探討線栓法建立大鼠局灶性腦缺血模型的影響因素

袁洪霞 石國鳳 閆 冰 張真容 劉小亮

貴陽中醫(yī)學(xué)院，貴州省貴陽市 550002

腦血管病的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，其中缺血性腦血管病占80%以上，給患者及家庭乃至整個(gè)社會(huì)造成巨大的負(fù)擔(dān)[1]。因此，對于研究缺血性腦卒中病理機(jī)制及治療評價(jià)的研究具有重要價(jià)值，線栓法制作局灶性腦缺血模型(MCAO)是目前較為公認(rèn)且比較經(jīng)典的模型[2]，而且線栓法制備MCAO具有無需開顱、創(chuàng)傷小、不需要特殊設(shè)備、缺血區(qū)部位較恒定等特點(diǎn)[3]，但線栓法仍存在手術(shù)操作復(fù)雜、死亡率高等問題[4]。本文探討造模環(huán)境溫度控制、線栓插入部位以及術(shù)后2h內(nèi)大鼠蘇醒活躍狀態(tài)對造模的影響，以此來減少手術(shù)復(fù)雜性，提高模型的穩(wěn)定性和造模的成功率。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 由第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXK：2012001]提供清潔級雄性SD大鼠60只，體重為150～200g，于貴陽中醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)2周，自由飲食，術(shù)前禁食12h，不禁水，待大鼠體重達(dá)200～300g開始于貴陽中醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室實(shí)施造模。分組：將60只大鼠隨機(jī)抽分成四組，即對照組1(15只)，對照組2(15只)，對照組3(15只)，實(shí)驗(yàn)組(15只)。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均取得貴陽中醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法 對照組1在夏季自然未控制外環(huán)境溫度(30℃以上)下實(shí)施手術(shù)，線栓從頸總動(dòng)脈插入，并且術(shù)后2h內(nèi)大鼠均處于麻醉未清醒狀態(tài)；對照組2的大鼠線栓從頸外動(dòng)脈插入，外環(huán)境溫度控制在(25±1)℃，并且術(shù)后2h內(nèi)大鼠均處于麻醉未清醒狀態(tài)；對照組3的大鼠術(shù)后2h內(nèi)大鼠均處于麻醉清醒活躍狀態(tài)，線栓從頸總動(dòng)脈插入，外環(huán)境溫度控制在(25±1)℃；實(shí)驗(yàn)組大鼠線栓從頸總動(dòng)脈插入，外環(huán)境溫度控制在(25±1)℃并且術(shù)后2h內(nèi)大鼠均處于麻醉未清醒狀態(tài)。

1.3 線栓的制作 先將直徑為0.26mm的尼龍魚線(德國進(jìn)口原絲，拉力、抗節(jié)力≥日本原絲130%)從斷面平剪切成長度為5.0cm的線栓，然后將剪好的線栓一端距離火焰約1cm處旋轉(zhuǎn)線栓并將其頭端燒制成光滑球形并蘸融化的液體石蠟，垂直待干，顯微鏡下篩選表面光滑均勻、頭端的直徑約(0.34±2)mm的栓線，用黑色標(biāo)記筆分別在頭端、距頭端18mm處、距頭端20mm處和25mm處作標(biāo)記待干，然后放置在75%酒精清潔后浸泡于無菌生理鹽水中備用。

