抑制食管癌STC-1基因表達(dá)對(duì)食管癌細(xì)胞凋亡、IL-1β和TNF-α表達(dá)及JAK2/STAT3信號(hào)的影響研究

卜秀梅 王文剛 李 輝 鄭 瑾

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，沈陽(yáng) 110032)

食管癌是常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，目前以手術(shù)治療為主，雖然治療技術(shù)日漸成熟，但患者5年的生存率仍然很低[1]。食管癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)涉及細(xì)胞調(diào)控機(jī)制異常和多基因改變的長(zhǎng)時(shí)間、多階段、多因素的復(fù)雜過(guò)程，目前已發(fā)現(xiàn)食管癌相關(guān)的癌基因c-myc、cyclinD1等及抑癌基因Rb、p53等的表達(dá)改變，其表達(dá)改變可影響其生物學(xué)性狀[2,3]。因此，探究影響食管癌表觀(guān)遺傳學(xué)改變及發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，對(duì)于有效預(yù)防及治療食管癌具有重要意義。斯鈣素(Stanniocalcin，STC)是一種在硬骨魚(yú)中首先被發(fā)現(xiàn)的糖蛋白激素，哺乳動(dòng)物中有STC1和STC2兩種類(lèi)型，人類(lèi)STC1在甲狀腺、腎臟、結(jié)腸等多種組織中有表達(dá)，參與細(xì)胞凋亡、血管生成、氧化應(yīng)激、線(xiàn)粒體代謝等多種生理及病理過(guò)程的調(diào)節(jié)[4]。目前有多項(xiàng)研究顯示，STC1在甲狀腺癌、乳腺癌、胃癌等多種腫瘤中表達(dá)上調(diào)，與腫瘤的惡性程度有關(guān),STC1的過(guò)表達(dá)預(yù)示著腫瘤預(yù)后差[5-7]。STC1對(duì)食管癌發(fā)生發(fā)展的影響目前研究較少。有研究發(fā)現(xiàn)，食管鱗癌中STC1的表達(dá)升高，與臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，且高、中表達(dá)的無(wú)進(jìn)展生存期低于低、未表達(dá)者[8]。這提示STC1可能促進(jìn)了食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展。STC1對(duì)食管鱗癌生物學(xué)特性影響還未清楚。因此，本研究首先檢測(cè)了STC-1在4種食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系中的表達(dá)，選擇表達(dá)最高的細(xì)胞系；通過(guò)STC-1的siRNA轉(zhuǎn)染該細(xì)胞系，檢測(cè)STC-1表達(dá)下調(diào)/沉默對(duì)癌細(xì)胞活力、凋亡率及炎癥因子IL-1β和TNF-α的表達(dá)，并進(jìn)一步研究引起細(xì)胞增殖凋亡的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞系 正常人食管鱗狀上皮細(xì)胞Het-1A及人食管鱗狀細(xì)胞癌KYSE170、Eca109、TE1和TE10細(xì)胞系均購(gòu)自遼寧中醫(yī)藥大學(xué)。

1.1.2試劑和儀器 RPMI1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清和青鏈霉素均購(gòu)自美國(guó)Bibco；CCK8試劑購(gòu)自上海同仁研究所；LipofectamineTM2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；膜聯(lián)蛋白V-FITC(Annexin V-FITC)/碘化丙錠(PI)細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自南京凱基生物科技公司；總RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司；二喹啉甲酸(Bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；兔抗人STC-1抗體、鼠抗人Ki67抗體、兔抗人p53抗體、兔抗人磷酸化的蛋白酪氨酸激酶2(Phosphorylated Janus kinase2，p-JAK2)抗體、兔抗人磷酸化的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄因子3(Phosphorylated signal transducers and activators of transcription 3，p-STAT3)抗體購(gòu)自美國(guó)Cell signal公司；酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Thermo Labsystem公司；流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) Het-1A、KYSE170、Eca109、TE1和TE10細(xì)胞培養(yǎng)于37℃含5%體積分?jǐn)?shù)的CO2培養(yǎng)箱中，用含胎牛血清及青霉素和鏈霉素雙抗的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，細(xì)胞每2～3 d更換一次培養(yǎng)液，細(xì)胞達(dá)80%～90%生長(zhǎng)融合時(shí)，胰蛋白酶消化后制成單細(xì)胞懸液，接種于6孔板、96孔板或培養(yǎng)瓶中用于實(shí)驗(yàn)研究及傳代。

