原子力顯微鏡在測(cè)定顆粒與細(xì)胞相互作用中的應(yīng)用

宋 翠，張 瀟，魏 煒，馬光輝

(1. 中國(guó)科學(xué)院 過(guò)程工程研究所 生化工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100190；2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049)

近年來(lái)，納微顆粒憑借其特殊的尺寸效應(yīng)和物理化學(xué)性質(zhì)，在醫(yī)藥、物理、光學(xué)和電學(xué)等領(lǐng)域應(yīng)用越來(lái)越廣泛，尤其是在生物醫(yī)藥領(lǐng)域，納微顆粒被廣泛用作緩釋制劑、靶向制劑和疫苗佐劑等[1]。顆粒在體內(nèi)輸運(yùn)過(guò)程中，其與體內(nèi)細(xì)胞接觸并相互作用，相關(guān)研究表明這種相互作用會(huì)對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移和細(xì)胞因子的分泌等生理過(guò)程產(chǎn)生重要影響，從而調(diào)控顆粒攜帶的生物藥劑的藥效發(fā)揮、靶向性以及顆粒的佐劑免疫效果等[2]。因此，研究顆粒與細(xì)胞的相互作用對(duì)于促進(jìn)納微顆粒在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用有著重要的意義。

已有研究表明，顆粒與細(xì)胞的相互作用與顆粒的理化性質(zhì)密切相關(guān)，顆粒的粒徑、表面性質(zhì)、形狀等都會(huì)影響其與細(xì)胞的作用過(guò)程[3-4]，并且隨著微納米制造技術(shù)的發(fā)展，定向調(diào)控顆粒的理化性質(zhì)成為可能[5]。為了系統(tǒng)深入地研究顆粒與細(xì)胞的相互作用，定量檢測(cè)作用過(guò)程的重要參數(shù)和闡明其微觀作用機(jī)制，近年來(lái)發(fā)明和改進(jìn)了許多先進(jìn)的檢測(cè)設(shè)備和技術(shù)，例如光鑷[6]、磁鑷[7]和原子力顯微鏡[8]等。其中，原子力顯微鏡(atomic force microscopy,AFM)由于具有高靈敏度(皮牛級(jí))、高分辨率(納米級(jí))以及可在生理環(huán)境中進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)等優(yōu)勢(shì)備受關(guān)注。雖然有研究報(bào)道原子力顯微鏡在生物醫(yī)藥中的應(yīng)用[9-10]，但對(duì)于原子力顯微鏡檢測(cè)顆粒與細(xì)胞相互作用的文獻(xiàn)綜述卻很少，因此，本文中筆者系統(tǒng)闡述AFM在研究顆粒與細(xì)胞相互作用的原理及應(yīng)用，以期為后續(xù)的研究提供參考。

1 原子力顯微鏡的基本介紹

1.1 力學(xué)測(cè)量原理

自從1986年Binnig等[8]發(fā)明原子力顯微鏡以來(lái)，AFM 已成為獲取材料表面原子級(jí)分辨率圖片和檢測(cè)力學(xué)性能的有力工具。AFM可以在真空、大氣或者溶液環(huán)境中操作，檢測(cè)對(duì)象可以是導(dǎo)體、半導(dǎo)體或者絕緣體，克服了之前掃描隧道顯微鏡只能對(duì)導(dǎo)電樣品表面進(jìn)行檢測(cè)的局限。其工作原理如下：將一個(gè)彈性微懸臂的一端固定，另一端有一微小的針尖與樣品表面相互作用,使懸臂發(fā)生位移，懸臂的位移通過(guò)激光和四象限檢測(cè)器來(lái)進(jìn)行記錄監(jiān)控，在掃描過(guò)程中，懸臂垂直方向的位移被轉(zhuǎn)換成樣品表面形貌，同時(shí)通過(guò)測(cè)定懸臂的彈性系數(shù)也可獲得力與位移的曲線，如圖1所示，包括靠近曲線和遠(yuǎn)離曲線。樣品的力學(xué)性質(zhì)(如黏附力、楊氏模量等)可以從力曲線中獲得。黏附力可以直接從遠(yuǎn)離曲線中讀取，楊氏模量需要先把力曲線轉(zhuǎn)換為力與壓痕深度的曲線，然后再選擇合適的理論模型(Hertz模型或Sneddon 模型)來(lái)擬合計(jì)算[11]。