1.4 模型制作 用濃度為7%的水合氯醛按0.5ml/100g量從腹腔注射麻醉大鼠，仰臥于固定臺(tái)上，頭朝向手術(shù)者，頸部正中備皮約3cm×3cm，用酒精消毒，沿頸部正中縱行切開1.5～2.0cm的切口，用玻璃分針鈍性分離周圍結(jié)締組織和肌肉，用自制消毒處理后的彎鉤撐開兩側(cè)肌肉組織暴露手術(shù)視野，游離右側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)和頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)即可，然后在頸總動(dòng)脈上分別結(jié)扎縫線，在距分叉約5mm處結(jié)扎松、3mm處結(jié)扎緊，在松緊結(jié)之間做V型切口，然后從切口處插入已備好的線栓，有頭端的先進(jìn)入，將線栓插入到分叉處時(shí)垂直提取頸總動(dòng)脈殘端并與頸內(nèi)動(dòng)脈入口成同一直線并順利進(jìn)入頸內(nèi)動(dòng)脈[該法不易誤入翼腭動(dòng)脈(PPA)]，繼續(xù)向內(nèi)進(jìn)線栓，當(dāng)線栓插入從分叉處估量約10mm有阻礙時(shí)，不能盲目再向前用力插及盲目的反復(fù)退、進(jìn)，這些都易導(dǎo)致線栓插破大腦中動(dòng)脈，造成蛛網(wǎng)膜下腔出血，正確的順利插入的方法是先將線栓退大約5mm，然后將線栓向外轉(zhuǎn)20°～30°的方向，并將線栓由垂直轉(zhuǎn)換成與操作臺(tái)平行略下，再向前插入直至再次有阻礙從分叉處算起，插入線栓長度為18～22mm，然后將線栓留置2h后拔出線栓并縫合。

1.5 判斷其模型成功的標(biāo)志 Zea-Longa評分：待手術(shù)24h后采用Zea-Longa的5級4分法對模型進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評分[5]:0 分為無神經(jīng)功能缺失癥狀，活動(dòng)正常；1分為不能完全伸展對側(cè)前肢；2分為行走時(shí)身體向偏癱側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分為行走時(shí)向偏癱側(cè)傾倒；4分為不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失。將評分1～3分大鼠為MCAO模型。眼球顏色[6]：右側(cè)缺血側(cè)眼球小且發(fā)暗灰白有時(shí)伴有一定的分泌物, 左側(cè)與健康大鼠的眼球基本一致。TTC染色：將完整的大腦取出放于-20℃冰箱20min后取出在冰盒上將整個(gè)腦冠狀切成約2mm厚的薄片5片，將5片薄片放入濃度為1%TTC染液中(PBS配制，注意避光)，37℃染30min。觀察腦梗死大鼠梗死部分呈蒼白色，健康大鼠及假手術(shù)大鼠為均勻紅色，無梗死灶。

2 結(jié)果

對照組1在高溫環(huán)境下手術(shù)死亡數(shù)量與實(shí)驗(yàn)組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.107>0.05)；對照組2線栓從頸外動(dòng)脈插入死亡數(shù)量與實(shí)驗(yàn)組比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.025<0.05)；對照組3術(shù)中、術(shù)后2h內(nèi)老鼠處于蘇醒活躍狀態(tài)死亡數(shù)量與實(shí)驗(yàn)組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.021<0.05)。見表1。

表1 四組大鼠死亡數(shù)(只)及死亡率

3 討論

雖然本研究通過統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)在非控制外環(huán)境溫度(30℃以上)與溫度控制在(25±1)℃進(jìn)行造模差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但從數(shù)據(jù)上看，在夏季溫度高的環(huán)境下造模死亡數(shù)還是較高，本研究的該數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果無意義，可能是因?yàn)楸窘M的大鼠數(shù)量不夠。但是，仍然有研究報(bào)道指出高溫環(huán)境下會(huì)造成機(jī)體免疫功能、呼吸系統(tǒng)、水電解質(zhì)平衡、神經(jīng)內(nèi)分泌、血流動(dòng)力學(xué)、能量代謝等系統(tǒng)和器官功能改變[7]，因此嚴(yán)格將術(shù)中室內(nèi)溫度控制在適宜范圍內(nèi)能減少大鼠術(shù)中、術(shù)后的損害。但高溫環(huán)境下對造模成功率的影響還需要進(jìn)一步研究確定。