1.2.2食管癌細(xì)胞STC-1的mRNA表達(dá) 按照總RNA提取試劑盒提取各細(xì)胞中的總RNA，RNA純度測(cè)定后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。其中STC-1和內(nèi)參GAPDH引物通過(guò)Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)，經(jīng)過(guò)BLAST驗(yàn)證后由上海英駿生物技術(shù)公司合成。引物序列如下：STC-1 F：5′-CCAAGGTCTTCCTCGCCATTC-3′，R：5′-ATTCCA-GCAGGCTTCGGACA-3′,195 bp。內(nèi)參GAPDH的引物為F：5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTT-3′，R：5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′，258 bp。PCR擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)，72℃ 5 min，最后4℃保存。根據(jù)Ct均值利用2-ΔΔCt比較法計(jì)算STC-1的mRNA相對(duì)含量。

1.2.3食管癌細(xì)胞STC-1、Ki67、p53、p-JAK2、p-STAT3的蛋白表達(dá) 提取各細(xì)胞中的總蛋白，BCA法對(duì)蛋白定量，每泳道取等量蛋白行SDS-PAGE分離，蛋白分離后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，電轉(zhuǎn)好的PVDF膜置于封閉液中2 h，洗封閉好的PVDF膜3次，每次5 min，放置膜于抗體孵育盒中，滴加一抗(STC-1、Ki67、p53、p-JAK2、p-STAT3抗體皆按照1∶500稀釋?zhuān)瑑?nèi)參GAPDH為1∶1 000稀釋)將膜覆蓋完全，4℃過(guò)夜，次日取出膜，洗膜后常溫孵育二抗(1∶2 000 稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗兔)2 h，洗膜，顯色液顯色，置于暗室中顯影曝光條帶。以Bandscan5.0軟件對(duì)成像圖進(jìn)行灰度值分析，以目的條帶與GAPDH內(nèi)參條帶的比值代表蛋白的表達(dá)水平。

1.2.4siRNA轉(zhuǎn)染 以L(fǎng)ipofectamineTM2000為載體，參照LipofectamineTM2000說(shuō)明書(shū)，于轉(zhuǎn)染前24 h接種Eca109細(xì)胞至6孔板，觀(guān)察到細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)60%融合時(shí)轉(zhuǎn)染，分別給Eca109細(xì)胞轉(zhuǎn)染STC-1-siRNA和陰性對(duì)照siRNA序列，分別標(biāo)記兩組為STC-1-siRNA組和NC組，并設(shè)定空白對(duì)照組(Control)，收集轉(zhuǎn)染48 h的細(xì)胞，通過(guò)RT-PCR及Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞STC-1的表達(dá)。其中STC-1的siRNA序列為：sense：5′-TCTTGTACAGCGCTGCTAA-3′，antisense：5′-TTAGCAGCGCTGTACAAGA-3′。

1.2.5轉(zhuǎn)染STC-1的siRNA后Eca109細(xì)胞活力檢測(cè) 細(xì)胞活力檢測(cè)通過(guò)CCK8法。在轉(zhuǎn)染48 h后的每孔細(xì)胞中加入CCK8試劑10 μl，孵箱中2 h，利用空白對(duì)照孔調(diào)零，酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm各組的吸光度值(A值)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6轉(zhuǎn)染STC-1的siRNA后Eca109細(xì)胞凋亡檢測(cè) 轉(zhuǎn)染48 h的細(xì)胞PBS洗一次，胰酶消化細(xì)胞，含有血清的培養(yǎng)基終止細(xì)胞消化，離心，棄掉上清，預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞，離心，棄掉上清，重懸細(xì)胞后將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×106ml-1，細(xì)胞中加入FITC標(biāo)記的Annexin V和PI各5 μl，混合均勻后置于室溫環(huán)境中避光孵育20 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.7轉(zhuǎn)染STC-1的siRNA對(duì)Eca109細(xì)胞IL-1β和TNF-α表達(dá)的影響 通過(guò)RT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞中IL-1β和TNF-α的mRNA表達(dá)，方法參照1.2.2。IL-1β和TNF-α的引物分別為：IL-1β：F：5′-CTCCATGAGCTTTGTACAAGG-3′,R：5′-TGCTGATGTACCAGTTGGGG-3′,245 bp。TNF-α：F：5′-GAACTCCAGGCGGTGTCT-3′,R：GGCTCATACCAGGGCTTG-3′,510 bp。

