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    推拿對(duì)兔腰椎間盤(pán)退變組織中TNF-α、IL-6、TGF-β1、CTGF的影響*

    2019-02-17 07:43:38趙小艷蘇程果劉華輝羅才貴朱明雙
    關(guān)鍵詞:分泌量造模椎間盤(pán)

    趙小艷, 蘇程果,劉華輝,羅才貴,袁 曄,朱明雙△

    1.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院(成都 610075);2.四川寶石花醫(yī)院 (成都 610213)

    椎間盤(pán)退變是大多腰腿痛患者的共同病理基礎(chǔ),已造成嚴(yán)重的社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1-2]。國(guó)內(nèi)外已有椎間盤(pán)退變性疾病的發(fā)病機(jī)理及治療方法的相關(guān)研究[3-5]。研究[5]表明,推拿對(duì)椎間盤(pán)退變性疾病有著良好的臨床療效,而TNF-α、IL-6、TGF-β1、CTGF與腰椎間盤(pán)退行性變關(guān)系密切。本研究觀察推拿對(duì)兔腰椎間盤(pán)退變組織中TNF-α、IL-6、TGF-β1、CTGF含量的變化,進(jìn)一步證實(shí)推拿對(duì)腰椎間盤(pán)退變性疾病的防治作用。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

    4月齡新西蘭大白兔33只,體重2.0~2.5 kg,由成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào): SCXK(川) 2018-17。實(shí)驗(yàn)于成都中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心完成,此次研究符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

    1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑及設(shè)備

    ELISA試劑盒(MLBIO);二甲苯(國(guó)藥集團(tuán));無(wú)水乙醇(國(guó)藥集團(tuán));乙二胺四乙酸二鈉(上海凌風(fēng));氫氧化鈉(滬試);新型脫鈣液(北京索萊寶);超聲細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝生物);臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(Heal Force);全自動(dòng)研磨儀(servbio生物 );脫水機(jī) (武漢俊杰) 等。

    1.3 造模分組

    白兔適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,先取3只動(dòng)物進(jìn)行造模預(yù)實(shí)驗(yàn)。隨機(jī)從中取1只通過(guò)耳緣靜脈空氣栓塞后解剖其腰椎組織,觀察兔腰椎解剖結(jié)構(gòu)。然后取2只借鑒黃杰烽等[6]的穿刺纖維環(huán)法進(jìn)行兔腰椎間盤(pán)退變?cè)炷nA(yù)實(shí)驗(yàn),然后處死,解剖觀察到穿刺針刺入椎間盤(pán)。剩余30只白兔隨機(jī)分成空白組、模型組、推拿組,每組10只。除空白組外其他兩組均進(jìn)行兔腰椎間盤(pán)退變?cè)炷?,具體方法如下。造模前24 h禁食,稱(chēng)重并計(jì)算麻醉劑量,10%的水合氯醛按3 mL/kg進(jìn)行耳緣靜脈注射麻醉。定位: 將動(dòng)物俯臥位放置固定、備皮、消毒。在兔最下端肋骨對(duì)應(yīng)椎體的下一個(gè)椎體棘突即為L(zhǎng)1棘突,髂棘高點(diǎn)平對(duì)L6椎體,依次標(biāo)記各段腰椎。左手拇指定位 L5、L6橫突末端連線中點(diǎn),右手持針在左手定位點(diǎn)上方約1 cm處與地面水平緩慢進(jìn)針,破皮后針向頭側(cè)略傾斜20°,該點(diǎn)約平對(duì)L4-5椎間盤(pán),即可穿刺到具有韌感的組織,若穿刺針下為堅(jiān)硬的骨性物,此時(shí)可向兔子頭側(cè)或尾側(cè)輕微調(diào)整即可穿刺到具有韌感的椎間盤(pán),穿刺深度約5 mm,停留時(shí)間5 s。再依法穿刺L3-4、L5-6椎間盤(pán),左右各穿刺1次。術(shù)后連續(xù) 3 d肌注青霉素40萬(wàn)U/只。