圖1 AFM檢測(cè)顆粒與細(xì)胞之間的相互作用力曲線Fig.1 Interaction forces between particle and cellmeasured by AFM

1.2 探針

探針是AFM最核心最重要的元件，它一般包含兩個(gè)部分：懸臂和針尖。探針懸臂的材質(zhì)通常是Si或者Si3N4，形狀有矩形或V字形。為了提高反射率，懸臂的背面會(huì)鍍有一層薄薄的金屬層(一般為Au)，這對(duì)于AFM在液體中進(jìn)行檢測(cè)是非常必要的，因?yàn)樵谝后w中Si3N4的反射率會(huì)明顯下降。懸臂的核心參數(shù)是其彈性系數(shù)，在進(jìn)行力曲線測(cè)量時(shí)需要首先對(duì)其標(biāo)定和校正，目前最常用的校正方法是Thermal Tuning法[12-13]和Sader法[14-15]。

探針針尖主要由Si或Si3N4材質(zhì)制造，但是為了滿足特殊的應(yīng)用需求，鉆石、碳或者礦物單晶等[16-17]也可用做探針針尖，形狀通常是三角錐形，半徑分布在十到幾十納米。

1.3 膠體探針

通過(guò)對(duì)探針表面修飾化學(xué)分子或目標(biāo)蛋白，AFM可以檢測(cè)不同分子之間或分子與細(xì)胞之間的相互作用[18-19]。為了進(jìn)一步測(cè)量顆粒與細(xì)胞的相互作用，需要將微納米級(jí)的顆粒黏附在探針懸臂末端，將其作為探針針尖與細(xì)胞接觸來(lái)進(jìn)行測(cè)量，這種探針被稱為膠體探針[20](圖1)。與傳統(tǒng)探針相比，膠體探針有以下優(yōu)點(diǎn)：首先，顆粒與細(xì)胞接觸面的曲率半徑大，這增加了顆粒與細(xì)胞的接觸面積，減少了錐形探針對(duì)細(xì)胞局部應(yīng)力過(guò)大的傷害；其次，接觸面積變大使得細(xì)胞局部的硬度波動(dòng)變小，因此只需較少的實(shí)驗(yàn)次數(shù)便可獲得更可靠的數(shù)據(jù)；最后，將膠體探針與細(xì)胞表面接觸的幾何形狀視為球形，細(xì)胞的楊氏模量就可以選用簡(jiǎn)單的Hertz 模型直接擬合得到[11]，無(wú)需進(jìn)行繁雜的公式推導(dǎo)，這極大地提高了數(shù)據(jù)處理效率。

膠體探針的出現(xiàn)為AFM的應(yīng)用開(kāi)拓了新的領(lǐng)域，研究者們進(jìn)一步對(duì)膠體探針進(jìn)行修飾[21-22]，從而進(jìn)行一系列特定相互作用力大小和作用機(jī)制的研究。自從Ducker等[20]和 Butt 等[23]在1991年報(bào)道了膠體探針制備技術(shù)后，已經(jīng)涌現(xiàn)出各種各樣的膠體探針的制備方法[24-25]。研究者們可以根據(jù)顆粒的性質(zhì)、操作環(huán)境和特殊的設(shè)備要求等來(lái)選擇合適的方法進(jìn)行膠體探針的制備。

1.4 樣品制備

AFM的樣品不需要染色、標(biāo)記或噴涂，因此分子、細(xì)胞等生物樣品可以直接在生理環(huán)境中進(jìn)行觀察。然而生物樣品的制備也是限制AFM在生物領(lǐng)域應(yīng)用的主要原因，因?yàn)闇y(cè)量時(shí)需要保證生物樣品牢牢地固定在基底上以避免被探針刮走或者發(fā)生結(jié)構(gòu)改變。對(duì)于活細(xì)胞，特別是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，它們具備良好的貼壁生長(zhǎng)性能，不會(huì)輕易被探針干擾或移動(dòng)，因此可以直接在培養(yǎng)皿中進(jìn)行掃描。而對(duì)于懸浮細(xì)胞或者細(xì)菌，就需要在掃描時(shí)使用特殊的實(shí)驗(yàn)方法將其固定，比如固定在濾膜膜孔中[26]，或者通過(guò)修飾基底表面將樣品固定[27]等。不管選擇何種樣品制備方法，在檢測(cè)時(shí)都要盡量選擇較小的力和合適的掃描模式以降低探針對(duì)樣品的影響。