2 結(jié)果

2.1食管癌細(xì)胞STC-1的表達(dá) 以正常人食管鱗狀上皮細(xì)胞Het-1A為對(duì)照，通過(guò)RT-PCR及Western blot檢測(cè)人食管鱗狀細(xì)胞癌KYSE170、Eca109、TE1和TE10細(xì)胞中STC-1的表達(dá)，結(jié)果如圖1和表1所示，與Het-1A細(xì)胞比較，STC-1在KYSE170、Eca109、TE1和TE10細(xì)胞中的mRNA及蛋白表達(dá)均顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2STC-1-siRNA轉(zhuǎn)染Eca109細(xì)胞效果 通過(guò)RT-PCR及Western blot分別檢測(cè)STC-1-siRNA轉(zhuǎn)染Eca109細(xì)胞48 h后STC-1的表達(dá)，結(jié)果如圖2和表2所示，NC組STC-1的mRNA及蛋白表達(dá)均與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，STC-1-siRNA組STC-1的mRNA及蛋白表達(dá)均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。

2.3STC-1-siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)Eca109細(xì)胞活力及凋亡的影響 CCK8法及流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)STC-1-siRNA轉(zhuǎn)染Eca109細(xì)胞48 h的活力及凋亡率，結(jié)果如圖3和表3所示，與對(duì)照組比較，STC-1-siRNA組細(xì)胞活力顯著降低(P<0.05)，凋亡率顯著升高(P<0.05)。

圖1 Western blot檢測(cè)STC-1在食管癌細(xì)胞的蛋白表達(dá)Fig.1 Western blot to detect protein expression of STC-1 in esophageal cancer cells

表1 STC-1在食管癌細(xì)胞的mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量

Note：Compared with Het-1A cells,1)P<0.05.

圖2 Western blot檢測(cè)STC-1-siRNA轉(zhuǎn)染Eca109細(xì)胞后STC-1的蛋白表達(dá)Fig.2 Protein expression in STC-1 after STC-1-siRNA was transfected into Eca109 cells detected by Western blot

表2 各組細(xì)胞中STC-1的mRNA及蛋白表達(dá)

Note：Compared with the Control group,1)P<0.05.

2.4STC-1-siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)Eca109細(xì)胞IL-1β和TNF-α表達(dá)的影響 RT-PCR檢測(cè)STC-1-siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)Eca109細(xì)胞炎癥因子IL-1β和TNF-α表達(dá)的影響，結(jié)果如表4所示，與對(duì)照組比較，STC-1-siRNA組IL-1β和TNF-α的表達(dá)均顯著降低(P<0.05)。

2.5STC-1-siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)Eca109細(xì)胞增殖凋亡蛋白及JAK2/STAT3信號(hào)通路的影響Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞中增殖蛋白Ki67、凋亡蛋白p53及JAK2/STAT3信號(hào)通路p-JAK2和p-STAT3的蛋白表達(dá)，結(jié)果如圖4和表5所示，與對(duì)照組比較，STC-1-siRNA組Ki67、p-JAK2和p-STAT3的蛋白表達(dá)均顯著降低(P<0.05)，p53的蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)。

圖3 STC-1-siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)Eca109細(xì)胞凋亡的影響Fig.3 Effect of STC-1-siRNA transfection on apoptosis of Eca109 cells

表3 STC-1-siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)Eca109細(xì)胞活力及凋亡的影響

Note：Compared with the Control group,1)P<0.05.

表4 STC-1-siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)Eca109細(xì)胞IL-1β和TNF-α表達(dá)的影響

Note：Compared with the Control group,1)P<0.05.

圖4 Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞中增殖凋亡蛋白及JAK2/STAT3信號(hào)通路蛋白表達(dá)Fig.4 Western blot were used to detect protein expression of proliferation and apoptotic protein and JAK2/STAT3 signaling protein expression in each cell

表5 各組細(xì)胞中Ki67、P53、p-JAK2和p-STAT3的蛋白相對(duì)表達(dá)量

Note：Compared with the Control group,1)P<0.05.

3 討論

人類(lèi)STC-1定位于8p11.2-p21染色體，STC-1在多種人類(lèi)組織中有表達(dá)，以自分泌和旁分泌方式參與多種生理和病理過(guò)程的調(diào)節(jié)，近些年發(fā)現(xiàn)其與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[9]。研究發(fā)現(xiàn)，STC-1在結(jié)腸癌中的上調(diào)表達(dá)在腫瘤血管發(fā)生中有重要作用[10]；卵巢癌中STC-1的過(guò)度表達(dá)可增加卡鉑的化療抵抗，而沉默其表達(dá)可提高卡鉑的敏感性[11]；宮頸癌中STC-1的過(guò)表達(dá)可抑制癌細(xì)胞的增殖、遷移[12]；肺癌細(xì)胞中低表達(dá)STC-1可降低細(xì)胞增殖，阻滯細(xì)胞周期，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[13]。這些前人的研究提示STC-1參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展。STC-1在食管鱗癌中的研究還未清楚，有研究發(fā)現(xiàn)STC-1在食管鱗癌中高表達(dá)，可能是食管癌治療的一個(gè)有效潛在的標(biāo)記[8]，但STC-1對(duì)食管鱗癌的增殖凋亡的影響及機(jī)制還未清楚。

