葡萄糖3-脫氫酶工程菌的構(gòu)建、表達(dá)及其合成3-酮對(duì)硝基苯井岡霉胺

張建芬，柯 薇，陳 虹

(浙江樹人大學(xué) 生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江 杭州 310015)

3-酮糖類化合物含有特殊羰基基團(tuán)，是一種重要的合成砌塊，可作為先導(dǎo)化合物，用于選擇性合成氨基糖抗體、去垢劑、糖聚合體、食品添加劑和抗氧化劑等，具有廣泛的應(yīng)用前景[1]。糖分子含有多個(gè)功能相近的羥基，以此為原料，通過化學(xué)反應(yīng)選擇性合成3-酮糖類化合物難度較大，涉及多步的基團(tuán)保護(hù)和去保護(hù)反應(yīng)，而且污染大、能耗高。葡萄糖3-脫氫酶(glucoside 3-dehydrogenase,G3DH，EC.1.1.99.13)是1種以黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)為輔酶的新型氧化還原酶，能氧化吡喃糖上的C-3羥基為酮基[2]。G3DH在3-酮糖類化合物的生物合成中起著重要的作用。目前報(bào)道的能生產(chǎn)G3DH的微生物較少，主要有Agrobacteriumtumefaciens[3]、Flavobacteriumsaccharophilum[4]、Halomonas(Deleya)sp.A-15[5]、Cytophagemarinoflava[6]、Agaricusbisporus[7]、Stenotrophomonasmaltrophi-lia[8]和Sphingobacteriumfaecium[9]等，而且，已篩選到的G3DH的酶活性普遍不高，離滿足工業(yè)生產(chǎn)的實(shí)際需求還有一段距離。開發(fā)經(jīng)濟(jì)高效的基因工程菌株，可解決自然進(jìn)化的酶催化效率低、副產(chǎn)物多等問題，可以有效地提高生物催化劑的性能。目前，有關(guān)基因克隆G3DH的研究報(bào)道較少，僅有來自A.tumefaciens[10]和Halomonas[11]的G3DHs實(shí)現(xiàn)了在E.coli中的表達(dá)，而且活力較低或者表達(dá)量不高。自然界中蘊(yùn)藏著豐富的未被發(fā)掘的新型酶資源，隨著DNA測(cè)序技術(shù)的發(fā)展和成本的降低，大量微生物基因組信息先后被測(cè)定和公開?；蛲诰蚣夹g(shù)可以從基因組數(shù)據(jù)庫快速發(fā)現(xiàn)新的有價(jià)值的酶，進(jìn)一步豐富可被利用或改造的酶資源[12]，已吸引了廣大科研工作者的關(guān)注。因此，基因挖掘新的G3DH酶資源，對(duì)于提高G3DH的催化反應(yīng)效率、拓寬G3DH的應(yīng)用范圍具有重要意義。

3-酮對(duì)硝基苯井岡霉胺是3-酮井岡羥胺A C-N裂解酶的酶反應(yīng)底物，3-酮井岡羥胺A C-N裂解酶是酶解井岡霉素制備井岡胺等糖苷酶抑制劑的關(guān)鍵酶之一，具有重要的研究應(yīng)用價(jià)值。3-酮對(duì)硝基苯井岡霉胺可通過G3DH生物轉(zhuǎn)化來制備。Takeuchi等[4]利用F.saccharophilum提取的粗酶液膜蛋白部分轉(zhuǎn)化，得到了3-酮對(duì)硝基苯井岡霉胺，作為C-N裂解酶的底物。但是用酶液轉(zhuǎn)化生產(chǎn)存在著酶液制備費(fèi)時(shí)費(fèi)力，收率低等缺點(diǎn)。項(xiàng)目組前期用S.maltrophilia細(xì)胞轉(zhuǎn)化制備3-酮對(duì)硝基苯井岡霉胺[13]，由于野生菌株同時(shí)含有3-酮對(duì)硝基苯井岡霉胺裂解酶，會(huì)有副產(chǎn)物對(duì)硝基苯胺產(chǎn)生，使3-酮對(duì)硝基苯井岡霉胺產(chǎn)率下降，也會(huì)導(dǎo)致后續(xù)產(chǎn)物分離麻煩。隨后，項(xiàng)目組克隆了來自Sphingobacteriumfaecium的G3DH，并用于3-酮對(duì)硝基苯井岡霉胺的細(xì)胞轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)[14]。盡管G3DH在合成中的應(yīng)用前景不可忽視，目前所報(bào)道的G3DH酶種類非常有限，基因組挖掘這一方法可以快速發(fā)現(xiàn)新的有價(jià)值的G3DH。

