隱匿性乙型肝炎病毒感染的研究進展

王 鈞，劉 妍，徐東平

HBV感染可引起不同的臨床表現(xiàn)，如無癥狀攜帶者、急慢性乙型肝炎（乙肝）、肝硬化、肝細胞癌以及肝衰竭等[1]。20世紀70年代，研究者發(fā)現(xiàn)了一種新型的臨床HBV感染狀態(tài)，即感染者的HBV核心抗體（抗-HBc）IgG陽性但HBsAg陰性。后來隨著高度敏感的分子生物學(xué)檢測方法的發(fā)展，隱匿性HBV感染（occult HBV infection,OBI）的臨床類型和概念逐漸被定義[2]。OBI與輸血傳播風(fēng)險、疫苗免疫失敗以及肝病潛在進展風(fēng)險密切相關(guān)[2]。但其臨床特點尚不明確，需要更多的研究去探討OBI在高風(fēng)險人群以及臨床就診人群中的發(fā)生特點。目前已有的OBI相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，有些群體被認為是發(fā)生OBI再激活的高風(fēng)險人群，如接受免疫抑制治療的HBV既往感染者。為了預(yù)防OBI傳播，應(yīng)該在獻血者、免疫抑制患者、器官移植捐獻者和接受者中進行HBV DNA篩查[3]。本綜述主要結(jié)合近年來OBI相關(guān)文獻，對OBI的定義和流行率、發(fā)生機制及臨床意義進行闡述。

1 OBI定義和流行率

2008年在意大利舉辦的研討會中研究者明確定義血清HBsAg陰性，肝組織中HBV DNA陽性（血清中HBV DNA陽性或陰性）為OBI[4]。2019年Liu等[5]提出了新的OBI概念：血清HBsAg陰性，肝組織HBV 松弛環(huán)狀的雙鏈DNA（relaxed circular DNA, rcDNA）和/或共價閉合環(huán)狀DNA分子（covalently closed circular DNA, cccDNA）陽性，單跨缺口或雙跨缺口PCR可以特異性擴增rcDNA和/或cccDNA而非整合DNA。雖然根據(jù)肝組織HBV DNA陽性定義OBI最準確，但在臨床實踐中肝組織不易獲得且缺少標準化檢測方法。隨著血清HBV DNA檢測的標準化和靈敏度提高，當(dāng)前臨床研究中經(jīng)常把OBI定義為：HBsAg陰性，血清HBV DNA陽性。若HBV DNA無法獲得或者懷疑存在間歇性病毒血癥時，血清抗-HBc單獨陽性也要考慮OBI的可能[4]。本文所引研究中OBI定義稍有不同，為血清HBsAg陰性，DNA陽性（血清或肝組織）。

OBI可以分為兩類：①血清學(xué)陽性O(shè)BI，即抗-HBc和/或抗-HBs陽性，這類OBI患者占多數(shù)。一般發(fā)生在急性肝炎后HBsAg陰性或者在慢乙肝感染期間HBsAg清除時。②血清學(xué)陰性O(shè)BI，即抗-HBc和抗-HBs陰性，這類OBI患者約占20%。因為S基因突變或抗-HBs進行性減少至消失，感染初始血清中抗-HBc和抗-HBs就以隱匿性狀態(tài)存在[4]。

不同研究中的OBI發(fā)生率不同。中國西北部6706例年齡＜12歲的社區(qū)兒童中，1192例HBsAg陰性，其中OBI的發(fā)生率為1.260%（15/1192），主要基因型是B型和C型[6]。中國廈門的一項研究發(fā)現(xiàn)，38 499例獻血者中有61例OBI患者，發(fā)生率為0.158%（61/38 499）[7]。法國圣安東尼大學(xué)醫(yī)院對過去7年間就診的3966例患者（同時有HBV DNA定量和HBsAg、抗-HBc、抗-HBs結(jié)果）研究發(fā)現(xiàn)，其中OBI發(fā)生率為1.200%（47/3966）[8]。Liao等[9]研究揭示中國寶雞地區(qū)獻血者中OBI發(fā)生率為0.054%（60/11 0843），而張凱等[10]在6996例肝病患者中共篩選出12例OBI患者，發(fā)生率為0.172%（12/6996）。

