HBV小鼠動(dòng)物模型的研發(fā)進(jìn)展

鄭曉文，王 敏，馮成千，高 鳴，聶 源，鄧西子，胡鳳玉，李 鋒

在已知的人類肝臟病毒中，HBV是獨(dú)特的具有反轉(zhuǎn)錄過程的雙鏈DNA病毒，其基因組全長(zhǎng)3.2 kb，至少編碼7個(gè)蛋白，包括HBcAg、HBeAg、HBsAg、聚合酶和X蛋白等。肝細(xì)胞內(nèi)共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（covalently closed circular DNA, cccDNA）是HBV復(fù)制模板，需要特別強(qiáng)調(diào)的是，HBV生命周期中cccDNA并不直接產(chǎn)生子代病毒DNA，而是產(chǎn)生一個(gè)大于基因組全長(zhǎng)的前基因組RNA（pregenomic-RNA, pgRNA）復(fù)制中間體。pgRNA首先包裹到由核心蛋白形成的核衣殼中，然后經(jīng)過聚合酶的反轉(zhuǎn)錄過程產(chǎn)生子代病毒基因組（該過程與HIV反轉(zhuǎn)錄復(fù)制過程相似），cccDNA 所攜帶的遺傳信息通過這種特殊方式傳遞給子代病毒。隨后，HBV核衣殼蛋白與細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的表面抗原蛋白組裝成為成熟病毒顆粒（42 nm顆粒）并釋放出細(xì)胞，同時(shí)大量表面抗原以無核酸形式的亞病毒顆粒（17～22 nm顆粒）釋放[1]。

HBV感染具有極強(qiáng)的種屬特異性，自然界中，僅有黑猩猩和食蟹猴是支持HBV感染的非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物。但黑猩猩感染HBV后主要表現(xiàn)為急性病毒肝炎，不能建立慢性感染[2]；而食蟹猴盡管可發(fā)展成慢性感染[3]，但是由于動(dòng)物倫理的限制和成本的考慮，美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院越來越限制非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物在生物醫(yī)學(xué)上的研究應(yīng)用，故同樣不適合建立HBV感染模型。此外，樹鼩是另一種支持HBV感染的小型動(dòng)物，其可感染HBV建立慢性感染，出現(xiàn)肝臟疾病[4]。利用樹鼩肝細(xì)胞時(shí)還發(fā)現(xiàn)了HBV的受體為Na+?；悄懰猁}協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)多肽。但同樣的，樹鼩和非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物一樣具有妊娠周期長(zhǎng)、飼養(yǎng)成本高、動(dòng)物資源缺乏等特點(diǎn)[5]，在應(yīng)用上受到極大限制。小鼠因其易獲得、易飼養(yǎng)管理及經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn)而廣泛應(yīng)用于各個(gè)實(shí)驗(yàn)室，研究者在構(gòu)建HBV小鼠模型方面做了不斷創(chuàng)新與優(yōu)化，本文就HBV感染小鼠模型的相關(guān)研究作一綜述。

1 HBV轉(zhuǎn)基因小鼠模型

1995年，Guidotti等[6]構(gòu)建了1.3倍HBV基因組長(zhǎng)度的（HBV1.3×）轉(zhuǎn)基因小鼠模型。該模型中，0.3倍HBV基因組重復(fù)片段含有pgRNA啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子序列，可以幫助轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生完整的3.5 kb全長(zhǎng)pgRNA和全部HBV產(chǎn)物RNA，保證HBV在小鼠的肝臟中完成產(chǎn)生、包裝與釋放的全生命過程。該小鼠的血清中可以檢測(cè)到高水平HBV和病毒標(biāo)志物。該模型的主要缺陷是，HBV蛋白是組成型表達(dá)，小鼠的免疫系統(tǒng)在發(fā)育階段就通過陽性選擇和陰性選擇刪除了識(shí)別HBV的免疫功能，形成小鼠無法打破的天然免疫耐受，因此小鼠中無HBV引起的肝炎以及相關(guān)的肝臟疾病。

