SEC23B基因突變診斷先天性紅細胞生成異常性貧血Ⅱ型1例并文獻復(fù)習(xí)*

孫慧敏，姜中興，王衛(wèi)敏

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液科，鄭州 450000)

先天性紅細胞生成障礙性貧血(congenital dyserythropoietic anemia，CDA)是臨床上少見的遺傳性紅細胞疾病，其特征在于無效的紅細胞生成，成紅細胞形態(tài)學(xué)異常，溶血、紅血細胞膜蛋白和脂質(zhì)的低糖基化。這種疾病有4種類型(Ⅰ～Ⅳ)，都與紅細胞前體異常成熟和分裂有關(guān)[1]。高通量二代測序技術(shù)具有靈敏度、特異度高及重復(fù)性好等優(yōu)點，能夠同時篩查多種基因突變，適用于遺傳異質(zhì)性疾病的突變篩查[2]。本院應(yīng)用上述技術(shù)首次確診了1例CDAⅡ患者，現(xiàn)將病例相關(guān)資料報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 患者，女，23歲，漢族，河南籍，因“發(fā)現(xiàn)脾大、膽紅素高10月余”于2018-02-10入本院。初步考慮：溶血性貧血？既往史無特殊。未婚未育。父母均存在輕度貧血病史。查體：面色蒼黃，全身皮膚黏膜無皮疹、皮下出血、皮下結(jié)節(jié)、瘢痕，全身淺表淋巴結(jié)未觸及，心肺聽診未見明顯異常。腹軟，無壓痛、反跳痛、肌緊張，肝臟肋緣下未觸及，脾臟肋緣下1.00 cm。血常規(guī)：白細胞計數(shù)4.40×109/L,紅細胞計數(shù)2.73×1012/L,血紅蛋白89.00 g/L,血小板計數(shù)101.00×109/L,平均紅細胞體積96.20 fL，平均紅細胞血紅蛋白量33.30 pg，平均紅細胞血紅蛋白濃度346.00 g/L，網(wǎng)織紅細胞百分數(shù)6.38%，網(wǎng)織紅細胞絕對值174.10×109/L；總膽紅素44.39 μmol/L，間接膽紅素31.40 μmol/L；鐵蛋白125.50 ng/mL；珠蛋白生成障礙性貧血(地貧)全套基因、遺傳球基因、紅細胞滲透脆性實驗、血紅蛋白電泳、微小病毒B19抗體、Coombs、高鐵血紅蛋白還原實驗、CD55/CD59、冷凝集素測定均未見明顯異常。彩超及CT提示：脾大、膽囊多發(fā)結(jié)石。骨髓電鏡、十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)等因?qū)嶒炇壹夹g(shù)有限未行檢測。

1.2方法

1.2.1基因組DNA提取 在征得患者及家屬的知情同意后，采集患者及家屬的乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝外周血3～5 mL，用試劑盒提取外周血DNA，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2目標(biāo)序列捕獲與高通量測序 將提取的DNA用超聲波打斷并制備DNA文庫，通過捕獲芯片對血液系統(tǒng)疾病相關(guān)基因全外顯子及其鄰近的內(nèi)含子區(qū)域的DNA進行富集，用通用引物對捕獲的序列進行PCR擴增，最后應(yīng)用Ion Torrent PGM平臺對擴增產(chǎn)物進行高通量測序，以檢測包括遺傳球的致病基因ANKI、SPTB、SLC4A1、EPB42、SPTA1，CDA的致病基因CDAN1、C150RF41、SEC23B、KIF23、KLF1、GATA1在內(nèi)的血液系統(tǒng)疾病相關(guān)基因。

1.2.3Sanger測序 在確定申請人的致病基因型后，對申請人及其父母的外周血DNA 進行Sanger測序。最終將檢測結(jié)果與人類基因突變數(shù)據(jù)庫(Human Genetic Mutation Database ，HGMD)進行比對。