2 OBI發(fā)生機制

2.1 病毒因素 HBV PreS/S基因突變會影響HBsAg的表達、分泌和抗原性，進而降低血清中抗體對抗原的結(jié)合效力，導(dǎo)致免疫逃逸[11]。OBI患者HBV突變可能會導(dǎo)致其復(fù)制力降低，使血清和肝組織內(nèi)HBV DNA水平更低或檢測不到，而低病毒復(fù)制力反過來又會影響HBsAg的表達和分泌[12]。此外，有研究報道HBV基因組甲基化也與OBI形成有關(guān)[13]。

HBsAg主要親水區(qū)（major hydrophilic region,MHR） 為aa99～169。其中的“α”決定簇（aa124～147）基因突變是導(dǎo)致OBI發(fā)生的一個主要原因?！唉痢睕Q定簇是病毒重要的中和表位，該區(qū)基因突變會引起蛋白結(jié)構(gòu)改變，影響HBsAg的抗原性[14]。已有實驗證明“α”決定簇經(jīng)典的sG145R突變會降低抗體與HBsAg的親和力，導(dǎo)致OBI發(fā)生[2]。最近，Zhang等[15]驗證了9株OBI相關(guān)的HBsAg MHR突變（6株來自O(shè)BI相關(guān)肝癌患者，3株來自O(shè)BI獻血者）可降低HBsAg抗原性，導(dǎo)致HBsAg商業(yè)試劑檢測力下降。此外，PreS1/PreS2啟動子基因突變也會導(dǎo)致OBI患者的HBsAg降到試劑檢測不到的水平[2]。還有研究發(fā)現(xiàn)與HBV野生株相比，4種HBsAg MHR N-糖基化突變會降低HBsAg抗原性且其中3種新型N-糖基化突變株對6種HBsAg檢測試劑的反應(yīng)性降低，表明MHR N-糖基化突變可能是引起患者OBI表現(xiàn)的原因之一[16]。

2.2 宿主因素 宿主免疫反應(yīng)和遺傳因素也與OBI的發(fā)生相關(guān)，可能是通過控制HBV活動，抑制HBsAg和其他HBV分泌的蛋白，以及提高免疫突變的基因屏障等方面影響HBV。其中最受關(guān)注的是調(diào)控免疫反應(yīng)中起重要作用的HLA，其多態(tài)性被認為是決定HBV感染患者預(yù)后的重要因素[13]。

宿主表觀遺傳修飾也可能與OBI相關(guān)，宿主細胞微小RNAs（microRNAs, miRNAs）可以調(diào)控一些宿主基因的表達并對HBV復(fù)制和抗原表達發(fā)揮作用。研究報道，HBV特異性血清miRNAs可以較準確地在人群中鑒定篩選出OBI患者（敏感性99.9%，特異性99.8%），但該研究樣本量（OBI組11例）較小，存在一定局限性[17]。

2.3 其他因素 有研究表明，其他病毒的感染也會影響OBI發(fā)生，如慢性HCV感染對HBV有抑制作用。IFN-利巴韋林治療HCV感染時，患者的HBV DNA水平會上升，但當(dāng)HCV水平突破時，HBV DNA水平反而會下降。體外實驗也證明了HCV核心蛋白對HBV復(fù)制和表達有抑制作用[13]。

3 OBI的臨床意義

3.1 OBI和輸血 曾有研究報道，無癥狀的獻血者輸血也會造成HBV傳播，后來經(jīng)證明是OBI引起的，這些獻血者的血清中檢測不到HBsAg，但有反復(fù)波動的低水平病毒血癥[18]。2015年在意大利發(fā)現(xiàn)了2例輸血后獲得肝炎的病例，且供受者HBV序列高度同源[19]。也有研究鑒定了10對獻血供、受者的HBV DNA 具有99%的序列同源性，證實了OBI的血液傳播性[20]。Liao等[9]的研究證實了HBV PreS/S免疫逃逸突變是與獻血者OBI相關(guān)的重要因素，其中位于MHR的sS117T、sT118K、sT131N、sT134Y/L和sD144E突變發(fā)生率顯著高于對照組。中國廈門的一項研究表明OBI組S基因MHR突變發(fā)生率顯著高于HBV攜帶組，MHR的13種突變中有4種（sC124R、sC124Y、sK141E、sD144A）會顯著降低7種HBsAg檢測試劑的敏感性，有10種突變（sG119R、sC124Y、sI126S、sQ129R、sS136P、sC139R、sT140I、sK141E、sD144A、sG145R）在HuH7細胞和小鼠中會顯著降低病毒顆粒和/或S蛋白的分泌[7]。因此提高OBI獻血者的檢出率對于降低HBV輸血傳播風(fēng)險非常必要。