    1.4 推拿

    造模后第2天,對(duì)推拿組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行為期6周的推拿干預(yù),空白組和模型組不予特殊處理,正常喂養(yǎng)。推拿手法參照成人推拿的臨床經(jīng)驗(yàn)手法,具體方法如下:1)從上往下按揉脊柱兩側(cè)膀胱經(jīng),側(cè)重腰骶部分,約5 min, 操作緩慢滲透,以力透雙側(cè)豎脊肌深層;2)點(diǎn)按雙側(cè)膀胱經(jīng)腎俞、大腸俞、秩邊、環(huán)跳,約2 min;3)順膀胱經(jīng)彈撥脊柱兩側(cè)豎脊肌,約3 min。以上手法的輕重頻率均由專(zhuān)人經(jīng)訓(xùn)練后操作。治療 1 次/d, 10 min/次。

    1.5 標(biāo)本采集

    6 周后,從實(shí)驗(yàn)動(dòng)物耳緣靜脈空氣栓塞處死后,截取第L3至L6腰椎及其間的椎間盤(pán)組織,然后每組隨機(jī)選10個(gè)椎間盤(pán)放入-80°冰箱保存;另外每組隨機(jī)選6個(gè)椎間盤(pán)放入體積分?jǐn)?shù)4%甲醛溶液中固定24 h,預(yù)備做石蠟切片。

    1.6 觀察與檢測(cè)

    1.6.1 動(dòng)物反映綜合評(píng)分 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分別于造模后第1天、第1周、第3周、第6周,依據(jù)其精神情況、進(jìn)食量、運(yùn)動(dòng)量及對(duì)外界刺激的反應(yīng)4項(xiàng)進(jìn)行評(píng)估,參照黑龍等[7]實(shí)驗(yàn)動(dòng)物綜合反映評(píng)分,具體如下:每項(xiàng)正常2分,良好1分,很差0分??偡?分為正常。

    1.6.2 蘇木精-伊紅(HE)染色檢測(cè)椎間盤(pán)組織形態(tài)學(xué)變化 標(biāo)本24 h固定后,然后用新型脫鈣液脫鈣2個(gè)月,脫鈣液更換周期為2~3 d,然后依次梯度酒精進(jìn)行脫水與石蠟包埋,再以4 μm厚度切片,每個(gè)椎間盤(pán)標(biāo)本挑選2片切片,在光鏡下觀察椎間盤(pán)組織形態(tài)學(xué)變化,根據(jù)Han等[8-9]的椎間盤(pán)退變組織學(xué)評(píng)估表評(píng)價(jià)椎間盤(pán)退變程度。從髓核形狀和大小、髓核中細(xì)胞和基質(zhì)構(gòu)成、纖維環(huán)形狀、纖維環(huán)中細(xì)胞的基質(zhì)構(gòu)成、纖維環(huán)和髓核的分界5項(xiàng)進(jìn)行評(píng)分,每項(xiàng)正常計(jì)1分,輕度不規(guī)則計(jì)2分,重度不規(guī)則計(jì)3分??偡?分為正常,15分為嚴(yán)重退變。

    1.6.3 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)法檢測(cè)椎間盤(pán)中TNF-α、IL-6、TGF-β1、CTGF的含量 提取出冰凍的椎間盤(pán)組織,用9倍勻漿介質(zhì)研磨。將研磨液以3 000 r/min,離心半徑5.5 cm,離心10 min,取上清液制作成10%的組織勻漿。然后進(jìn)行BCA定量,配制適量BCA工作液和標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液,并以蒸餾水作為空白對(duì)照,再采用微孔板法計(jì)算樣品的蛋白濃度。然后根據(jù)說(shuō)明書(shū)步驟采用ELISA法檢測(cè)椎間盤(pán)組織中TNF-α、IL-6、TGF-β1、CTGF的含量。

