線粒體DNA的發(fā)現(xiàn)及其基因組的揭示過(guò)程

任衍鋼 白冠軍 宋玉奇 路彥文

（陽(yáng)泉師范高等?？茖W(xué)校 山西平定 045200）

早在1890年，德國(guó)科學(xué)家?jiàn)W爾特曼（Altmann R.）觀察并首次提出線粒體是真核生物的細(xì)胞器，猜測(cè)線粒體具有遺傳自主性［1］。20世紀(jì)50年代，線粒體被確定具有細(xì)胞質(zhì)遺傳特性；60年代，線粒體DNA 分子（mtDNA）被發(fā)現(xiàn)；70年代及80年代初，科學(xué)家逐漸開(kāi)始了對(duì)線粒體基因組的研究；90年代至今，基因組的研究成果被不斷地應(yīng)用于病理、系統(tǒng)發(fā)育等方面，成為生物學(xué)和醫(yī)學(xué)中的重要研究領(lǐng)域之一。本文著重從線粒體遺傳現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)、線粒體DNA 的發(fā)現(xiàn)和線粒體基因組的揭示3 個(gè)方面進(jìn)行歷史簡(jiǎn)述。

1 線粒體遺傳的發(fā)現(xiàn)

線粒體遺傳屬于非孟德?tīng)栠z傳。自從1909年柯倫斯（Correns C.）和鮑爾（Baur E.）各自獨(dú)立地發(fā)現(xiàn)了葉綠體的非孟德?tīng)栠z傳現(xiàn)象后，線粒體的遺傳就受到了關(guān)注。由于線粒體小于質(zhì)體，故其研究難度大于質(zhì)體。1934年，戈?duì)柕率┟芴兀℅oldschmidt C.）［2］根據(jù)其研究成果推測(cè)，吉普賽蛾的顏色差異的原因可能與線粒體有關(guān)。1940年，“酵母遺傳之父”的丹麥科學(xué)家溫厄（Winge O.）和勞斯特森（Laustsen O.）［3］推測(cè)，近親繁殖二倍體酵母退化的現(xiàn)象與線粒體遺傳有關(guān)。用酵母菌研究線粒體的優(yōu)勢(shì)在于，酵母菌是單細(xì)胞真核生物，生命周期短，適合經(jīng)典遺傳學(xué)分析，且能在基本培養(yǎng)基上培養(yǎng)。除此之外，酵母菌的線粒體雖然一般比植物細(xì)胞的小，但一般要比動(dòng)物細(xì)胞的大，數(shù)量比動(dòng)物細(xì)胞的少，易用顯微鏡進(jìn)行觀察。1949年，埃弗呂西（Ephrussi B.）［4］發(fā)現(xiàn)一種由突變導(dǎo)致的厭氧型小群落酵母的遺傳與細(xì)胞質(zhì)有關(guān)，而不是與細(xì)胞核有關(guān)；不久，斯洛尼姆斯基（Slonimski P.）和埃弗呂西［5］進(jìn)一步證實(shí)，這種突變與線粒體有關(guān)。1950年，我國(guó)科學(xué)家陳士怡［6］（1912—1994）在其導(dǎo)師埃弗呂西指導(dǎo)下首次發(fā)現(xiàn)，酵母菌中存在細(xì)胞質(zhì)基因。1950—1952年，米切爾（Mitchell M.B.）等也發(fā)現(xiàn)粗糙脈孢菌線粒體的形成不符合孟德?tīng)栠z傳規(guī)律，這種生長(zhǎng)緩慢型粗糙脈孢菌的遺傳與線粒體有關(guān)。需要指出的是，在20世紀(jì)50年代之前，盡管人們發(fā)現(xiàn)了線粒體的遺傳與細(xì)胞核無(wú)關(guān)，但是由于學(xué)者［例如，哈維（Harvey E.）用海膽卵和佐林格（Zollinger H.）用小鼠腎小管等］用實(shí)驗(yàn)證明這些細(xì)胞在線粒體被除去或破壞后，可以再生線粒體，故人們普遍認(rèn)為線粒體是通過(guò)細(xì)胞其他結(jié)構(gòu)的改變而產(chǎn)生的。甚至60年代初，仍有人用實(shí)驗(yàn)推斷線粒體來(lái)自核外的其他膜系統(tǒng)［7］?？梢?jiàn)，線粒體內(nèi)存在基因的事實(shí)并沒(méi)有因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)線粒體屬于細(xì)胞質(zhì)遺傳而被普遍認(rèn)可。

