載脂蛋白E檢測(cè)在病理科的應(yīng)用與指導(dǎo)意義

聶艷絨，杜桂清，王秋紅，鄧桂霞，喬婷婷，馬丹琦

北京京煤集團(tuán)總醫(yī)院 （北京 102300）

載脂蛋白E（apolipoprotein E，ApoE）是一種富含精氨酸的堿性蛋白，在脂蛋白轉(zhuǎn)化和代謝中起著重要作用。人體ApoE是由299個(gè)氨基酸殘基組成，主要于血液的乳糜微粒（chylomicron, CM）及其殘骸、極低密度脂蛋白（very low density lipoproteins, VLDL）及其殘粒、中間密度脂蛋白（intermediate density lipoproteins, IDL）和部分高密度脂蛋白（high density lipoproteins, HDL）中存在[1-2]。其是LDL受體的配基,也是肝細(xì)胞膜CM及VLDL殘骸受體的配基,在肝臟代謝中起重要作用,參與脂質(zhì)的運(yùn)輸、儲(chǔ)存及排泄,有修復(fù)組織和調(diào)節(jié)免疫等作用。研究表明, ApoE基因型別與人體高脂血癥、肝病、冠心病及壽命長短等有關(guān)[3-5]。

1 病理科引入ApoE檢測(cè)的意義

病理科是大型綜合醫(yī)院必備的科室，主要任務(wù)是在醫(yī)療過程中承擔(dān)病理診斷工作，其診斷報(bào)告是明確的疾病而非影像描述，因此臨床醫(yī)師能根據(jù)病理報(bào)告決定診療原則、解釋臨床癥狀和明確死因。與其他診斷手段如B超、電子計(jì)算機(jī)斷層掃描（computed tomography，CT）及常規(guī)放射檢查相比，是醫(yī)學(xué)界公認(rèn)最可信賴、準(zhǔn)確性最高的診斷手段。傳統(tǒng)的病理檢查有活體組織、術(shù)中冰凍切片、免疫組織化學(xué)、特殊染色、免疫熒光等，可為臨床提供明確的病理診斷，確定疾病性質(zhì)[6]。但這也使得病理科的主要職責(zé)和能力局限在了為臨床確診提供直接依據(jù)，而無法為未發(fā)病狀態(tài)和未來情況提供診療依據(jù)和參考。通過將ApoE基因型檢測(cè)引進(jìn)病理科室日常檢測(cè)范圍，加深了病理科的檢測(cè)范圍及其提供的診療依據(jù)廣度。

2 ApoE基因型檢測(cè)方法與指導(dǎo)意義

ApoE基因型檢測(cè)法是通過核酸提取與純化和基因芯片法進(jìn)行定性檢測(cè)、評(píng)定和分析。

2.1 核酸提取與純化

提取與純化原理：通過專用的試劑，選擇性地分離全血中的紅細(xì)胞與白細(xì)胞，并通過離心方式將目的細(xì)胞沉淀，并將紅細(xì)胞及其他細(xì)胞成分碎片等雜質(zhì)留在清液中去除，獲得的目的細(xì)胞再進(jìn)行細(xì)胞裂解、純化并釋放核酸，從而達(dá)到提取基因組核酸的目的。

2.1.1 儀器

采用1.5 ml離心孔徑高速離心機(jī)。

2.1.2 樣本要求

（1）適用樣本類型：全血樣本；（2）樣本采集：用乙二胺四乙酸抗凝采血管進(jìn)行血樣采集，切勿使用肝素抗凝血；（3）樣本保存及運(yùn)輸：經(jīng)上述處理后的待測(cè)樣本可立即用于處理，或（-20±5）℃保存（3個(gè)月）。應(yīng)避免反復(fù)凍融，減少溶血。樣本運(yùn)送采用冰壺加冰或泡沫箱密封進(jìn)行運(yùn)輸，短時(shí)間（3 d之內(nèi)）常溫運(yùn)輸，有可能對(duì)核酸產(chǎn)生一定影響。