2 結(jié) 果

2.1目標(biāo)序列捕獲及高通量測序分析 應(yīng)用目標(biāo)序列捕獲與高通量測序分析，檢測了申請人血液系統(tǒng)疾病相關(guān)的基因，檢測出CDAⅡ型致病基因SEC23B存在復(fù)合雜合變異，患者存在SEC23B基因 c.74C>A(p.Pro25His)和c.1588C>T(p.Arg530Trp)復(fù)合雜合變異。血涂片檢查：成熟紅細胞大小不等，色素充盈尚可，少見球形紅細胞，球形紅細胞計數(shù)6%。骨髓細胞學(xué)：增生極度活躍骨髓象，其中以紅系增生明顯活躍,中晚幼紅細胞比值增高，中晚幼紅細胞易見炭核，晚幼紅細胞易見雙核，可見啞鈴核、花核，偶見點彩，占有核紅細胞的12%。成熟紅細胞大小不等，可見大紅細胞、嗜多紅細胞，血紅蛋白充盈可。

2.2Sanger測序分析 應(yīng)用Sanger測序?qū)ι暾埲薙EC23B基因的突變進行驗證，結(jié)果與二代測序完全一致，并在申請人母親中檢測出SEC23B基因c.74C>A(p.Pro25His)雜合變異，申請人父親中檢測出SEC23B基因 c.1588C>T(p.Arg530Trp)雜合變異。

2.3隨訪 該患者目前未出現(xiàn)嚴(yán)重的鐵過載等并發(fā)癥，現(xiàn)仍在觀察隨訪中。

3 討 論

隨著分子生物學(xué)在血液腫瘤發(fā)病機制和臨床診療研究中的不斷深入，二代測序作為新的分子生物檢測手段被廣泛地應(yīng)用于臨床，為血液病的診療提供了有效地幫助。

自2009年發(fā)現(xiàn)編碼細胞衣殼蛋白復(fù)合物Ⅱ(COPⅡ)成分的SEC23B基因為CDAⅡ的致病基因以來[3]，人類基因突變數(shù)據(jù)庫已經(jīng)發(fā)表了120個SEC23B基因變體：錯義/無義，剪接，調(diào)節(jié)，缺失，插入[4]。本研究申請人骨髓及網(wǎng)織紅細胞提示增生性貧血，且存在遺傳可疑性，運用二代測序發(fā)現(xiàn)申請人存在SEC23B基因c.74C>A(p.Pro25His)和c.1588C>T(p.Arg530Trp)復(fù)合雜合變異，目前國內(nèi)尚無此基因型報道，而國外有研究者在早些年已證實c.74C>A(p.Pro25His)、c.1588C>T(p.Arg530Trp)突變與CDAⅡ相關(guān)[3,5]。另外本研究并未發(fā)現(xiàn)家庭成員中存在原發(fā)性鐵超負荷的致病性HFE2基因突變。鑒于申請人輕度貧血，無嚴(yán)重的鐵過載，膽囊結(jié)石未活動，暫時給予觀察。截至目前，國內(nèi)僅有4篇關(guān)于SEC23B基因突變的病例報道，其中李思路等[6]應(yīng)用高通量二代測序檢測出2月齡患兒20號染色體SEC23B基因存在2處雜合改變，c.G53A：P.R18H，G>GA雜合性改變(2號外顯子)和C.C1831T：P.R611W，C>CT雜合性改變(16號外顯子)，且證實2號外顯子突變來源于母親遺傳，而16號外顯子突變源自后天獲得；李棟梁等[2]運用高通量二代測序技術(shù)得出復(fù)合雜合錯義突變c.1727T>C(p.F576S)和c.1831C>T(p.R611W)可能是該CDAⅡ家系的分子發(fā)病機制；RU等[7]發(fā)現(xiàn)CDAⅡ家系中存在c.938G>A純合突變；WANG等[8]在1例CDAⅡ患者中檢測到SEC23B基因存在一個無義突變c.71G>A及1個錯義突變c.74C>A。可見，大多數(shù)CDAⅡ患者為錯義/無義的純合子或復(fù)合雜合子突變，且發(fā)病年齡不一，正確的診斷通常延遲到青春期或成年期。