    1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    2 結(jié)果

    2.1 腰椎間盤(pán)退變?cè)炷=馄式Y(jié)果

    白兔腰椎間盤(pán)退變?cè)炷=馄屎螅@示L3至L6的椎間盤(pán)為乳白色的圓柱體,并逐漸增大,位于橫突前上方。且椎間盤(pán)為韌性較強(qiáng)的結(jié)構(gòu),穿刺到椎間盤(pán)時(shí)指下可感到滯澀沉緊感。椎間盤(pán)造模解剖圖如下(圖1)。

    圖1 造模解剖圖

    2.2 動(dòng)物反映綜合評(píng)分

    各測(cè)試時(shí)間點(diǎn)動(dòng)物反映綜合反映評(píng)分的整體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);測(cè)試時(shí)間與動(dòng)物綜合反映評(píng)分的交互作用的整體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);組間比較整體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表 1)。

    表1 各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物綜合反映評(píng)分(分,

    注:數(shù)據(jù)采用重復(fù)測(cè)量方差分析,球形檢驗(yàn)P<0.05;多變量檢驗(yàn)中各測(cè)試時(shí)間點(diǎn)P<0.05,測(cè)試時(shí)間*動(dòng)物綜合反映評(píng)分P<0.05;LSD組間兩兩比較P<0.05

    2.3 各組椎間盤(pán)組織形態(tài)學(xué)評(píng)分

    空白組顯示:椎間盤(pán)中分布大小一致的圓形髓核細(xì)胞,細(xì)胞間基質(zhì)豐富緊密,髓核與纖維環(huán)分界清楚,纖維環(huán)結(jié)構(gòu)完整,排列清晰。模型組顯示:髓核細(xì)胞分布多不均勻,較多髓核細(xì)胞胞質(zhì)疏松或呈空泡狀,排列紊亂,胞核較少;局部纖維環(huán)結(jié)構(gòu)可出現(xiàn)紊亂,排列疏松不規(guī)則;纖維環(huán)和髓核界限多不清晰。推拿組顯示:髓核細(xì)胞分布稍均勻,較多髓核細(xì)胞胞質(zhì)疏松或呈空泡狀,胞核減少;周?chē)w維環(huán)可有紊亂;髓核與纖維環(huán)分界較不清晰。相比空白組的組織形態(tài)學(xué)評(píng)分(5.17±0.41),模型組的組織形態(tài)學(xué)評(píng)分(10.33±2.07)和推拿組的組織形態(tài)學(xué)評(píng)分(9.00±3.46)均明顯增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。推拿組的組織形態(tài)學(xué)評(píng)分略低于模型組,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖2)。

    圖2 椎間盤(pán)組織形態(tài)學(xué)(HE,×200)

    注:A、B:空白組;C、D:模型組;E、F:推拿組

    2.4 各組椎間盤(pán)組織中TNF-α、IL-6、TGF-β1、CTGF表達(dá)比較

    模型組TNF-α、IL-6、TGF-β1、CTGF表達(dá)均高于空白組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),表明穿刺椎間盤(pán)纖維環(huán)的方法促進(jìn)了白兔腰椎間盤(pán)TNF-α、IL-6、TGF-β1、CTGF的表達(dá);推拿組TNF-α、IL-6、TGF-β1、CTGF 表達(dá)均低于模型組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),表明推拿可降低白兔椎間盤(pán)組織中TNF-α、IL-6、TGF-β1、CTGF的表達(dá)(表2)。