2 線粒體DNA 的發(fā)現(xiàn)

隨著電子顯微鏡的使用和分子生物學(xué)的誕生，線粒體的相關(guān)研究取得了重要的進(jìn)展。1952年，高分辨率的電子顯微鏡的使用，取代了詹納斯綠染色，作為顯示線粒體的首選方式。分子生物學(xué)的一系列發(fā)現(xiàn)促進(jìn)了科學(xué)家尋找線粒體基因的存在。最初，曾有科學(xué)家依據(jù)酵母菌線粒體細(xì)胞質(zhì)遺傳的特點(diǎn)和50年代關(guān)于質(zhì)粒的研究成果，提出了類似病毒寄生宿主細(xì)胞的“侵入”假說(shuō)，還依據(jù)草履蟲遺傳的研究成果提出了類似草履蟲遺傳的假說(shuō)，甚至依據(jù)發(fā)現(xiàn)一些病毒中的遺傳物質(zhì)是RNA而不是DNA，曾猜想線粒體內(nèi)也含有像病毒RNA那樣的遺傳物質(zhì)。為了證實(shí)這些假設(shè)，科學(xué)家開(kāi)展了一些實(shí)驗(yàn)，但都無(wú)果而終［8］。20世紀(jì)50年代和60年代初，雖然沒(méi)有找到在酵母菌中存在DNA的直接證據(jù)，但在動(dòng)物的線粒體中卻找到了。1956—1957年間，切夫雷蒙特（Chevremont J.）及其同事在用脫氧核糖核酸酶（DNase）處理成纖維細(xì)胞線粒體時(shí)發(fā)現(xiàn)，線粒體內(nèi)的某種物質(zhì)會(huì)發(fā)生陽(yáng)性反應(yīng)，由此猜想線粒體內(nèi)有DNA 存在，但這是在特殊條件下才得到的孚爾根陽(yáng)性反應(yīng)，不能令人信服。1963年，在瑞典大學(xué)實(shí)驗(yàn)生物學(xué)研究所工作的M·納斯（Nass M.）和S·納斯（Nass S.）［9］通過(guò)線粒體內(nèi)纖維固定和電子染色反應(yīng)的方法，用電子顯微鏡觀察到在小雞胚胎細(xì)胞線粒體中存在具有DNA 特性的絲狀纖維，這些絲狀纖維類似于細(xì)菌、藍(lán)藻的核質(zhì)。他們的發(fā)現(xiàn)引起了科學(xué)界的關(guān)注，被認(rèn)為是首次證實(shí)線粒體中存在DNA 分子。盡管如此，酵母菌仍然是研究線粒體DNA 的重要生物。1962年，四柳（Yotsuyanagi Y.）［8］用電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，酵母菌中一些涉及到呼吸變異的類型主要與線粒體有關(guān)，與它們是否處于有氧或無(wú)氧的環(huán)境無(wú)關(guān)。他用電子顯微鏡觀察到，一些進(jìn)行無(wú)氧呼吸的較小的酵母菌，其線粒體內(nèi)膜缺乏像野生酵母菌那樣的“脊”，這無(wú)疑就將線粒體結(jié)構(gòu)改變與呼吸能力聯(lián)系在一起。