CDAⅡ呈常染色體隱性遺傳，是CDA中最常見的類型。CDAⅡ患者大多呈正細胞正色素性輕度貧血，黃疸，脾大，膽囊結(jié)石和由于鐵超負荷導(dǎo)致的皮膚病，且通常隨著年齡的增長貧血逐漸減輕，大多數(shù)成人患者血紅蛋白維持在90～100 g/L[7]。有研究發(fā)現(xiàn)，其血涂片檢查可見異形紅細胞，偶爾可見球形紅細胞明顯增多；光鏡下CDAⅡ雙核及多核幼紅細胞占有核紅細胞的比例常大于10%；平行于有核紅細胞膜表面的雙層膜狀結(jié)構(gòu)為其電鏡的特征性表現(xiàn)；紅細胞膜蛋白的SDS-PAGE顯示帶3較窄且遷移率較快，帶4、5也可出現(xiàn)類似變化[9]。值得注意的是，繼發(fā)血色病是CDAⅡ患者最重要的遠期并發(fā)癥，嚴(yán)重者預(yù)后不良。因此準(zhǔn)確診斷CDAⅡ?qū)τ谠缙诎l(fā)現(xiàn)和治療鐵超負荷，提供適當(dāng)?shù)倪z傳咨詢，實現(xiàn)有效的治療并避免無效的治療很重要。

而與CDAⅡ相比較，CDAⅠ患者貧血癥狀重，發(fā)病年齡早[10]；骨髓形態(tài)中存在有核紅細胞核間橋及大量(高達60%)異染色質(zhì)的海綿狀結(jié)構(gòu)；CDAⅠ型患者多伴有先天性異常，包括身材矮小，椎體變平，皮膚色素沉著和肢體末端異常斑塊等[11]；CDAN1為CDAⅠ型的主要致病基因，通過編碼codanin-1蛋白，影響著紅系成熟；AHMED等[12]指出約20%CDAⅠ型患者未發(fā)現(xiàn)任何基因異常；而BABBS等[13]運用全基因組測序發(fā)現(xiàn)CDAⅠ患者的1個新的基因突變：C150RF41基因的c．533T>A純合突變(導(dǎo)致p.L17Q錯義突變)及c．281A>G純合突變(導(dǎo)致p.Y94C突變)。因此，除CDAN1、C150RF41外，CDAⅠ的致病基因譜仍有待探索。CDAⅢ型患者貧血多不明顯；巨大的多個細胞核為其紅系特征性的骨髓形態(tài)表現(xiàn)，有核紅細胞常顯示出細胞核破裂，細胞核膜的異常和大的自體吞噬泡等結(jié)構(gòu)變化；部分患者可出現(xiàn)視網(wǎng)膜血管紋樣改變、單克隆丙種球蛋白病及骨髓瘤；KIF23為CDAⅢ型的靶基因，通過編碼有絲分裂驅(qū)動蛋白樣蛋白(MKLP)1，參與紡錘體的形成，維持中間體的穩(wěn)定[14]。CDAⅣ型患者呈酸化血清溶血試驗陰性的遺傳性成紅細胞多核病;部分患者存在血象異常，主要表現(xiàn)為粒細胞及血小板的減少。此外，IOLASCON等[15]研究報道了與CDA表型相關(guān)的新的致病基因KLF1和GATA1。

綜上所述，CDA因臨床表現(xiàn)異質(zhì)性大，臨床醫(yī)師對疾病的認知能力不同，而導(dǎo)致臨床診療相對困難，本文意在強調(diào)對于一些復(fù)雜、罕見的遺傳性疾病，及早地進行基因檢測，可減少漏診、誤診，早期實現(xiàn)有效的治療。