3.2 OBI和疫苗失敗 我國新生兒乙肝疫苗接種計劃自1992年起在全國實施，雖然有效降低了HBV感染率，但也并不能完全阻斷HBV感染。部分HBsAg陽性母親所生嬰兒免疫阻斷后雖然HBsAg陰性且符合目前HBV母嬰阻斷成功的標準，但其血清中的HBV DNA檢測陽性，提示這些嬰兒免疫阻斷后存在OBI[21]。國內(nèi)一項納入了158例出生后接受HBV疫苗主動免疫和高效價免疫球蛋白被動免疫的新生兒（母親均為HBsAg陽性）的研究顯示，這些新生兒在7月齡時雖然HBsAg均為陰性且抗-HBs陽性，但其中有32例血清HBV DNA中位水平為1.97（1.20～3.71）log10IU/ml，OBI檢出率高達20.3%（32/158）。另外隨訪數(shù)據(jù)顯示，這32例OBI新生兒在12、24和36月齡時HBV DNA陽性率分別為25.0%（8/32）、21.9%（7/32）和7.7%（2/26，6例缺失）。其中有31例患兒曾在某個隨訪點檢測不到HBV DNA（4例在24月齡、2例在36月齡又檢出低水平HBV DNA）；另有1例隨訪期間HBV DNA一直低水平復(fù)制。結(jié)果提示OBI與母嬰傳播疫苗阻斷失敗密切相關(guān)[22]。

3.3 OBI與肝臟疾病進展 很多研究認為OBI是促進肝臟疾病進展（肝硬化和肝癌）的一個重要危險因素[2]，但是目前兩者之間的具體關(guān)系并未完全明確。

3.3.1 肝硬化 OBI也是造成肝硬化的主要原因之一。國外一項研究表明OBI在病因未明的隱匿性肝硬化患者中較常見，且OBI可能會導(dǎo)致該類患者病情加重，由隱匿性肝硬化進展為失代償肝硬化[23]。OBI造成肝損傷的機制還未明確，但是一些研究數(shù)據(jù)表明肝細胞內(nèi)HBV cccDNA的持續(xù)存在和轉(zhuǎn)錄以及細胞因子（例如TNF-α和IFN-γ）的產(chǎn)生都可能會導(dǎo)致肝細胞損傷[24-25]。HBV X區(qū)突變的發(fā)生會引起X蛋白反式激活能力下降，導(dǎo)致HBV DNA低水平復(fù)制和血清HBsAg陰性[2]。

3.3.2 肝癌 乙肝和丙型肝炎都是肝癌進展的主要危險因素。在肝癌患者的肝細胞核內(nèi)可檢測到持續(xù)存在的HBV cccDNA。OBI引起肝癌發(fā)生，可能有以下機制：HBV DNA整合進入宿主基因組，整合的HBX和截短的PreS2/S基因序列可以改變細胞的基因表達，導(dǎo)致肝癌發(fā)生。而且OBI患者中HBV游離的基因形式和整合的基因形式都能夠以低水平復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、合成蛋白[2]。Chen等[26]研究發(fā)現(xiàn)1例晚期HBV相關(guān)肝癌患者的OBI臨床表現(xiàn)是由其感染的多種S基因突變病毒株引起的，其中一些S基因突變可以影響病毒的表型特點，可能與肝癌進展密切相關(guān)。李奇等[27]對1株來源于典型OBI患者的新型HBV MHR突變株“aa126～127‘RPCMNCTI’插入”進行了體外細胞水平致瘤性實驗，發(fā)現(xiàn)這種新型突變HBV S基因具有促進腫瘤生長的細胞生物學(xué)特點，可能是慢性HBV感染向肝癌進展的潛在風(fēng)險因素。

HCV感染的肝癌患者中，OBI（血清HBsAg陰性，肝組織DNA陽性）發(fā)生率都在40%以上，明顯高于單純慢性HCV感染者。此外，OBI在HCV感染的肝癌患者中的比例明顯高于未感染HCV的肝癌患者，可見OBI與HCV感染的肝癌發(fā)生也有相關(guān)性[21]。