1.5 力學(xué)測(cè)量技術(shù)的發(fā)展

隨著AFM的不斷創(chuàng)新和優(yōu)化，其檢測(cè)模式和測(cè)量方法也不斷被優(yōu)化。在AFM現(xiàn)有的測(cè)量方法中，已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞的表面形貌信息和相關(guān)力學(xué)性能的同步測(cè)量，避免了之前對(duì)力曲線的后續(xù)手動(dòng)擬合環(huán)節(jié)，極大地提高了測(cè)量效率。其中的一種技術(shù)是力體積成像技術(shù)(force volume imaging)[28-29]，這種技術(shù)可以對(duì)樣品選定范圍進(jìn)行逐點(diǎn)力測(cè)定，并以圖像中相應(yīng)像素點(diǎn)的明暗程度表示作用力的大小，從而直觀地反映出樣品表面的整體特征，避免了單點(diǎn)力測(cè)定的一些局限性，然而其線性分辨率較低，且掃描速度較慢，因此獲得一幅完整的表面圖需要很長(zhǎng)的時(shí)間。最新開(kāi)發(fā)的一種技術(shù)叫定量納米力學(xué)成像技術(shù)(peak force quantitative nanomechanical property mapping，PFQNM)[30-31]，該技術(shù)不僅易操作,而且可以在輕敲模式下快速地獲得高分辨率的樣品表面力學(xué)圖像，極大地提高了AFM力學(xué)測(cè)量的效率。

2 AFM測(cè)量顆粒與細(xì)胞相互作用在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用

顆粒與細(xì)胞的相互作用會(huì)受到顆粒理化性質(zhì)的影響，包括顆粒的大小、形狀、表面電荷和官能團(tuán)等，利用顆粒制備技術(shù),比如物理性質(zhì)優(yōu)化、化學(xué)修飾或者生物合成等,可以制備需要的顆粒,從而滿足其在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用。利用AFM檢測(cè)顆粒與細(xì)胞之間的相互作用，獲得相應(yīng)的力學(xué)性能，這些力學(xué)性能和體系中的生理現(xiàn)象相結(jié)合有助于解釋顆粒在生物醫(yī)藥領(lǐng)域應(yīng)用，如藥物遞送、免疫響應(yīng)和細(xì)胞力學(xué)等涉及深層次的作用機(jī)制，包括顆粒進(jìn)入體內(nèi)后，影響其作為藥物遞送系統(tǒng)靶向性、高效性的因素和對(duì)細(xì)胞毒性的影響；顆粒與免疫細(xì)胞相互作用從而介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的機(jī)制以及作為疫苗佐劑的免疫響應(yīng)機(jī)制；顆粒與細(xì)胞相互作用對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)以及力學(xué)性能的影響等。

2.1 藥物遞送

隨著生物技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的生物藥物得到發(fā)明和開(kāi)發(fā)，例如，蛋白質(zhì)、多肽、抗體和核酸等。然而生物藥物存在體內(nèi)易降解、半衰期短、患者必須接受頻繁注射、血藥濃度波動(dòng)大、藥效不理想或產(chǎn)生毒副作用等問(wèn)題，特別是抗腫瘤藥物存在瘤內(nèi)滲透困難和細(xì)胞攝取不足的難題，這些都會(huì)導(dǎo)致實(shí)際治療效果不佳。為了提高生物藥物的利用率、靶向性并減少毒副作用，研究者們進(jìn)行了大量藥物遞送系統(tǒng)的研究工作[32-33]。藥物遞送最基本的原則是直接將藥物輸送到目標(biāo)組織或細(xì)胞以獲得最好的治療效果和最小的毒性影響，而阻礙治療效果的原因主要是藥物遞送系統(tǒng)與各種生理和病理環(huán)境的復(fù)雜相互作用。生物納米技術(shù)的應(yīng)用使得納微級(jí)顆粒的藥物遞送系統(tǒng)得以快速發(fā)展并備受關(guān)注[34-35]，這些載體可包裹靶向細(xì)胞或組織的表面受體的成分，并具有膜內(nèi)外運(yùn)輸?shù)哪芰Α?/p>