本研究中，筆者通過基因挖掘的方法表達(dá)1種來自Glaciecolapolaris的G3DH，并優(yōu)化其表達(dá)條件，并且用此重組G3DH工程菌細(xì)胞轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)3-酮對(duì)硝基苯井岡霉胺。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒及引物

大腸桿菌(E.coli)DH5α和E.coliBL21(DE3)，Novagen公司，克隆質(zhì)粒pMD19-T、表達(dá)質(zhì)粒pET-28(b)，Takara公司。所需引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 主要試劑和儀器

PCR所用試劑，TaKaRa公司；限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶，F(xiàn)ermentas公司；低分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白、感受態(tài)細(xì)胞制備試劑盒，上海生工生物工程有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒、PCR產(chǎn)物回收試劑盒、膠回收試劑盒、細(xì)菌基因組提取試劑盒，Axygen公司。Bradford蛋白濃度試劑盒，南京建成公司。蛋白胨和酵母粉，OXOID公司。對(duì)硝基苯井岡霉胺為實(shí)驗(yàn)室合成，參照文獻(xiàn)[13]的方法。其他試劑均為市售分析純。

酶標(biāo)儀、蛋白純化儀和鎳離子親和層析柱，美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 基因挖掘

在NCBI的“protein”數(shù)據(jù)庫中，以“glucose 3-dehydrogenase”或“glucoside 3-dehydrogenase”為檢索詞，得到多條不同來源的G3DH序列。采用Clustal W進(jìn)行G3DH的多序列比對(duì)，分析G3DH的保守序列。在ExPASy的ProtParam上，計(jì)算G3DH的理論理化特性，排除預(yù)測(cè)可溶性低的，確定1種來自Glaciecolapolaris的G3DH(命名為GpG3DH)為研究對(duì)象。通過jcat對(duì)GpG3DH的基因序列進(jìn)行了在E.coli中表達(dá)的密碼子優(yōu)化。在GpG3DH基因兩端加上NcoⅠ和XhoⅠ的限制酶識(shí)別位點(diǎn)后，由上海生工生物工程有限公司合成。

1.4 工程菌的構(gòu)建

用NcoⅠ和XhoⅠ酶切處理質(zhì)粒pET-28(b)和GpG3DH，膠回收載體和GpG3DH基因酶切產(chǎn)物，在16 ℃下，T4 DNA連接酶連接過夜，轉(zhuǎn)化到E.coliBL21(DE3)中，轉(zhuǎn)化子經(jīng)菌落PCR驗(yàn)證和測(cè)序驗(yàn)證后，獲得陽性重組菌株E．coliBL21/pET28b-GpG3DH。

1.5 重組酶的表達(dá)純化

將工程菌接種于5 mL含50 μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)過夜。取1 mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接于100 mL含50 μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600為0.8時(shí)，向培養(yǎng)物中加IPTG至終濃度為0.1 mmol/L，于16 ℃誘導(dǎo)表達(dá)12 h，4 ℃、4 000g離心10 min，收集菌體，并用生理鹽水洗滌2次。稱取10 g濕菌體，加入20 mL 0.1 mol/L Tris-HCl(pH 8.0)緩沖液懸浮細(xì)胞，于冰浴中進(jìn)行超聲波細(xì)胞破碎(工作2 s，間隔5 s，工作時(shí)間20 min)。4 ℃、8 000g離心30 min，收集上清液作為粗酶液。粗酶液用0.22 μm的濾膜過濾后，利用鎳離子層析柱(Bio-Rad，20 mL)對(duì)粗酶液進(jìn)行一步純化，純化的酶液經(jīng)超濾脫鹽后用于酶活力測(cè)定。