為了克服免疫耐受，1999年，Larkin等[7]首先構(gòu)建了含有HBV1.3×轉(zhuǎn)基因的免疫缺陷小鼠。小鼠成年后，通過將具有正常免疫功能的同源小鼠脾臟移植到該HBV轉(zhuǎn)基因小鼠中，使小鼠建立免疫系統(tǒng)，具備識(shí)別HBV的免疫功能。此模型中可以觀察到肝損傷，可用來研究HBV引起的病理變化和宿主因素的關(guān)系。Wang等[8]在此模型基礎(chǔ)上通過持續(xù)的CD137刺激，誘導(dǎo)了小鼠的肝炎，以及相關(guān)的肝臟疾病，包括肝纖維化、肝硬化和肝細(xì)胞癌。有研究利用該模型，通過基因表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)，重建后的HBV特異性CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（cytotoxic T lymphocytes, CTLs）的數(shù)量與血清中ALT活性顯著升高呈正相關(guān)[9-10]，說明了針對(duì)HBV長(zhǎng)期的特異性免疫反應(yīng)導(dǎo)致小鼠肝細(xì)胞損傷和高水平再生增殖。隨后利用該模型還證明了蛋白酶體抑制了轉(zhuǎn)基因小鼠中HBV的復(fù)制[11]，泛素可以調(diào)節(jié)HBV的復(fù)制周期[12]，先鋒轉(zhuǎn)錄因子FoxA通過改變HBV DNA甲基化狀態(tài)來調(diào)控基因表達(dá)[10]。

總的來說，HBV轉(zhuǎn)基因小鼠在HBV相關(guān)研究中顯示了其強(qiáng)大的應(yīng)用價(jià)值[6]。但因轉(zhuǎn)基因小鼠HBV基因組已經(jīng)整合在細(xì)胞基因組中，與自然感染HBV存在差異[6-7，13]，這一缺陷限制了該小鼠模型在HBV治愈領(lǐng)域的應(yīng)用。

2 水動(dòng)力高壓注射介導(dǎo)的HBV轉(zhuǎn)染小鼠模型

1999年，Zhang等[14]報(bào)道一種通過小鼠尾靜脈注射裸質(zhì)粒DNA來提高外源基因在肝細(xì)胞中高水平表達(dá)的體內(nèi)轉(zhuǎn)染技術(shù)，其原理是通過從小鼠尾靜脈快速注射大量液體，導(dǎo)致肝血管內(nèi)壓力升高，瞬時(shí)高壓將質(zhì)粒DNA擠進(jìn)肝細(xì)胞。有研究者通過熒光素酶和半乳糖苷酶作為報(bào)告基因，證明該種方式可以獲得外源基因在肝臟中的高表達(dá)[15-16]。通過水動(dòng)力高壓注射含有1.3倍HBV基因組的質(zhì)粒，獲得了非整合形式的HBV小鼠模型，在血清中可以檢測(cè)到HBV顆粒和亞病毒顆粒，該模型為病毒學(xué)研究提供了極大便利[17]。但是，由于所注射的質(zhì)粒DNA中含有非HBV基因組的質(zhì)粒骨架，這些質(zhì)粒骨架序列通常會(huì)引起較強(qiáng)的免疫反應(yīng)，造成HBV質(zhì)粒的快速清除，因此該模型的持續(xù)感染時(shí)間較短，只有幾周[17]。

為了克服上述模型不穩(wěn)定的缺點(diǎn)，2006年Huang等[18]構(gòu)建了含有腺相關(guān)病毒（adenovirus associated virus, AAV）序列的質(zhì)粒pAAV/HBV1.2，并將該質(zhì)粒通過尾靜脈水動(dòng)力高壓注射入C57BL/6小鼠體內(nèi)。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，40%該類小鼠體內(nèi)的HBsAg可持續(xù)6個(gè)月以上，且在血液和肝組織內(nèi)均檢測(cè)到高水平的HBV產(chǎn)物，證明該方法建立的HBV小鼠模型更加持久。研究者認(rèn)為AAV的非轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列提高了HBV在小鼠肝細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定表達(dá)[18]。在水動(dòng)力注射小鼠模型中，HBV能發(fā)揮正常的免疫功能，這擴(kuò)展了其在新型免疫治療領(lǐng)域和HBV在機(jī)體中發(fā)病機(jī)制免疫領(lǐng)域中的應(yīng)用。

水動(dòng)力高壓注射介導(dǎo)的HBV轉(zhuǎn)染小鼠模型具有以下缺陷：第一，對(duì)操作人員的技術(shù)穩(wěn)定性要求較高，成模率相對(duì)低；第二，受水動(dòng)力高壓原理的限制，肝細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率較低（5%～10%）；第三，質(zhì)粒骨架仍在，不能完全代表HBV真實(shí)感染狀態(tài)。