1964年，沙茨（G.Schatz）等用氯化銫密度梯度離心法發(fā)現(xiàn)，酵母菌線粒體的核酸存在于DNA 衛(wèi)星帶中（這是因?yàn)榻湍妇€粒體中在堿基組成上比染色體具有更豐富的A、T 堿基），再次證實(shí)了線粒體DNA（mtDNA）的存在。既然線粒體中存在DNA 分子，下一步就是探討mtDNA 分子是否含有基因的問(wèn)題了。1966年，芒諾盧（Mounolou J.）［10］等通過(guò)線粒體浮力密度的特殊變化，鑒定了符合非孟德?tīng)栠z傳的酵母菌的一個(gè)呼吸缺陷突變是由mtDNA的改變引起的。他們選取了均具有mtDNA 分子的野生型（大型）酵母和突變的小型酵母，先鑒定了單倍體的小型酵母的mtDNA 分子與大型的mtDNA分子在堿基組成上存在差異；然后通過(guò)野生型與突變型雜交形成二倍體酵母菌，再通過(guò)減數(shù)分裂分離成單倍體酵母，證實(shí)了大型和小型的差異與其呼吸能力直接相關(guān)。緊接著，1967年，昆澤爾（Kuntzel H.）和諾爾（Noll H.）從脈孢菌線粒體中發(fā)現(xiàn)了類似于細(xì)菌的核糖體［也有報(bào)道說(shuō)是線粒體核糖體是由奧布賴恩（O′ Brien T.W.）和卡爾夫（Kalf G.F.）在研究小鼠肝細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的［11］］。正是這些發(fā)現(xiàn)推動(dòng)了美國(guó)生物學(xué)家馬古利斯（Margulis L.）于1967年重新提出更有說(shuō)服力的線粒體起源的內(nèi)共生學(xué)說(shuō)。1969年，2 個(gè)實(shí)驗(yàn)室都獨(dú)立地發(fā)現(xiàn)，用環(huán)己酰亞胺阻斷粗糙脈孢霉菌線粒體和酵母菌線粒體外的核糖體后，應(yīng)用脈沖標(biāo)記方法發(fā)現(xiàn)了線粒體能制造蛋白質(zhì)［7］。補(bǔ)充說(shuō)明，環(huán)己酰亞胺抑制細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中蛋白質(zhì)的合成，但不抑制線粒體中蛋白質(zhì)的合成。需要指出的是，雖然在20世紀(jì)60年代初中期，線粒體中DNA 的存在被證實(shí)并獲得了廣泛認(rèn)可，但mtDNA 是否有自己的遺傳信息表達(dá)和蛋白質(zhì)合成體系，還不能被完全確信，因?yàn)橐郧坝腥藞?bào)道過(guò)在電子顯微鏡下找不到線粒體的現(xiàn)象。據(jù)此還有人認(rèn)為，mtDNA 可能會(huì)像噬菌體一樣能整合到細(xì)胞核DNA 中。直至20世紀(jì)60年代末，科學(xué)家才證實(shí)，過(guò)去認(rèn)為的線粒體丟失，只是由于用常規(guī)的電子顯微鏡難以檢測(cè)到而已。到20世紀(jì)70年代，通過(guò)對(duì)酵母菌mtDNA 突變的研究才解決了過(guò)去認(rèn)為mRNA 是從細(xì)胞核導(dǎo)入的問(wèn)題［7］。