1.6 酶活力測(cè)定

在比色皿中加入2.6 mL pH 6.0的0.1 mmol/L的磷酸鹽緩沖液，0.1 mL 0.1 mol/L的葡萄糖溶液，0.2 mL 0.4 mmol/L的2，6-二氯酚靛酚溶液，0.1 mL適當(dāng)稀釋的酶液，混勻。以蒸餾水做空白調(diào)零，在600 nm下測(cè)吸光度減少值。每隔30 s測(cè)定，直至3 min。

G3DH酶活力單位定義：1個(gè)酶活力單位(U)相當(dāng)于在上述條件下，于25 ℃、pH 6.0條件下，1 min還原1 μmol 2,6-二氯酚靛酚所需的酶量。

圖2 重組酶的表達(dá)條件優(yōu)化Fig.2 Optimization of expression conditions of recombinant enzyme

1.7 3-酮對(duì)硝基苯井岡霉胺的細(xì)胞轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)

在50 mL的小三角瓶中，加入25 mg干質(zhì)量的菌體，10 mL 50 mmol/L的磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)，充分混合后，加入2 mL 50 mmol/L對(duì)硝基苯井岡霉胺，在30 ℃、100 r/min水浴搖床中開始反應(yīng)。每隔一段時(shí)間，取出0.5 mL用于檢測(cè)3-酮對(duì)硝基苯井岡霉胺的含量。

1.8 底物和產(chǎn)物的分析方法

對(duì)硝基苯井岡霉胺、3-酮對(duì)硝基苯井岡霉胺和對(duì)硝基苯胺的濃度用高效液相色譜法(HPLC)分析。細(xì)胞轉(zhuǎn)化液經(jīng)12 000 r/min離心10 min后，上清液用0.22 μm的濾膜過濾后，經(jīng)高效液相色譜分析，采用的是C18反相柱，25%的乙腈水溶液作為流動(dòng)相，流速為1 mL/min，在398 nm下紫外檢測(cè)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 表達(dá)質(zhì)粒pET28b-GpG3DH的構(gòu)建

構(gòu)建所得重組質(zhì)粒pET28b-GpG3DH，經(jīng)NcoⅠ和XhoⅠ酶切后，結(jié)果見圖1。由圖1可知，重組質(zhì)粒中含有目的條帶，約1.68 kb，與預(yù)測(cè)一致。質(zhì)粒測(cè)序驗(yàn)證正確，說明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

M—標(biāo)準(zhǔn)DNA; 1—酶切質(zhì)粒DNA圖1 重組質(zhì)粒pET28b-GpG3DH雙酶切電泳圖Fig.1 Electrophoresis of double digests of recombinantplasmid pET28b-GpG3DH

2.2 重組酶的表達(dá)條件優(yōu)化

在不同的培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基和TB培養(yǎng)基)下，分別加入終濃度為0.10、0.50和1.00 mmol/L的IPTG，16 ℃下誘導(dǎo)表達(dá)16 h。每隔2 h取樣分析，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，相對(duì)于LB培養(yǎng)基，在TB培養(yǎng)基下培養(yǎng)，重組酶的活力更高。此外，IPTG的用量為0.1～1.0 mmol/L時(shí)，重組酶的活力影響不大。因此，確定最佳的GpG3DH表達(dá)條件:37 ℃培養(yǎng)至OD600為0.8時(shí)，加入IPTG至終濃度為0.5 mmol/L，16 ℃誘導(dǎo)表達(dá)10 h。在此條件下，GpG3DH的酶活力達(dá)到2.83×10-2U/mL。酶活力比已發(fā)現(xiàn)的G3DH略低[3-9]，后續(xù)可以通過定向進(jìn)化等分子改造手段提高GpG3DH酶活力。

