多囊卵巢綜合征蛋白質組學研究進展

陳莉，陶麗梅，王芳

(蘭州大學第二醫(yī)院，蘭州 730030)

多囊卵巢綜合征(PCOS)作為女性最常見的生殖內(nèi)分泌疾患之一，其在育齡期婦女中的發(fā)病率高達6%～21%[1]，但PCOS的發(fā)病機制至今尚未明確，可能與遺傳、環(huán)境、生活方式的改變以及心理因素等有關[2-3]。PCOS主要以排卵障礙、高雄、多囊卵巢為特征，臨床表現(xiàn)常伴有月經(jīng)延遲、閉經(jīng)、肥胖、痤瘡等[4]，遠期可伴發(fā)高血壓、糖尿病等心腦血管疾病甚至子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生等[5]，從而嚴重影響著女性的健康。目前該病尚缺乏統(tǒng)一的診斷標準，多采用“鹿特丹診斷標準”對PCOS進行診斷[6]。近年來，越來越多的研究者利用蛋白質組學對PCOS發(fā)病機制進行研究，目前已篩選出了一些生物標記物，并從一定程度上闡釋了PCOS在分子的蛋白水平上可能的發(fā)病機制。本文擬就近年來有關PCOS發(fā)病機制研究中蛋白質組學的應用現(xiàn)狀以及所取得的進展進行探討，以期為臨床早期診斷與對因治療PCOS提供新思路。

一、蛋白質組學相關技術

疾病的發(fā)生與發(fā)展是動態(tài)變化的，以往的基于基因水平的研究已不能滿足目前我們對疾病不斷變化的發(fā)病機制的探索，以蛋白質動態(tài)變化為基礎的蛋白質組學應運而生。蛋白質組學以機體內(nèi)全部蛋白質為研究對象，并對這些蛋白質進行全面動態(tài)的掌控，熟知其動態(tài)變化過程以及所處的不同功能狀態(tài)。

蛋白質組學技術主要包括分離技術和鑒定技術。雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳(2-DE)[5，7-8]此分離技術以分子量和電荷量的不同為前提，最終分離出不同的蛋白，2-DE成本低下且結果直觀，但該方法對分子量太大、太小的蛋白質尚不能很好地分離，且此法耗時長。在2-DE的基礎上，差異凝膠電泳相對變得簡單，并具有較高的靈敏度[9]。此外，非凝膠的蛋白分離技術如多維液相色譜(MDLC)[7]的出現(xiàn)使得蛋白分離工作簡單很多。主要的蛋白鑒定技術包括如下：質譜分析(MS)是最常用的蛋白質鑒定技術[10]。另外，基質輔助激光解析/電離飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)耗時短，靈敏度較高[10]，還有電噴霧電離串聯(lián)質譜(ESI-MS/MS)，與MALDI-TOF-MS相比，其準確度更高，但靈敏度較低，且ESI-MS/MS操作相對復雜。表面增強激光解析離子化-飛行時間-質譜(SELDI-TOF-MS)[12-13]是蛋白質芯片與質譜的整合體，SELDI-TOF-MS的優(yōu)勢在于高靈敏度和高重復性。但SELDI-TOF-MS 也存在著自身的不足，如芯片成本較高，且此法只能對目前已知的蛋白進行較好的測定。

二、蛋白質組學在PCOS中的應用

在利用蛋白質組學對PCOS發(fā)病機制的研究中，目前所采用的樣本為血液、卵巢組織、子宮內(nèi)膜組織、骨骼肌組織、卵泡液、顆粒細胞、脂肪組織和T淋巴細胞。本文進行分別闡述。

1.血液蛋白質組學：最初的蛋白質組學研究發(fā)現(xiàn)PCOS中胰島素抵抗(IR)患者、非胰島素抵抗(non-IR)患者和對照組兩兩比較均呈現(xiàn)多種蛋白的差異表達。這些差異蛋白的發(fā)現(xiàn)有助于我們對PCOS中IR、non-IR可能的發(fā)病機制形成初步了解[14]。另外，有學者進行了PCOS血漿蛋白質組學研究[15-16]，對PCOS高雄組與非高雄組血漿蛋白質組進行了比較，發(fā)現(xiàn)高雄組中的轉鐵蛋白、血漿結合珠蛋白亞型、ɑ2-巨球蛋白等均出現(xiàn)明顯上調。這些表達上調的蛋白質其實質是炎癥因子，且這些炎癥因子與鐵代謝息息相關。相關研究從一定程度上表明炎癥與鐵代謝可能參與了PCOS的發(fā)病過程。

