有較好的體外抗氧化活性,并且在溫度為40～80 ℃ 時(shí),偏酸環(huán)境,紫外線(xiàn)照射以及含有Na+條件下,其抗氧化作用都能夠都維持在一個(gè)較穩(wěn)定的狀態(tài)(DPPH·清除率>22.92%,·OH清除率>27.34%)。但是近江牡蠣糖胺聚糖抗消化能力較弱,在加工過(guò)程中可經(jīng)過(guò)穩(wěn)定前處理以更好發(fā)揮其抗氧化活性。近江牡蠣糖胺聚糖純度不高或成分較為復(fù)雜等原因在一定程度上影響了其總體抗氧化能力。若能進(jìn)一步通過(guò)超濾、色譜分析等方法進(jìn)行分離純化,可能會(huì)得到抗氧化活性更強(qiáng)的近江牡蠣糖胺聚糖。對(duì)近江牡蠣糖胺聚糖的體外抗氧化活性及穩(wěn)定性的研究,為進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)和利用近江牡蠣提供了相關(guān)的理論基礎(chǔ)和參考依據(jù)。