藥物遞送到指定位置時(shí)首先是載體顆粒與生物膜接觸發(fā)生相互作用，如果要將更多的藥物遞送到靶向細(xì)胞，那么載體與細(xì)胞膜之間強(qiáng)烈的相互作用可能會(huì)引起細(xì)胞膜的不穩(wěn)定，從而產(chǎn)生細(xì)胞毒性。AFM成像能在時(shí)空尺度上對(duì)細(xì)胞膜接觸藥物分子、納米顆?；蛩幬飶?fù)合物后產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)變化和膜重組過(guò)程進(jìn)行監(jiān)測(cè)。Banaszak研究組的Hong等[36]、Leroueil等[37-38]利用AFM成像揭示了具有氨基末端的聚酰胺(PAMAM)聚合物與細(xì)胞膜相互作用對(duì)細(xì)胞膜的影響，研究發(fā)現(xiàn)，帶正電的PAMAM會(huì)引起細(xì)胞膜的無(wú)序排列，在磷脂雙分子層區(qū)域形成直徑約30 nm的孔，且會(huì)使膜變薄甚至發(fā)生膜擾動(dòng)，而在這些無(wú)序排列的部位發(fā)現(xiàn)了藥物遞送系統(tǒng)的聚集，然而不帶電的顆粒卻不會(huì)產(chǎn)生這些變化。

通過(guò)膠體探針AFM，可以檢測(cè)影響藥物遞送系統(tǒng)與細(xì)胞作用的各種影響因素，比如細(xì)胞、顆粒的性質(zhì)和生理環(huán)境等。Pyo等[39]利用AFM研究了不同的細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)密度對(duì)納米硅藥物遞送系統(tǒng)與細(xì)胞相互作用的影響，結(jié)果顯示不同的細(xì)胞培養(yǎng)密度以及細(xì)胞表面的褶皺形貌都會(huì)對(duì)相互作用產(chǎn)生影響。Shinto 等[22]利用膠體探針研究了不同條件下聚乳酸微球(PLLA)與小鼠黑色素瘤細(xì)胞的相互作用，研究表明，微球表面包裹了羥磷灰石(HAp)納米顆粒后，相較于光滑的PLLA顆粒，其與細(xì)胞的黏附力增大，并且在有血清的環(huán)境中比在無(wú)血清環(huán)境中黏附力也會(huì)增大，這可能是由于HAp/PLLA顆粒表面呈正電并會(huì)吸附較多血清中黏附蛋白的原因。Pyrgiotakis等[40]研究了功能化的納米顆粒CeO2和Fe2O3在不同的生理環(huán)境中與肺的上皮細(xì)胞之間的相互作用，結(jié)果表明，它們之間的相互作用力很大程度上依賴于生理環(huán)境，在生理液中蛋白冠的存在減弱了顆粒與細(xì)胞之間的相互作用，另外，這種作用也受顆粒大小和材質(zhì)的影響。

上述研究表明：要減少藥物遞送系統(tǒng)對(duì)正常細(xì)胞的毒性并且提高對(duì)于靶向細(xì)胞的靶向效率，其理化性質(zhì)以及所處的生理環(huán)境等都會(huì)產(chǎn)生重要的影響。因此，構(gòu)建高效安全的藥物遞送系統(tǒng)，需要評(píng)價(jià)各種因素，從而進(jìn)行篩選。傳統(tǒng)的篩選方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而利用AFM測(cè)量藥物遞送系統(tǒng)與細(xì)胞之間的相互作用，通過(guò)測(cè)量黏附力，可以快速準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)各因素對(duì)相互作用的影響，這為設(shè)計(jì)和制備更加高效安全的藥物遞送系統(tǒng)提供了直觀準(zhǔn)確的理論依據(jù)。

2.2 免疫響應(yīng)