3 AAV載體介導(dǎo)的HBV小鼠模型

人AAV是直徑20 nm無包膜的復(fù)制依賴型單鏈微小DNA病毒[19]，其基因組長(zhǎng)約4.7 kb，只編碼Cap和Rep蛋白，病毒復(fù)制需要依靠輔助病毒腺病毒才能進(jìn)行[20]。AAV有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，轉(zhuǎn)染效率高，免疫原性低和在宿主體內(nèi)長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)的優(yōu)勢(shì)[21-22]。AAV載體比較成熟，整個(gè)基因組幾乎可以被掏空，其rep和cap基因被替換，只須保留兩端呈發(fā)夾結(jié)構(gòu)并具有調(diào)控功能的反向末端重復(fù)序列（145 bp）[20]。在293細(xì)胞中可以通過共轉(zhuǎn)染輔助質(zhì)粒和載體質(zhì)粒產(chǎn)生大量AAV載體[23]。2015年，Dion等[24]報(bào)道了一種基于AAV血清型2/8的肝特異性靶向的持續(xù)性HBV感染小鼠模型。通過尾靜脈注射AAV-HBV（非上文所講的高壓注射），可以在肝細(xì)胞得到高轉(zhuǎn)染效率的HBV表達(dá)細(xì)胞（HBcAg陽性肝細(xì)胞比例60%），血清中HBsAg、HBeAg和HBV DNA病毒學(xué)指標(biāo)可以持續(xù)1年以上，且在肝臟中沒有明顯的炎癥，并可同時(shí)觀察到HBV特異性免疫耐受[24]。

AAV-HBV小鼠模型中，小鼠感染率較水動(dòng)力轉(zhuǎn)染裸質(zhì)粒DNA小鼠模型高，且HBV在肝臟的表達(dá)水平也更持久穩(wěn)定，造模過程也相對(duì)簡(jiǎn)單，因此該模型應(yīng)用較廣。有研究者利用該模型研究發(fā)現(xiàn)，HBV特異性免疫耐受與血液循環(huán)中HBsAg的水平和持續(xù)時(shí)間有關(guān)，通過抗體清除血清中HBsAg可打破HBV誘導(dǎo)的免疫耐受，小鼠可以重新獲得對(duì)HBV疫苗的保護(hù)性免疫應(yīng)答[25-26]。臨床上使用的HBV預(yù)防性疫苗對(duì)HBV攜帶者及慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B, CHB）患者無效，無法打破機(jī)體形成的HBV特異性免疫耐受。上述發(fā)現(xiàn)揭示了，可以通過清除HBV攜帶者體內(nèi)的HBsAg來打破HBV誘導(dǎo)的免疫耐受，使患者重新建立針對(duì)HBV的免疫應(yīng)答。另外，Toll樣受體9的激動(dòng)劑CpG—Toll可以作為佐劑提升HBV疫苗的免疫效果[25-26]。另外，Bian等[27]通過臨床觀察CHB患者發(fā)現(xiàn)其大部分PreS1（HBV 前S1抗原）結(jié)構(gòu)域免疫耐受性低，并設(shè)計(jì)了針對(duì)PreS1區(qū)域的新型HBV疫苗，在AAV-HBV小鼠模型中概念性驗(yàn)證了該治療性疫苗的有效性。遺憾的是，AA V-HBV小鼠模型中沒有cccDNA形成，也沒有HBV感染。