3.4 OBI與HBV再激活 臨床中OBI再激活大多發(fā)生在高風(fēng)險患者中，HBV復(fù)制水平增加會發(fā)生暴發(fā)性肝炎[2]。

3.4.1 HBV與HCV/HIV共感染 有研究報道，HBV感染者抗反轉(zhuǎn)錄病毒藥物撤藥后，會發(fā)生HBV再激活，但在HIV陽性的患者中HBV再激活的臨床意義還未明確[28]。過去幾年，在采用IFN治療為主的HBV/HCV共感染者中發(fā)生了HBV再激活現(xiàn)象，雖然這種情況可能是IFN直接的免疫調(diào)節(jié)作用引起的，但更可能是HCV被抑制后引起HBV復(fù)制導(dǎo)致的[29-31]。由于IFN也可以抑制HBV復(fù)制，因此關(guān)于其引起的HBV再激活的研究相對較少。直接抗病毒藥物（direct-acting antiviral agents, DAAs）不能抑制HBV復(fù)制，其在治療慢性HCV感染合并OBI的患者時也可能發(fā)生HBV再激活，引起急性肝炎，增加肝衰竭的風(fēng)險[32-35]。有研究報道，與IFN相比，采用DAAs治療的慢性HCV感染合并OBI患者，HBV再激活現(xiàn)象發(fā)生得更早也更加有臨床意義，提示對于DAAs治療的慢性HCV感染者，明確其合并HBV感染還是OBI并對其進行干預(yù)管理具有重要意義[29]。

3.4.2 OBI與肝移植 對于終末期慢性肝病患者，肝移植是目前惟一的治療選擇，但是對于存在OBI的肝移植受者，免疫抑制因素會引起HBV再激活現(xiàn)象增加而且會迅速導(dǎo)致移植失敗和死亡[36]。有研究表明血清抗-HBc是潛在的OBI新型血清標志物之一。如有研究通過檢測抗-HBc陽性患者的HBV DNA水平明確OBI的存在[37]。Tandoi等[38]對HBsAg陰性且抗-HBc陽性患者的肝組織進行研究，發(fā)現(xiàn)60%的患者可以檢測到cccDNA，其中17%的患者血清HBV DNA陽性。最近Caviglia等[39]發(fā)現(xiàn)肝組織cccDNA陽性的肝移植供者血清抗-HBc IgG水平顯著高于cccDNA陰性者，且抗-HBc IgG水平（＞ 4.4 COI）與肝組織cccDNA陽性有顯著相關(guān)性，提示血清抗-HBc IgG水平將可能作為免疫抑制患者中OBI再激活的一種風(fēng)險預(yù)測指標。

3.4.3 OBI與免疫抑制治療 血液腫瘤患者在接受造血干細胞移植以及抗-CD20（利妥昔單抗）或抗-CD52（阿倫單抗）等免疫抑制治療后，HBV再激活的風(fēng)險增高。HBV再激活時患者會由于肝衰竭或者中斷特異性治療原發(fā)疾病進展而導(dǎo)致其死亡。除了宿主因素，一些病毒因素也是HBV再激活的原因[40]。日本研究者在1例基因型為Bj的暴發(fā)性肝衰竭血液腫瘤患者（接受了免疫抑制治療）中檢出HBV基因組前核心區(qū)終止突變（A1896）[41]，埃及和意大利的研究發(fā)現(xiàn)HBV基因亞型D1也可能和免疫抑制治療后HBV再激活有關(guān)[42-43]。一旦HBV再激活應(yīng)立即給予有效的抗病毒治療，研究發(fā)現(xiàn)拉米夫定單藥治療對于降低患者病死率基本無效，因此應(yīng)選擇恩替卡韋或者替諾福韋等高抗病毒效能、高耐藥基因屏障的藥物[40]。

4 展 望

OBI是威脅患者生命安全的全球公共健康難題，也是發(fā)展為終末期肝病的重要危險因素之一。OBI的大規(guī)模篩查花費巨大，經(jīng)濟負擔(dān)重，尤其是對于發(fā)展中國家，因此許多存在OBI的患者尚未被明確診斷。對于OBI傳播高風(fēng)險人群（器官移植受者、獻血者、抗-CD20化療患者、HBV與HCV/HIV共感染患者、HBV流行地區(qū)的疫苗接種兒童等），HBV DNA定量和多價抗-HBs的HBsAg檢測試劑都需要被推廣，高風(fēng)險的OBI患者應(yīng)該在治療前至少檢查1次抗-HBc和HBV DNA，并定期監(jiān)測ALT水平。未來我們需要確定不同風(fēng)險人群的最佳用藥時機和個體化用藥方案。當(dāng)前，OBI的新型血清學(xué)標志物（如抗-HBc）也越來越受到關(guān)注，更可靠、更便捷的血清學(xué)標志物的出現(xiàn)將有助于降低OBI篩查的成本以及OBI患者的臨床風(fēng)險。