免疫反應(yīng)可分為非特異性免疫反應(yīng)和特異性免疫反應(yīng)。非特異性免疫反應(yīng)對(duì)抗原反應(yīng)迅速，是人體的第一道防線[41]。特異性免疫反應(yīng)，是通過(guò)免疫細(xì)胞的選擇和擴(kuò)增來(lái)激活T細(xì)胞和B細(xì)胞，從而獲得永久性免疫記憶[42]。非特異性免疫可以協(xié)同和參與特異性免疫反應(yīng)。顆?？梢宰鳛樽魟┗虬肟乖せ蠲庖叻磻?yīng)[43]，當(dāng)顆粒進(jìn)入身體時(shí)，它們與免疫細(xì)胞的相互作用方式可能是多種多樣的[44]，它們可以與中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和其他效應(yīng)細(xì)胞作用從而引發(fā)炎癥反應(yīng)，也可以與樹(shù)突細(xì)胞(DC 細(xì)胞)相互作用而被內(nèi)吞噬從而發(fā)生抗原反應(yīng)。而顆粒的物理化學(xué)性質(zhì)會(huì)影響其與免疫細(xì)胞的相互作用和隨后的免疫反應(yīng)，所以檢測(cè)顆粒與免疫細(xì)胞的相互作用對(duì)研究免疫反應(yīng)、揭示免疫機(jī)制具有重要的意義。

為揭示顆粒激活免疫細(xì)胞，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的機(jī)制,Ng等[45]利用AFM研究了尿酸鈉晶體與DC細(xì)胞膜的相互作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在沒(méi)有受體的情況下，晶體顆粒能直接作用于細(xì)胞膜上特別是膽固醇部分,從而激活DC細(xì)胞內(nèi)SyK激酶介導(dǎo)的信號(hào)傳遞。為研究最原始的免疫細(xì)胞吞噬顆粒的作用機(jī)制，Mu等[46]使用AFM聯(lián)合熒光顯微鏡，通過(guò)AFM將聚苯乙烯顆粒置于DC細(xì)胞上與細(xì)胞接觸，實(shí)時(shí)記錄細(xì)胞膜上磷脂酰肌醇4,5-二磷酸(PIP2)和膜突蛋白的熒光圖像，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在沒(méi)有受體時(shí)，固體顆粒接觸細(xì)胞膜引起質(zhì)膜變形，使得PIP2蛋白聚集，從而結(jié)合膜突蛋白，進(jìn)一步激活SyK激酶并引起細(xì)胞的吞噬作用。

顆粒佐劑作為一種重要的疫苗佐劑，其免疫效應(yīng)也備受關(guān)注，其中鋁佐劑被廣泛應(yīng)用，但其免疫機(jī)制尚不明確。為揭示鋁佐劑的免疫作用機(jī)制，F(xiàn)lach等[47]將鋁佐劑粘于AFM探針上，并實(shí)時(shí)檢測(cè)鋁佐劑與樹(shù)突細(xì)胞的相互作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩者之間有很強(qiáng)的作用力，但鋁佐劑一直停留在細(xì)胞膜上時(shí)并不會(huì)被吞噬，與鋁佐劑相互作用后的DC細(xì)胞隨后被激活。他們研究發(fā)現(xiàn)可能是由于細(xì)胞膜磷脂層結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變激活了DC細(xì)胞，從而提出了一種關(guān)于鋁佐劑的新的免疫機(jī)制。

抗原提呈細(xì)胞(antigen-presenting cells,APCs)特別是DC 細(xì)胞的激活是引發(fā)機(jī)體免疫應(yīng)答的第一關(guān)，DC 細(xì)胞表面表達(dá)多種受體，進(jìn)入體內(nèi)的抗原通過(guò)與受體識(shí)別、結(jié)合而激活免疫細(xì)胞是目前研究比較成熟的一種激活途徑。另外，免疫細(xì)胞也可以在無(wú)受體參與的情況下被顆粒激活，但其激活的機(jī)制與途徑等的相關(guān)研究卻很少。研究者們通過(guò)AFM檢測(cè)顆粒與免疫細(xì)胞之間的相互作用，為揭示無(wú)受體情況下顆粒激活A(yù)PCs、介導(dǎo)炎癥反應(yīng)以及細(xì)胞吞噬等免疫作用機(jī)制提供了一種新的研究思路和方法。

2.3 細(xì)胞力學(xué)