2.1.3 提取與純化方法

（1）在1.5 ml離心管中加入200 μl提取液Ⅰ，充分混勻血樣后，取20 μl血樣，貼壁加至離心管中，渦旋或者其他方式充分混勻15 s。（2）將1 500×g離心5 min，為了便于后續(xù)的操作，離心時(shí)離心管放置開蓋方向朝向軸心。（3）倒棄上層液體，留下約20 μl沉淀，操作時(shí)切勿讓沉淀流走，否則將導(dǎo)致整個(gè)實(shí)驗(yàn)失敗。各別血液沉淀顏色較淺，透過光線肉眼可見為一層較薄的灰白色貼壁細(xì)胞，倒棄液體操作時(shí)按開蓋口方向進(jìn)行。（4）加入60 μl提取液Ⅱ。渦旋振蕩20 s以上，直至看不到沉淀。充分震蕩混勻是關(guān)鍵，否則將導(dǎo)致整個(gè)實(shí)驗(yàn)失敗。（5）在70 ℃下反應(yīng)10～20 min。（6）在100 ℃下反應(yīng)10 min，防爆蓋。溫度和時(shí)間是影響其后聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增效率的重要影響因素之一，要嚴(yán)格遵守操作規(guī)范。（7）將12 000×g離心5 min。DNA在上清中，擴(kuò)增加樣時(shí)取上清，提取后的DNA保存于2～8 ℃，并于24 h內(nèi)使用。最終得到純度合格的核酸樣本，用于后續(xù)基因型檢測(cè)。

2.2 基因芯片法

檢驗(yàn)原理：采用PCR技術(shù)擴(kuò)增的特定基因片段，再與芯片上特異性核酸探針雜交以檢測(cè)特定的基因位點(diǎn)的序列，使基因芯片雜交信號(hào)放大至肉眼判讀的水平，應(yīng)用基因型檢測(cè)試劑盒，可準(zhǔn)確的檢測(cè)出ApoE基因112位點(diǎn)和158位點(diǎn)的基因類型，并結(jié)合基因芯片攝像儀，使結(jié)果易于判讀和更客觀。

2.2.1 儀器

采用PCR擴(kuò)增儀，基因芯片攝像儀。

2.2.2 檢驗(yàn)方法

包括樣品處理、目的片段的PCR擴(kuò)增、基因芯片檢測(cè)等過程。

2.2.3 基因芯片檢測(cè)

（1）分別將洗滌液A、B用雙蒸水稀釋，均可放在15 ℃以上室溫下存放。（2）將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物99 ℃加熱5 min，迅速置于冰浴中5 min。（3）取10 μl上述冰浴中PCR擴(kuò)增產(chǎn)物至50～60 μl直用型雜交液中，混勻；揭開芯片保護(hù)膜，將上液加入基因芯片孔中，覆蓋芯片表面。（4）加樣后的芯片在（55±1.5）℃水浴60 min，然后在室溫下放置5 min，使其冷卻至室溫。（5）用預(yù)熱至（55±0.5）℃的稀釋洗滌液A浸泡芯片2 min，最后用空氣將芯片表面液滴吹凈或離心甩干，一定要迅速將表面液滴吹凈。（6）取直用型BW反應(yīng)液60～70 μl覆蓋于芯片表面，并在常溫下反應(yīng)15 min。（7）用稀釋洗滌液B洗滌芯片3次，用潔凈空氣吹凈或離心甩干芯片表面。（8）將直用型顯色液1～2滴滴加在干燥的芯片表面，并使其覆蓋全片，避光常溫下反應(yīng)10 min。（9）用稀釋洗滌液B迅速?zèng)_洗芯片3次，用潔凈空氣吹凈或離心甩干芯片表面，應(yīng)用芯片自動(dòng)分析報(bào)告系統(tǒng)進(jìn)行判讀或數(shù)碼照相后自行判讀。

3 結(jié)果

檢測(cè)內(nèi)容：同時(shí)檢測(cè)ApoE基因6個(gè)型別（E2/E2，E3/E3，E4/E4，E2/E3，E2/E4，E3/E4），最終進(jìn)行檢測(cè)數(shù)值判定。

檢驗(yàn)結(jié)果解釋：對(duì)ApoE基因6個(gè)型別的檢驗(yàn)結(jié)果歸為3大類，為ApoE2、ApoE3和ApoE4。其中ApoE2類型人群患老年癡呆、冠心病、腦梗死等疾病的風(fēng)險(xiǎn)較低，服用阿托伐他汀、普伐他汀等藥品效果較好；ApoE3類型人群患老年癡呆風(fēng)險(xiǎn)略高，患心腦血管疾病風(fēng)險(xiǎn)較低，大量煙酒會(huì)增加冠心病的患病風(fēng)險(xiǎn)；ApoE4類型人群患冠心病、心肌梗死等疾病風(fēng)險(xiǎn)較高，服用辛伐他汀、普羅補(bǔ)考等藥品效果較好。詳見表1。

4 展望

通過ApoE基因型檢測(cè)技術(shù)，能從深層次的基因角度出發(fā)，為診療者提供更科學(xué)和更有前瞻性的診療與指導(dǎo)。ApoE基因型檢測(cè)在病理科的應(yīng)用，能夠進(jìn)一步凸顯和提高病理科在大型綜合醫(yī)院中的作用，對(duì)病理科的提升有著重大意義。

表1 ApoE分型及指導(dǎo)意見