2.卵巢組織蛋白質組學：有研究者比較了PCOS患者與正常婦女卵巢組織中蛋白質的差異表達情況[17]，鑒定出了多種差異蛋白，其主要涉及機體的正常生命活動與細胞代謝，并且還發(fā)現(xiàn)，熱休克蛋白(HSP)27高表達于正常婦女卵母細胞中，而低表達于PCOS中。HSP27是一種抗氧化因子，它通過抑制活性氧的產(chǎn)生而發(fā)揮抗氧化作用。因此，抗氧化作用的缺乏可能抑制了PCOS患者卵泡的發(fā)育成熟，但其具體作用機制尚不明確。另有研究發(fā)現(xiàn)，PCOS和正常卵巢還出現(xiàn)膜相關孕酮受體組分1、視黃醇結合蛋白1、熱休克蛋白90B1、鈣調蛋白1、膜聯(lián)蛋白A6和原肌球蛋白2的差異性表達[18]。關于這些差異蛋白可能的作用機制尚未明確，但這些新的差異表達蛋白的發(fā)現(xiàn)，在一定程度上補充了以往的研究結果，有望成為未來預測PCOS的新型生物標志物。

3.子宮內(nèi)膜組織蛋白質組學：近期有研究比較了PCOS患者與正常女性子宮內(nèi)膜組織蛋白的差異表達[19]，發(fā)現(xiàn)14-3-3蛋白質、膜聯(lián)蛋白A5、SERPINA1和組織蛋白酶D在PCOS與正常女性不同月經(jīng)周期階段(增殖期和黃體期)子宮內(nèi)膜中呈現(xiàn)出了不同的表達。以上蛋白主要參與了機體的細胞凋亡、氧化應激、炎癥和細胞骨架的形成，因此揭示出子宮內(nèi)膜自身的異常在PCOS發(fā)病機制中可能扮演著重要角色。目前有關于PCOS子宮內(nèi)膜蛋白質組學的研究還甚少，有關于這些差異蛋白的具體作用機制，尚需進一步的研究予以證實。

4.骨骼肌蛋白質組學：有研究在嚴重肥胖男性、女性、以及雄激素過量的女性減肥手術中獲得了骨骼肌活檢，并進行蛋白質組學分析，結果顯示具有雄激素過多癥的女性呈現(xiàn)出糖原磷酸化酶、丙酮酸激酶、β-烯醇酶、甘油-3-磷酸脫氫酶、肌酸激酶M型和結蛋白的低表達[20]，這些蛋白主要涉及了機體的糖代謝過程。該研究提示高雄激素血癥女性胰島素抵抗的發(fā)生可能是由其糖代謝關鍵蛋白的缺乏所致。此研究結果對于肥胖PCOS女性來說，可能會是一個新的研究出發(fā)點。

5.卵泡液蛋白質組學：有研究者分析了受控卵巢過度刺激期間PCOS和正常受試者卵泡液中的差異蛋白質[21]，結果發(fā)現(xiàn)鑒定出的差異蛋白質主要與細胞代謝和生理過程相關，說明卵泡液中蛋白質的改變很可能參與了PCOS的發(fā)病過程。后來的研究還發(fā)現(xiàn)，PCOS卵泡液中呈現(xiàn)出了激肽原1、細胞角蛋白9、抗凝血酶、纖維蛋白原γ-鏈、載脂蛋白A-IV(apoA-IV)前體和α-1-B-糖蛋白(A1BG)6種高表達蛋白[13]。這些差異蛋白的發(fā)現(xiàn)有助于我們進一步理解PCOS的可能發(fā)病機制。更近的研究還發(fā)現(xiàn)，PCOS組與對照組卵泡液呈現(xiàn)出多種蛋白的差異表達，包括雙調蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白多糖2、腫瘤壞死因子α、誘導蛋白6、纖溶酶原和淋巴管內(nèi)皮透明質酸受體1[22]，這些蛋白均是卵泡發(fā)育不可缺少的，而它們在PCOS卵泡液中呈現(xiàn)出低表達。這一研究結果可能部分解釋了PCOS女性體內(nèi)所呈現(xiàn)出的異常卵泡的生成情況。

6.顆粒細胞蛋白質組學：對PCOS卵泡顆粒細胞進行蛋白質組學研究發(fā)現(xiàn)，載脂蛋白A-I(ApoA-I)在PCOS患者中出現(xiàn)明顯的低表達[23]。ApoA-I可降低顆粒細胞系中類固醇生成酶的轉錄水平，此外，顆粒細胞中ApoA-I表達水平的改變也對黃體酮的生成產(chǎn)生影響。因此，該研究提示ApoA-I可作為PCOS顆粒細胞生物標志物之一，并且ApoA-I低表達可能與PCOS患者類固醇激素紊亂有關。

7.脂肪組織蛋白質組學：脂肪組織蛋白質組學研究發(fā)現(xiàn)，PCOS患者脂肪組織中膜聯(lián)蛋白V、谷胱甘肽S-轉移酶M3高表達，而白蛋白、過氧化物酶2亞型A、β肌動蛋白以及脂肪細胞質膜蛋白低表達[24]。以上蛋白表達的改變揭示氧化應激、糖脂代謝可能參與了PCOS的發(fā)病機制。還有研究比較了PCOS伴高雄和非高雄正常女性皮下和內(nèi)臟脂肪組織樣品蛋白的差異表達，結果顯示PCOS過氧化物氧還蛋白6、肌酸激酶B型、硒結合蛋白1、RuvB樣2、4-三甲基氨基丁醛脫氫酶和白蛋白高表達[25]，該研究結果提示以上差異表達的蛋白可能參與了PCOS高雄的發(fā)病機制，但具體機制尚未明確。