細(xì)胞力學(xué)主要研究活細(xì)胞的行為、力學(xué)性能以及它們與細(xì)胞功能的關(guān)系。組成細(xì)胞的結(jié)構(gòu)包括細(xì)胞膜、細(xì)胞骨架、細(xì)胞器和細(xì)胞質(zhì)，它們的力學(xué)和動(dòng)態(tài)行為以及如何相互作用從而影響細(xì)胞的整體性質(zhì)是細(xì)胞力學(xué)研究的重點(diǎn)[48]。研究表明，細(xì)胞對(duì)于外界刺激的力學(xué)響應(yīng)對(duì)于細(xì)胞的行為有重要的影響，例如，細(xì)胞的遷移、擴(kuò)增、分化和凋亡等[49]。顆粒技術(shù)的快速發(fā)展使得顆粒成為研究細(xì)胞力學(xué)的理想工具，因?yàn)轭w粒能與細(xì)胞直接接觸，通過(guò)一定的方法可檢測(cè)顆粒是如何改變細(xì)胞硬度和力學(xué)性能的。AFM在檢測(cè)細(xì)胞力學(xué)方面有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，特別是膠體探針的應(yīng)用使得AFM成為目前利用顆粒進(jìn)行細(xì)胞力學(xué)性能測(cè)量尤其是細(xì)胞表面力學(xué)測(cè)量的主要工具。

利用膠體探針AFM，可檢測(cè)細(xì)胞骨架的力學(xué)性能，從而對(duì)肌動(dòng)蛋白在調(diào)節(jié)細(xì)胞的黏彈性及力學(xué)行為上的作用進(jìn)行研究。Watanabe-Nakayama等[50]用粘有玻璃小球的AFM 探針，第一次定量檢測(cè)了細(xì)胞對(duì)于循環(huán)拉伸和壓縮的響應(yīng)，結(jié)果表明，由于細(xì)胞黏彈性，細(xì)胞張力開(kāi)始增加然后在1 min內(nèi)減少；超過(guò)幾分鐘后，這種松弛度會(huì)緩慢增加，張力的恢復(fù)在幾次往復(fù)施加力后逐漸消失；當(dāng)細(xì)胞內(nèi)的肌動(dòng)蛋白被抑制后，張力的恢復(fù)也被抑制，表明這種行為是由肌動(dòng)蛋白驅(qū)動(dòng)的。利用膠體探針，還可比較細(xì)胞不同部分的力學(xué)性能，Babahosseini等[51]使用了粘有玻璃小球的探針比較了非浸潤(rùn)性人乳腺細(xì)胞(MCF-10A)和浸潤(rùn)性乳腺癌細(xì)胞(MDA-MB-231)內(nèi)部區(qū)域的生物力學(xué)性能。他們把細(xì)胞從上到下分為三層結(jié)構(gòu)：質(zhì)膜和肌動(dòng)蛋白層(上層)、胞質(zhì)和細(xì)胞核層(中層)以及細(xì)胞核和整合素層(底層)，利用廣義麥克斯韋模型比較了2種細(xì)胞不同層的硬度，結(jié)果表明，無(wú)論哪種細(xì)胞越往下其硬度和黏性越大，并且發(fā)現(xiàn)非浸潤(rùn)性細(xì)胞的硬度和黏性要比浸潤(rùn)性細(xì)胞大?，F(xiàn)在的AFM還可以通過(guò)聯(lián)合其他先進(jìn)技術(shù)(如熒光成像技術(shù)等)來(lái)拓展它的應(yīng)用[52-53]，這種集成多種功能的AFM可以實(shí)時(shí)檢測(cè)力作用時(shí)細(xì)胞的反應(yīng)。例如Shi等[54]將AFM與熒光顯微鏡聯(lián)用，對(duì)牙周韌帶細(xì)胞進(jìn)行了形貌微結(jié)構(gòu)表征，并利用膠體探針對(duì)細(xì)胞施加一定的力，通過(guò)熒光顯微鏡實(shí)時(shí)觀察細(xì)胞受到力后其結(jié)構(gòu)的變化與反應(yīng)，最后發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞具有很強(qiáng)的力纖維和楊氏模量，所以它能很好地抵消外力的影響。