進(jìn)線栓部位常見有三處，頸總動(dòng)脈(CCA)、頸外動(dòng)脈(ECA)及頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)，多數(shù)研究者主要從頸總動(dòng)脈[8]、頸外動(dòng)脈[9]進(jìn)線栓經(jīng)頸內(nèi)動(dòng)脈到大腦中動(dòng)脈并阻斷該處血流，少部分研究者從頸內(nèi)動(dòng)脈入線栓[10]。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果和過程進(jìn)行分析，從頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈入線栓各自的優(yōu)缺點(diǎn):從頸總動(dòng)脈入線栓，直接分離出頸總動(dòng)脈及頸內(nèi)動(dòng)脈即可，具有易操作、創(chuàng)傷性小、操作時(shí)間快、進(jìn)線栓快、進(jìn)線栓順利、缺血模型持久以及存活率高等優(yōu)點(diǎn)，缺點(diǎn)就是結(jié)扎一側(cè)頸總動(dòng)脈后再灌注的實(shí)現(xiàn)需要另一側(cè)頸總動(dòng)脈供血；從頸外動(dòng)脈入線栓，需要分離頸總動(dòng)脈、分叉處、頸外動(dòng)脈及頸內(nèi)動(dòng)脈，從該處入線栓操作時(shí)間長、創(chuàng)傷性大、線栓不易順利插入到大腦中動(dòng)脈并易插入到翼腭動(dòng)脈,并且會(huì)因手術(shù)過程中的過度牽拉和手術(shù)時(shí)間延長易致大鼠死亡，但從頸外動(dòng)脈插入是結(jié)扎的頸外動(dòng)脈，不結(jié)扎頸總動(dòng)脈，恢復(fù)再灌注仍然由該側(cè)的頸總動(dòng)脈供血實(shí)現(xiàn)。

拔線栓時(shí)和縫合到未蘇醒這一過程中的細(xì)節(jié)不容忽視，這些問題在很大程度上影響大鼠術(shù)后的存活率。拔線栓時(shí)禁忌老鼠處于蘇醒狀態(tài)，在手術(shù)過程中和留置線栓過程中一定要隨時(shí)觀察大鼠的角膜反射并多次少量補(bǔ)麻醉藥，研究過程中采取每隔30min根據(jù)角膜反射相應(yīng)的補(bǔ)充首次麻藥量的1/5～1/4，目的是為了拔線栓和縫合時(shí)老鼠處于麻醉未蘇醒狀態(tài)，首先有利于手術(shù)的順利操作，其次能降低術(shù)后死亡率。大鼠蘇醒狀態(tài)時(shí)實(shí)施拔線栓及縫合，大鼠應(yīng)激和疼痛反應(yīng)較大，就會(huì)做出本能的過強(qiáng)的應(yīng)激性反應(yīng)，比如翻身逃跑等，也就是大鼠剛在缺血再灌注過程進(jìn)行了被動(dòng)及主動(dòng)活動(dòng)行為，排除其他死亡原因24h內(nèi)大鼠死亡率較高，因此在進(jìn)行缺血再灌注未蘇醒前，仍然要注意不能進(jìn)行過多的搬動(dòng)老鼠及出現(xiàn)大鼠主動(dòng)活動(dòng)。

線栓法是大量研究者常用的建立大鼠局灶性腦缺血模型方法[11]，該模型被普遍認(rèn)為是腦缺血標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物模型[12]，但會(huì)因?yàn)樵谛g(shù)中術(shù)后各種因素的影響而影響造模的成功率，本研究主要從環(huán)境溫度高低、入線栓部位以及拔線栓時(shí)的注意問題和2h內(nèi)大鼠是否處于麻醉未清醒狀態(tài)對造模的影響進(jìn)行分析，選擇最佳的造模條件和環(huán)境，提高造模的成功率，減少手術(shù)時(shí)間和創(chuàng)傷程度。影響該手術(shù)因素還有很多，如麻醉藥的選擇和線栓材質(zhì)的選擇方面，需要在實(shí)驗(yàn)過程中注意控制好每一個(gè)影響成功率導(dǎo)致失敗的因素，只有不斷的進(jìn)行實(shí)踐研究與改進(jìn)，才能使該精細(xì)手術(shù)的影響因素降到最低，從而制備出標(biāo)準(zhǔn)的、存活率高、穩(wěn)定性好、重復(fù)性好、成功率高的理想大鼠局灶性腦缺血再灌注模型。