2.3 基因GpG3DH的表達(dá)結(jié)果

葡萄糖3-脫氫酶基因GpG3DH的表達(dá)情況不好，優(yōu)化表達(dá)條件并沒有大幅度增加GpG3DH的可溶表達(dá)，表達(dá)結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，G3DH的分子量為5.5×104。據(jù)報(bào)道，已發(fā)現(xiàn)的G3DH的分子量在5.5×104～6.8×104[3-9]，GpG3DH的分子量與文獻(xiàn)[3-9]報(bào)道一致。于是GpG3DH的催化反應(yīng)采用E.coilBL21/pET28b-GpG3DH全細(xì)胞反應(yīng)體系。

1,4—對(duì)照實(shí)驗(yàn)(不加IPTG誘導(dǎo))；2—菌體破碎液的上清；3—菌體破碎液的沉淀；M為標(biāo)準(zhǔn)蛋白圖3 GpG3DH的SDS-PAGE電泳Fig.3 SDS-PAGE electrophoresis of GpG3DH expression

2.4 3-酮對(duì)硝基苯井岡霉胺的細(xì)胞轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)

采用重組菌細(xì)胞轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)3-酮對(duì)硝基苯井岡霉胺。3-酮對(duì)硝基苯井岡霉胺的產(chǎn)率Y3-KpNPV用式(1)定義。

Y3-KpNPV=C3-KpNPV/CpNPV,0

(1)

式中：C3-KpNPV表示表示任一時(shí)段3-酮對(duì)硝基苯井岡霉胺的濃度。

將菌體在不同濃度EDTA(1、5、10、15、20和40 mmol/L)的細(xì)胞轉(zhuǎn)化體系下反應(yīng)。24 h后檢測(cè)對(duì)硝基苯井岡霉胺以及3-酮對(duì)硝基苯井岡霉胺的含量，結(jié)果如圖4所示。

圖4 EDTA濃度對(duì)3-酮對(duì)硝基苯井岡霉胺生成的影響Fig.4 Effect of EDTA concentration onN-p-nitrophenyl-3-ketovalidamine

從圖4可以看出，隨著EDTA濃度的增加，3-酮對(duì)硝基苯井岡霉胺的產(chǎn)率逐漸增加?？梢姡肊DTA處理細(xì)胞，能使目標(biāo)產(chǎn)物3-酮對(duì)硝基苯井岡霉胺的產(chǎn)率大大增加。據(jù)文獻(xiàn)[13-14]報(bào)道及前期的研究結(jié)果，用EDTA處理細(xì)胞，能提高G3DH催化糖及其衍生物的轉(zhuǎn)化率，降低副產(chǎn)物的產(chǎn)率。對(duì)于天然酶，EDTA還能抑制Ca2+依賴的3-酮對(duì)硝基苯井岡霉胺降解酶活性。本文的研究結(jié)果與前期研究結(jié)果[13]一致。重組菌E.coilBL21/pET28b-GpG3DH雖不含3-酮對(duì)硝基苯井岡霉胺降解酶，但是，EDTA能夠去除外膜蛋白的脂多糖，使得細(xì)胞膜的通透性增加[4]。細(xì)胞經(jīng)EDTA處理后，生成的中間產(chǎn)物3-酮對(duì)硝基苯井岡霉胺容易及時(shí)地到達(dá)外環(huán)境，這樣就使得被裂解為對(duì)硝基苯胺的幾率大大降低。當(dāng)EDTA濃度大于10 mmol/L時(shí)，3-酮對(duì)硝基苯井岡霉胺的產(chǎn)率有所下降，其原因可能是高濃度的EDTA存在對(duì)酶有抑制作用。因此，確定細(xì)胞轉(zhuǎn)化體系中，最佳的EDTA用量為10 mmol/L。

考察不同的pH條件下，對(duì)硝基苯井岡霉胺轉(zhuǎn)化為3-酮對(duì)硝基苯井岡霉胺的產(chǎn)率。菌體先用10 mmol/L EDTA 處理，在30 ℃、100 r/min條件下轉(zhuǎn)化 24 h，結(jié)果見圖5。