細(xì)胞的黏彈性和力學(xué)性能也可作為疾病診斷的依據(jù)，比如癌癥、關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松癥和心血管病等[55]。Cross等[56]提取了肺、胰腺和乳腺癌細(xì)胞并用AFM對(duì)它們的硬度進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，癌細(xì)胞比良性的細(xì)胞都要軟，說(shuō)明力學(xué)性能可以作為區(qū)別癌細(xì)胞與正常細(xì)胞的一個(gè)判斷依據(jù)。Nguyen等[57]通過(guò)使用微米級(jí)的球形探針，表征了良性人乳腺細(xì)胞MCF-10A和人乳腺癌上皮細(xì)胞(MCF-7)的黏彈性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩者有明顯的區(qū)別，MCF-7細(xì)胞比MCF-10A 細(xì)胞更軟，經(jīng)過(guò)細(xì)胞松弛素處理的MCF-10A，由于細(xì)胞骨架排列被擾亂其松弛度會(huì)增加。這與Li等[58]對(duì)細(xì)胞MCF-7和MCF-10A的研究結(jié)果一致。

膠體探針AFM 在細(xì)胞力學(xué)領(lǐng)域取得了許多突破性的進(jìn)展，通過(guò)AFM 可以檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞和細(xì)胞膜等細(xì)胞組分的力學(xué)性能，得到包括細(xì)胞膜楊氏模量、細(xì)胞骨架和細(xì)胞核黏彈性等特征參數(shù)。利用AFM 研究力對(duì)細(xì)胞性質(zhì)和功能的影響，是揭示組織、器官生物力學(xué)特性的基礎(chǔ)，也是進(jìn)一步研究細(xì)胞內(nèi)生物大分子力學(xué)性能的出發(fā)點(diǎn)。同時(shí)，有助于深入研究細(xì)胞的生理、病理行為，為疾病的快速診斷和鑒別提供了一種有效的技術(shù)手段。

3 展望

顆粒與細(xì)胞的相互作用因?yàn)榫哂兄匾纳硪饬x和廣泛的應(yīng)用前景受到越來(lái)越多的重視，先進(jìn)的顆粒制備技術(shù)提供了顆粒的多樣性，檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展也使得結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。AFM經(jīng)過(guò)幾十年的發(fā)展，已成為表征和研究活細(xì)胞的主要工具之一，特別是在力學(xué)性能測(cè)量方面，憑借其獨(dú)特的檢測(cè)優(yōu)勢(shì)，AFM成為了檢測(cè)顆粒與細(xì)胞相互作用的重要工具。但AFM也有待改善的地方：首先，由于實(shí)驗(yàn)設(shè)備限制，現(xiàn)在每次實(shí)驗(yàn)是通過(guò)一根探針對(duì)單一目標(biāo)進(jìn)行測(cè)量，為了提高效率，未來(lái)可以開(kāi)發(fā)多探針并行系統(tǒng)。其次，目前AFM主要對(duì)顆粒與細(xì)胞膜表面的相互作用進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)于細(xì)胞內(nèi)部的檢測(cè)還存在困難，這有望通過(guò)制造更加細(xì)長(zhǎng)的探針比如納米針來(lái)實(shí)現(xiàn)[59]，這種探針可以在減少損傷細(xì)胞的情況下刺入細(xì)胞內(nèi)部進(jìn)行操作,從而對(duì)細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)等進(jìn)行原位力學(xué)性質(zhì)測(cè)量。為了更好地研究顆粒與細(xì)胞之間的相互作用，研究者們利用光鑷、磁鑷等技術(shù)直接通過(guò)激光或磁場(chǎng)操縱顆粒進(jìn)行相互作用的研究，兩種技術(shù)能實(shí)現(xiàn)同時(shí)檢測(cè)多個(gè)顆粒并可在細(xì)胞內(nèi)操縱顆粒，彌補(bǔ)了AFM 的不足，三種技術(shù)各有優(yōu)勢(shì)，在研究時(shí)可以相互補(bǔ)充。

目前，將 AFM與其他的先進(jìn)技術(shù)進(jìn)行聯(lián)用，比如熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡以及單分子熒光顯微鏡等已經(jīng)成為新的研究熱點(diǎn)，通過(guò)聯(lián)用可以在獲得力學(xué)性能數(shù)據(jù)的同時(shí)獲得熒光圖像等信息，直接觀察到力學(xué)性能對(duì)細(xì)胞行為及功能的影響等，當(dāng)然現(xiàn)在的聯(lián)用技術(shù)還不太完善，未來(lái)還需要進(jìn)行更多的探索工作。