8.T淋巴細胞蛋白質組學：一項研究應用蛋白質組學比較了PCOS和先天性腎上腺增生癥中T淋巴細胞蛋白的差異表達[26]。結果發(fā)現(xiàn)這些差異表達的蛋白質參與許多生理過程，如免疫系統(tǒng)的調節(jié)、細胞骨架的形成、氧化應激、凝血和胰島素抵抗發(fā)生等，為PCOS的發(fā)病機制提供了新的線索[27]。另有研究發(fā)現(xiàn)，在PCOS患者T淋巴細胞中出現(xiàn)了組織蛋白酶D、3-羥基異丁酸脫氫酶、蛋白質二硫鍵異構酶A3和Raf激酶抑制蛋白表達的下降，而血小板堿性蛋白和超氧化物歧化酶表達的升高[28]，有關這些蛋白在PCOS發(fā)病進程中是如何發(fā)揮作用，還有待于進一步的研究。

綜上所述，目前應用蛋白質組學對PCOS的研究中，所用樣本涉及了血液、卵巢、子宮內(nèi)膜、骨骼肌、卵泡液、顆粒細胞、脂肪組織以及T淋巴細胞。比較以上不同組織中與PCOS發(fā)病相關蛋白的改變，發(fā)現(xiàn)PCOS患者不同組織的蛋白質組學結果存在不同，但仍存在一定的聯(lián)系。通過比較分析發(fā)現(xiàn)，PCOS卵巢組織、子宮內(nèi)膜以及脂肪組織中均呈現(xiàn)出了膜聯(lián)蛋白的變化，而膜聯(lián)蛋白是一種分布于細胞膜，且與細胞凋亡密切相關的一種蛋白質[29]，推測細胞凋亡可能是PCOS發(fā)病的機制之一，且膜聯(lián)蛋白可能作為PCOS發(fā)病較為有效的生物標記物；在骨骼肌組織與脂肪組織中，均出現(xiàn)了肌酸激酶的改變，而肌酸激酶是一種與糖代謝關系密切的蛋白[20]，推測PCOS女性未來胰島素抵抗的出現(xiàn)可能與糖代謝酶的變化相關；在卵泡液和顆粒細胞中，均出現(xiàn)了載脂蛋白的改變，而文獻報道載脂蛋白主要通過調節(jié)人體激素而影響卵泡的生長發(fā)育[13，22]，說明這兩種組織中載脂蛋白的變化在PCOS發(fā)生機制中的可能作用途徑是影響卵泡的生長發(fā)育；在血液與卵泡液中，都存在與炎癥相關蛋白的高表達，如血液中的轉鐵蛋白、血漿結合珠蛋白亞型和ɑ2-巨球蛋白，以及卵泡液中的腫瘤壞死因子α，一定程度上說明了炎癥可能參與了PCOS的發(fā)病進程。因血液采集簡單方便，且血液中涵蓋豐富的蛋白質，因此也成為了臨床最為常用的標本。但比較PCOS患者血液與其他不同組織的蛋白質組學，發(fā)現(xiàn)血液中蛋白的表達與卵巢組織、子宮內(nèi)膜等尚無表達相同的蛋白。但我們認為血液標本仍然是進行PCOS研究最為簡單可靠的材料，但鑒于目前研究尚少，且大樣本研究的缺乏，因而未能達到預期的研究成果，后續(xù)大樣本的研究將會取得更好的研究成果。

三、存在的問題及展望

近年來，蛋白質組學被越來越多地應用，不僅僅用于對PCOS的研究，亦被用于其他疾病的研究。到目前為止，取得了一定的研究成果。然而，蛋白質組學的應用尚存在較多的困難與挑戰(zhàn)。首先，目前國內(nèi)外PCOS蛋白質組學的研究中，樣本的選擇尚缺乏統(tǒng)一性，在眾多的樣品中，血液中富含多種蛋白質，它能夠較準確地反映出機體整體的蛋白質水平，并且采集血液簡單易行，故血液標本有望成為后續(xù)進行診斷標記物篩查的最佳選擇對象。其次，在蛋白質組學的技術選擇上來說，涉及各種凝膠電泳、各種質譜技術的選擇，很顯然，不同的凝膠電泳與不同的質譜技術之間存在著差異，這也許也會導致不同研究結果的出現(xiàn)。另外，就現(xiàn)有的研究而言，基本都是小樣本的研究，尚缺乏大樣本、大數(shù)據(jù)的有關于PCOS蛋白質組學的研究。因而，后續(xù)的PCOS蛋白質組學研究應擴大樣本量，尋找最佳的實驗樣本和蛋白質組學技術，為未來PCOS的早期診斷、有效治療以及并發(fā)癥的早期預防提供科學可靠的理論依據(jù)。