3 線粒體基因組的揭示與應(yīng)用

隨著線粒體DNA 被學(xué)術(shù)界所公認(rèn)，1968年，托馬斯（Thomas D.Y.）和威爾基（Wilkie D.）等很快就用經(jīng)典遺傳學(xué)的方法繪制了酵母菌線粒體基因圖。1969年，“線粒體遺傳學(xué)”正式在澳大利亞的堪培拉召開(kāi)的會(huì)議上確立。1975年，莫洛伊（Molloy P.L.）等發(fā)表了酵母線粒體基因組序列圖：“線粒體生物合成的抗生素抗性標(biāo)記基因在酵母菌較小的突變體缺失分析”。這個(gè)序列雖然是一個(gè)粗的酵母mtDNA 基因組草圖，但意味著揭開(kāi)了研究線粒體基因組的序幕［12］。從1974—1976年，一些實(shí)驗(yàn)室開(kāi)始使用限制性內(nèi)切酶在特定的地方剪切DNA，這種方法的使用導(dǎo)致酵母和其他一些物種包括人類（智人）的mtDNA 圖譜得以開(kāi)啟。1976年，斯里普拉卡什（Sriprakash K.）等［13］首先用這種方法完成了酵母mtDNA 的遺傳和物理圖譜。1977年，道格拉斯（Douglas M.）和布托（Butow A.）等發(fā)現(xiàn)一些多肽是由mtDNA 翻譯的。1978年，鮑思（Bos J.L.）和斯洛尼姆斯基（Slonimski P.）發(fā)現(xiàn)，一些線粒體基因是“中斷的”（不連續(xù)）的。1979年，馬卡奇尼（Maccecchini M.L.）和紐珀特（Neupert W.）等對(duì)大量的細(xì)胞質(zhì)合成的線粒體蛋白質(zhì)的前體進(jìn)行了鑒定。到70年代末，線粒體基因組的基礎(chǔ)工作已基本完成。

20世紀(jì)80年代是人類線粒體基因組研究領(lǐng)域取得重大突破的時(shí)代。1981年，劍橋大學(xué)的亨森（Hensgens）小組在英國(guó)《自然》雜志上公布了人類線粒體基因核苷酸的完整序列和密碼子的特征，這個(gè)序列被稱之為“劍橋序列”（CRS）。這個(gè)序列共有16 569 個(gè)堿基對(duì)（bp），除了同啟動(dòng)DNA 有關(guān)的D 環(huán)區(qū)（D-loop）外，只有87 個(gè)bp 不參與基因的組成?，F(xiàn)在使用的人類mtDNA 序列是它的修訂版（rCRS）。1987—1988年又是人類線粒體研究作出重大突破的2年，這2年發(fā)生了2 個(gè)引起學(xué)術(shù)界關(guān)注的事件。一是1987年，華萊士（Wallace D.）首先提出mtDNA 可能引起人類疾病，這被認(rèn)為開(kāi)辟了醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)研究的新領(lǐng)域。次年（1988年），他又最先發(fā)現(xiàn)mtDNA 第11 778 位點(diǎn)的G—A 使NADH 脫氫酶亞單位（ND4）的蛋白質(zhì)中第340 個(gè)氨基酸由精氨酸變成組氨酸。致盲率50%的Leber氏遺傳性視神經(jīng)病變（LHON）就是由該位點(diǎn)引起的。他被公認(rèn)為是首次發(fā)現(xiàn)了人類mtDNA 缺失和點(diǎn)突變的學(xué)者，當(dāng)然也是首次對(duì)線粒體疾病進(jìn)行分子鑒定的科學(xué)家，他還在研究LHON 的基礎(chǔ)上提出了線粒體病的概念［14］。此后對(duì)線粒體缺陷引起的疾病的研究如雨后春筍般地爆發(fā)。到2016年，至少有275 種線粒體疾病被鑒定［15］。二是以威爾遜（Wilson A.）為首的美國(guó)加州大學(xué)伯克利研究組根據(jù)對(duì)祖先來(lái)自非洲、歐洲、亞洲及新幾內(nèi)亞和澳大利亞土著共147 名婦女胎盤細(xì)胞mtDNA的分析，提出了生活在地球上的現(xiàn)代人類的共同祖先是大約15 萬(wàn)年前生活在非洲的一個(gè)婦女。這就是學(xué)術(shù)上有較大爭(zhēng)論，后來(lái)被稱之為“線粒體夏娃”的假說(shuō)。與核遺傳比較，線粒體基因組具有進(jìn)化快、豐度高，遺傳模式簡(jiǎn)單和具有保守緊湊的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)（例如細(xì)胞色素C 氧化酶I 亞基COI基因），這對(duì)研究生物的進(jìn)化具有重要的意義。由于mtDNA 對(duì)人類的重要性，研究人員將線粒體基因組稱之為人類的第25 號(hào)染色體（人類基因組的結(jié)構(gòu)：22+X+Y+mtDNA）。