    表2 椎間盤(pán)中TNF-α、IL-6、TGF-β1、CTGF表達(dá)比較

    注:對(duì)比空白組,aP<0.05;對(duì)比模型組,bP<0.05

    3 討論

    細(xì)胞因子所誘發(fā)的炎癥反應(yīng)被視為導(dǎo)致椎間盤(pán)退變的因素之一,退變椎間盤(pán)中的髓核細(xì)胞可分泌IL-6、TNF-a等眾多炎癥因子,并對(duì)其產(chǎn)生反應(yīng)[10]。IL-6為炎癥促進(jìn)因子,可刺激炎癥細(xì)胞聚集,破壞蛋白聚糖Ⅱ型膠原的比例,促使髓核中水分丟失,從而加速椎間盤(pán)退變[11]。董振輝等[12]發(fā)現(xiàn),外源性 IL-6 可通過(guò)P38MAPK 和P- JNK/SAPK 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑誘導(dǎo)退變髓核細(xì)胞凋亡。而TNF-α 亦叫做惡質(zhì)素,為重要的炎性因子[13]。TNF-α主要由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞產(chǎn)生,具有多種生物學(xué)活性,可促使血管擴(kuò)張、白細(xì)胞趨化,從而增多吞噬細(xì)胞,釋放內(nèi)毒素,進(jìn)而加重炎癥反應(yīng),TNF-α的分泌量體現(xiàn)了炎癥程度[14]。TNF-α 不僅可活化巨噬細(xì)胞,且可與多種細(xì)胞因子( 如 IL-1,IL-6,IL-8 等) 相互作用,進(jìn)而參加各種免疫反應(yīng)[15]。且TNF-α與神經(jīng)功能有關(guān),可能在神經(jīng)損傷中起主導(dǎo)作用[16]。研究[16-18]表明,IL-6、TNF-α 與椎間盤(pán)退變密切相關(guān),其表達(dá)水平與椎間盤(pán)退變呈正相關(guān)趨勢(shì)。本研究結(jié)果則顯示,模型組、推拿組椎間盤(pán)組織中 IL-6、TNF-α的分泌量明顯高于空白組,推測(cè)IL-6、TNF-α參與椎間盤(pán)的退變;且推拿組分泌量明顯低于模型組,推測(cè)推拿可通過(guò)減少I(mǎi)L-6、TNF-α的分泌量而緩解椎間盤(pán)退變。

    TGF-β1為轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子, 可調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化。且研究[19]顯示,TGF-β1 在退變椎間盤(pán)組織的表達(dá)明顯升高。而TGF-β1的表達(dá)量和腰椎間盤(pán)退行性病變的病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[20]。Tran等[21]證實(shí), TGF -β1 通過(guò) Smad3/AP-1 通路調(diào)節(jié)椎間盤(pán)髓核內(nèi) CTGF 的表達(dá),且退變椎間盤(pán)中的 CTGF 含量比正常者高。有研究[22]顯示,軟骨細(xì)胞中CTGF可促進(jìn)蛋白多糖、Ⅱ型膠原的表達(dá),并促進(jìn)細(xì)胞基質(zhì)合成并抑制凋亡。且研究[23]證實(shí),腰椎間盤(pán)中TGF-β1及TNF-α、IL-6等炎性細(xì)胞因子水平隨著病情加重呈顯著增高趨勢(shì),TGF-β1與TNF-α、IL-6等炎性細(xì)胞因子均呈顯著正相關(guān),同時(shí)TGF-β1與椎間盤(pán)退變程度呈顯著正相關(guān)。本研究結(jié)果顯示,模型組、推拿組椎間盤(pán)組織中TGF-β1、CTCF的分泌量明顯高于空白組,推測(cè) TGF-β1、CTGF參與椎間盤(pán)的退變;且推拿組分泌量明顯低于模型組,推測(cè)推拿組腰椎間盤(pán)退變程度低于模型組。

    綜上所述,本研究證實(shí)了TNF-α、IL-6、TGF-β1、CTGF與腰椎間盤(pán)退變密切相關(guān),且推拿組TNF-α、IL-6、TGF-β1、CTGF的分泌量均降低,推測(cè)推拿可減緩腰椎間盤(pán)退變,且TNF-α、IL-6、TGF-β1、CTGF的分泌量可能與椎間盤(pán)退變程度呈正相關(guān)。而推拿作用機(jī)理可能與抑制炎癥反應(yīng),降低TNF-α、IL-6、TGF-β1、CTGF含量相關(guān)。上述因子的檢測(cè)對(duì)推拿治療腰椎間盤(pán)退行性疾病有著重要的意義,但細(xì)胞因子間的相互作用對(duì)腰椎間盤(pán)退變的影響仍需進(jìn)一步研究。

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