本研究以正常人食管鱗狀上皮細(xì)胞Het-1A為對(duì)照，檢測(cè)人食管鱗狀細(xì)胞癌KYSE170、Eca109、TE1和TE10細(xì)胞中STC-1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)4種細(xì)胞中STC-1的表達(dá)均顯著升高，這與前人的研究結(jié)果是一致的，由于在Eca109細(xì)胞中表達(dá)最高，因此選擇作為研究對(duì)象。RNA干擾具有高效性和很強(qiáng)的特異性，能在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平及染色質(zhì)水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)，目前在基因功能研究、腫瘤治療等方面有廣泛應(yīng)用[14,15]。因此，本研究通過(guò)RNA干擾技術(shù)沉默Eca109細(xì)胞STC-1的表達(dá)，通過(guò)CCK8法及流式細(xì)胞儀分別檢測(cè)細(xì)胞活力及凋亡，結(jié)果顯示，沉默STC-1表達(dá)后Eca109細(xì)胞活力顯著降低，凋亡率升高。

JAK/STAT信號(hào)通路是一條參與細(xì)胞增殖、凋亡、分化調(diào)節(jié)等生理過(guò)程的信號(hào)途徑，多種腫瘤中該通路處于激活狀態(tài)，可通過(guò)調(diào)控下游相關(guān)基因Ki67、p53等表達(dá)影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展[16,17]，有研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)JAK2抑制劑抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路后可降低食管鱗癌細(xì)胞的增殖及誘導(dǎo)凋亡[18,19]。Ki67是一個(gè)可標(biāo)記細(xì)胞增殖狀態(tài)的抗原，與惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系，其表達(dá)的高低可全面、可靠的反映細(xì)胞增殖狀態(tài)，因此被認(rèn)為是細(xì)胞增殖活力檢測(cè)的理想指標(biāo)，在腫瘤生物學(xué)特性研究中有廣泛的應(yīng)用[20,21]。食管癌中Ki67可較好地反映癌細(xì)胞的增殖活性[22]。p53是一個(gè)發(fā)現(xiàn)較早的抑癌基因，其表達(dá)水平降低與包括食管癌在內(nèi)的多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[23,24]。食管癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)p53可引起癌細(xì)胞的凋亡[25]。本研究結(jié)果顯示，沉默Eca109細(xì)胞STC-1的表達(dá)后Ki67、p-JAK2和p-STAT3的表達(dá)均顯著降低，p53的表達(dá)升高。這提示STC-1可通過(guò)下調(diào)JAK2/STAT3信號(hào)通路影響食管鱗癌的增殖和凋亡。腫瘤的微環(huán)境是一個(gè)復(fù)雜的小生態(tài)環(huán)境，從細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)變到腫瘤的血管生成、侵襲轉(zhuǎn)移、免疫逃逸等一系列過(guò)程均能影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。炎性細(xì)胞因子IL-1β和TNF-α作為腫瘤微環(huán)境的構(gòu)成成分既可以由腫瘤細(xì)胞自身分子，也可由免疫細(xì)胞分泌至腫瘤微環(huán)境中，從而作用于腫瘤細(xì)胞[26]。有研究發(fā)現(xiàn)，降低腫瘤IL-1β和TNF-α的表達(dá)可通過(guò)破壞腫瘤微環(huán)境影響腫瘤發(fā)生發(fā)展[27]。本研究結(jié)果顯示，沉默Eca109細(xì)胞STC-1的表達(dá)后IL-1β和TNF-α的表達(dá)明顯降低。這提示Eca109對(duì)食管癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用可能與下調(diào)IL-1β和TNF-α的表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，STC-1在食管鱗癌細(xì)胞中高表達(dá)，抑制其表達(dá)后癌細(xì)胞活力顯著降低，凋亡率升高，此作用可能與抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路及炎癥因子如IL-1β和TNF-α的表達(dá)有關(guān)。STC-1對(duì)食管鱗癌其他生物學(xué)特性及機(jī)制有待進(jìn)一步研究。但本研究為STC-1在食管鱗癌中的作用研究奠定了一定的基礎(chǔ)。