4 HBV cccDNA小鼠模型

臨床上，cccDNA是HBV在體內(nèi)復(fù)制和停藥后再?gòu)?fù)發(fā)的根本原因，清除cccDNA是CHB患者完全治愈的金標(biāo)準(zhǔn)。為了克服在小鼠中檢測(cè)不到HBV cccDNA的問題，研究者們做了不同的嘗試。Qi等[28]做了最早的嘗試，利用Cre-LoxP重組原理，通過水動(dòng)力高壓同時(shí)注射Cre酶表達(dá)質(zhì)粒和含有HBV 1倍基因組的重組質(zhì)粒。在小鼠的肝臟細(xì)胞內(nèi)，Cre酶可以利用LoxP位點(diǎn)將HBV 1倍基因組的重組質(zhì)粒進(jìn)行重組得到HBV 重組cccDNA，同時(shí)該設(shè)計(jì)還巧妙地使用了內(nèi)含子序列，將殘留的LoxP在基因轉(zhuǎn)錄水平切除，該小鼠模型中可以檢測(cè)到病毒顆粒，病毒蛋白的表達(dá)。但是在該模型中，cccDNA在小鼠體內(nèi)持續(xù)時(shí)間較短，主要原因?yàn)椋孩俑邏鹤⑸涞馁|(zhì)粒中含有質(zhì)粒骨架，引起的免疫反應(yīng)導(dǎo)致了質(zhì)粒的清除和快速失活；②Cre酶可以持續(xù)不斷的介導(dǎo)含有LoxP的cccDNA分子間重組，導(dǎo)致cccDNA的損耗和不穩(wěn)定；③高壓注射方法肝細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率較低，HBV未能建立慢性感染。本課題組為了克服體內(nèi)重組的問題，使用微環(huán)DNA技術(shù)在細(xì)菌培養(yǎng)體系中生產(chǎn)出了HBV cccDNA細(xì)胞[29]。但是我們將cccDNA注射到C57小鼠中，cccDNA的持續(xù)時(shí)間僅在幾周之內(nèi)，未能體現(xiàn)出cccDNA的長(zhǎng)期存在。隨后Yan等[30]發(fā)現(xiàn)細(xì)菌生產(chǎn)的HBV cccDNA在C3H小鼠品系中可獲得高水平持久的HBV復(fù)制，HBV cccDNA的設(shè)計(jì)、劑量、攜帶HBV的基因型和不同宿主背景都有可能影響HBV在體內(nèi)的復(fù)制和持久表達(dá)。2018年，Li等[31]進(jìn)一步升級(jí)了Cre-Loxp系統(tǒng)，利用Cre轉(zhuǎn)基因小鼠，通過使用腺病毒載體遞送線性HBV基因組到小鼠肝臟內(nèi)，通過Cre酶在肝細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行重組得到HBV cccDNA。該小鼠模型中，HBV cccDNA可以持續(xù)62周以上，并在小鼠肝臟中發(fā)現(xiàn)持續(xù)的壞死性炎癥反應(yīng)和纖維化，在病毒存在的晚期階段也經(jīng)常見到發(fā)育不良的病變。由于仍舊是小鼠的肝臟細(xì)胞，該模型中HBV不能進(jìn)行二次感染，因此仍不能模擬HBV感染機(jī)體的整個(gè)生命周期。

5 肝臟人源化小鼠模型

理想HBV小鼠模型是將小鼠的肝細(xì)胞置換成人的肝細(xì)胞，這樣HBV就可以在小鼠中完成整個(gè)生命周期。發(fā)展人源化肝臟模型用于HBV研究大概經(jīng)歷了如下幾個(gè)階段。

5.1 HBV-trimera（三合）小鼠模型 1999年，IIan等[32]首次報(bào)道了人嵌合肝小鼠模型，他們首先通過高劑量輻射徹底破壞正常小鼠的造血系統(tǒng)，然后將重癥聯(lián)合免疫缺陷（severe combined immunodificiency, SCID）小鼠的骨髓細(xì)胞移植到這些小鼠中，最后將HBV感染者的肝片段移植到其耳朵或者腎包膜下，構(gòu)建了HBV復(fù)制模型。在該小鼠中，可以檢測(cè)到低水平短暫性HBV血癥，但是由于人肝細(xì)胞持續(xù)時(shí)間較短，不能廣泛應(yīng)用。

5.2 Alb-uPA/SCID人源化小鼠模型 第一個(gè)真正意義上的肝臟人源化小鼠是白蛋白啟動(dòng)子調(diào)控尿激酶纖維蛋白溶酶原活化子（albumin promoter/enhancer-regulated-urkinase plasminogen activator transgene, Alb-uPA）小鼠模型。肝內(nèi)過表達(dá)的尿激酶型纖溶酶原激活物（urokinase-type plasminogen activator, uPA）可以導(dǎo)致肝細(xì)胞大量死亡。2001年，Dandri等[33]和Mercer等[34]將正常人肝細(xì)胞移植到Alb-uPA/SCID小鼠中，其中人肝細(xì)胞嵌合率為15%，繼而用HBV感染含有嵌合人肝細(xì)胞的小鼠，發(fā)現(xiàn)在小鼠血清中HBV持續(xù)存在，并且病毒滴度不斷升高，說明HBV在該小鼠內(nèi)可以多輪感染，實(shí)現(xiàn)完整生命周期。但是，由于在肝內(nèi)過表達(dá)的uPA基因可導(dǎo)致出生后不久的小鼠出現(xiàn)嚴(yán)重腸道和腹部出血問題，并且這種損傷不受控制，人肝細(xì)胞必須在早期進(jìn)行移植，以使小鼠能夠存活。總的來說，該模型小鼠死亡率高，產(chǎn)率低，移植時(shí)間窗短限制了其應(yīng)用[35-36]。