圖5 pH對(duì)3-酮對(duì)硝基苯井岡霉胺合成的影響Fig.5 Effect of pH on N-p-nitrophenyl-3-ketovalidamine

從圖5可以看出，在pH 7.5時(shí)，3-酮對(duì)硝基苯井岡霉胺的產(chǎn)率最高。因此，確定細(xì)胞轉(zhuǎn)化體系中，pH為7.5。

考察不同的溫度(20、25、30 ℃)下，對(duì)硝基苯井岡霉胺轉(zhuǎn)化為3-酮對(duì)硝基苯井岡霉胺的產(chǎn)率。以對(duì)硝基苯井岡霉胺和3-酮對(duì)硝基苯井岡霉胺的濃度對(duì)轉(zhuǎn)化時(shí)間作圖，結(jié)果如圖6所示。

圖6 溫度對(duì)3-酮對(duì)硝基苯井岡霉胺的合成影響Fig.6 Effects of temperature on N-p-nitrophenyl-3-ketovalidamine

從圖6可以看出，在不同溫度下的曲線形狀大致相同。在轉(zhuǎn)化初期，隨著溫度的上升，轉(zhuǎn)化速率呈上升的趨勢(shì)，其可能的原因是隨著溫度的升高，細(xì)胞膜的通透性增加，使得化學(xué)物質(zhì)容易進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。因此，對(duì)硝基苯井岡霉胺容易通過細(xì)胞膜，產(chǎn)物容易通過到達(dá)細(xì)胞外。轉(zhuǎn)化12 h后，在30 ℃下，3-酮對(duì)硝基苯井岡霉胺的產(chǎn)量增加較緩慢。因此，筆者選擇25 ℃為最佳的3-酮對(duì)硝基苯井岡霉胺轉(zhuǎn)化溫度。在25 ℃、 pH為7.5的反應(yīng)條件下轉(zhuǎn)化32 h，3-酮對(duì)硝基苯井岡霉胺的產(chǎn)率(Y3-KpNPV)可以達(dá)到0.54。在前期研究中[14]，S.faecium菌的G3DH的最佳轉(zhuǎn)化條件為30 ℃、 pH為7.6，與本文的結(jié)果相近。

3 結(jié)論

采用基因挖掘技術(shù)，一種來自于Glaciecolapolaris的葡萄糖3-脫氫酶基因被發(fā)現(xiàn)，并進(jìn)行了GpG3DH基因工程菌的構(gòu)建和表達(dá)。表達(dá)質(zhì)粒pET28b-GpG3DH被成功構(gòu)建，并在E.coliBL21(DE3)中實(shí)現(xiàn)部分可溶表達(dá)。經(jīng)鎳柱純化和電泳檢測(cè)，G3DH的分子量為5.5×104。隨后，優(yōu)化了GpG3DH的表達(dá)條件，結(jié)果表明，相對(duì)于LB培養(yǎng)基，TB培養(yǎng)基能顯著提高G3DH酶活力。重組菌在37 ℃培養(yǎng)至OD600為0.8時(shí)，加入IPTG至終濃度為0.5 mmol/L，16 ℃誘導(dǎo)表達(dá)10 h，GpG3DH的酶活力達(dá)到2.83×10-2U/mL。最后，將重組菌細(xì)胞用于轉(zhuǎn)化對(duì)硝基苯井岡霉胺生產(chǎn)3-酮對(duì)硝基苯井岡霉胺的研究，最佳的轉(zhuǎn)化體系為EDTA 10 mmol/L、pH為7.5、25 ℃，轉(zhuǎn)化32 h，3-酮對(duì)硝基苯井岡霉胺的產(chǎn)率(Y3-KpNPV)為0.54。相比較于來自Sphingobacteriumfaecium的重組菌，本實(shí)驗(yàn)3-酮對(duì)硝基苯井岡霉胺的產(chǎn)率略低。后續(xù)可以通過酶定向進(jìn)化、定點(diǎn)突變等分子改造手段提高GpG3DH酶活力。