5.3 基于Fah敲除誘導(dǎo)程序性肝損傷的肝臟人源化小鼠模型 延胡索酰乙酰乙酸水解酶（fumarylacetoacetate hydrolase, FAH）是酪氨酸降解途徑的最后一種酶，其缺失會(huì)使得肝毒性代謝產(chǎn)物積累進(jìn)而導(dǎo)致肝損傷[37]。藥物2-（2-硝基-4-三氟甲基苯甲酰）1，3-環(huán)己二酮[2-（2-nitro-4-trifluoromethylbenzoyl）-1, 3-cyclohexanedione,NTBC]可防止有毒代謝物的積累和肝毒性損傷[38]，研究者可通過調(diào)節(jié)NTBC的用量來控制肝細(xì)胞不同程度死亡。Fah-/-/Rag2-/-/Il2rγ-/-（FRG）小鼠是有著乙酰水解酶（fumarylacetoacetate hydrolase,FAH）-/-、重組激活因子2（recombination activator 2, RAG2）-/-、白介素2受體γ（interleukin 2 receptor γ, IL2Rγ）-/-免疫缺陷的小鼠，為異種移植人類肝細(xì)胞提供了很好的環(huán)境[39]。因此，Azuma等[39]利用FAH-/-小鼠進(jìn)一步構(gòu)建了含有人源肝臟的小鼠模型，其先用尿激酶表達(dá)的腺病毒對(duì)小鼠進(jìn)行預(yù)處理，24～48 h后通過脾內(nèi)注射大量人肝細(xì)胞，在接下來的5 d內(nèi)逐漸停用NTBC，在撤藥2周后，小鼠再給予5 d的藥后停藥，然后通過組織學(xué)、DNA分析、小鼠血清中人類白蛋白水平測(cè)定等方法確認(rèn)，該小鼠中人肝細(xì)胞移植率可高達(dá)90%。該肝臟人源化小鼠模型首次實(shí)現(xiàn)了肝臟在程序性調(diào)控下的重建，可以支持HBV的高水平復(fù)制[40]。我們也在NOD-Rag1-/-IL2rg-/-（NRG）免疫缺陷小鼠的基礎(chǔ)上利用基因編輯技術(shù)構(gòu)建了FAH-NRG小鼠[41]，該小鼠很容易支持人肝細(xì)胞再生，成模率高，支持HBV高水平復(fù)制[42]。基于此原理的肝臟人源化小鼠模型目前使用最廣。但是，F(xiàn)AH小鼠需要NTBC來維持，由于肝臟內(nèi)一直有肝細(xì)胞死亡，血清中有高水平ALT，NTBC的使用不當(dāng)很容易導(dǎo)致其死亡。

5.4 基于TK 轉(zhuǎn)基因誘導(dǎo)肝損傷的肝臟人源化小鼠模型 胸苷激酶（thymidine kinase, TK）可以在更昔洛韋（ganciclovir, GCV）作用下轉(zhuǎn)化成對(duì)細(xì)胞有毒的成分，進(jìn)而摻入到基因組中擾亂細(xì)胞增殖。Hasegawa等[43]利用NOD/Shi-scid IL2Rγnull（NOG）免疫缺陷小鼠開發(fā)了TK-NOG轉(zhuǎn)基因小鼠。該小鼠中肝細(xì)胞可實(shí)現(xiàn)GCV調(diào)控下的損傷凋亡，以及隨后人肝細(xì)胞的高水平重建，并可以有效支持HBV感染復(fù)制。TK-NOG小鼠是代表著HBV感染小鼠的另外一個(gè)重要分支，其臨床應(yīng)用比FAH小鼠更為廣泛，可以用于臨床藥物評(píng)價(jià)。

6 總 結(jié)

經(jīng)過三十多年的探索，HBV感染模型發(fā)展的越來越完善。使用免疫缺陷小鼠構(gòu)建的人源化肝臟是主流方向，HBV可以在小鼠中完成完整的復(fù)制周期，目前針對(duì)HBV本身的新型藥物都在這類小鼠中進(jìn)行測(cè)試。但限于肝細(xì)胞和造血干細(xì)胞來源同一個(gè)體的難題，且得到免疫系統(tǒng)和肝臟同時(shí)重建的人源化小鼠成本較高[44]，雖有成功報(bào)道[45]，但不具有廣泛使用性。另外，目前肝臟人源化的小鼠還不能用于測(cè)試基于免疫調(diào)節(jié)來控制和清除HBV的新藥策略。AAV-HBV小鼠和重組cccDNA小鼠雖然不及肝臟人源化小鼠，但其含有免疫系統(tǒng)，現(xiàn)階段正好可以彌補(bǔ)肝臟人源化小鼠的缺陷，是HBV研究領(lǐng)域的重要模型。而基于高壓注射方式構(gòu)建的HBV小鼠模型在分析結(jié)果解讀過程中一定要考慮質(zhì)粒來源和質(zhì)粒骨架所引起免疫反應(yīng)這個(gè)因素。