進(jìn)入20世紀(jì)90年代后，線粒體基因組測(cè)序工作全面展開(kāi)。1996年第1 個(gè)真核生物——釀酒酵母的核基因組的完全測(cè)序得以完成，2年以后又確定了酵母菌線粒體基因組的完全測(cè)序［16］。1996年，科學(xué)家在美國(guó)加利福尼亞州圣克拉拉埃菲邁克斯公司的協(xié)助下，研發(fā)出首個(gè)線粒體微觀測(cè)序儀。這個(gè)儀器有大約25 美分硬幣大小的硅芯片，通過(guò)退火印刷處理，存儲(chǔ)了高達(dá)135 000 種DNA 序列片段，其全面性包括了大多數(shù)單螺旋mtDNA。同年，在田納西州的韋爾（Ware P.）案中，mtDNA 首次被作為破案的證據(jù)，應(yīng)用mtDNA 分析指正韋爾犯有強(qiáng)奸和殺人罪。1997年第1 個(gè)植物——擬南芥的線粒體基因組的測(cè)序得以完成［17］。

進(jìn)入新世紀(jì)后，mtDNA 在疾病的診治與防治、法醫(yī)學(xué)鑒定、遺傳學(xué)及系統(tǒng)發(fā)育學(xué)等方面的應(yīng)用更加顯著。在家譜分析方面，2009年，專家應(yīng)用mtDNA 分析對(duì)沙皇尼古拉二世進(jìn)行了遺體的確認(rèn)并破解了他的小女兒阿納斯塔西婭去向之迷（讀者可閱讀這方面的有關(guān)資料）。2013年，英國(guó)查理三世國(guó)王的遺體也是通過(guò)比對(duì)他的mtDNA與他妹妹2 個(gè)母系后代進(jìn)行鑒定的。2016年，一種被稱作線粒體捐贈(zèng)或線粒體替代療法（MRT）的體外受精技術(shù)首次應(yīng)用，它通過(guò)從供體母細(xì)胞產(chǎn)生mtDNA，并從母本和父本的細(xì)胞核DNA 中產(chǎn)生后代。在紡錘體轉(zhuǎn)移過(guò)程中，一個(gè)卵子的細(xì)胞核被插入至一個(gè)已除去細(xì)胞核的卵子的細(xì)胞質(zhì)中，但仍含有供體女性的mtDNA，然后使新卵子與精子受精。該程序能使線粒體基因有缺陷的母親生育一個(gè)線粒體健康的后代。墨西哥的一對(duì)夫婦用這種技術(shù)生了一個(gè)男孩。截止到2015年，有人統(tǒng)計(jì)Mitochondrial DNA雜志上收錄的文章中相關(guān)報(bào)道可達(dá)上千篇，眾多生物的線粒體基因組圖譜已經(jīng)被繪制［18］。

綜上所述，線粒體基因的發(fā)現(xiàn)和揭示經(jīng)歷了線粒體遺傳現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)、線粒體DNA 的發(fā)現(xiàn)和線粒體基因組的揭示與應(yīng)用的過(guò)程。從中可以看到，對(duì)線粒體基因的認(rèn)識(shí)并不是一蹴而就的，而是經(jīng)過(guò)了一個(gè)反復(fù)質(zhì)疑和論證的過(guò)程。在對(duì)線粒體遺傳的認(rèn)識(shí)中，模式生物酵母菌扮演了至關(guān)重要的角色。人類線粒體基因組的揭示為人類診斷、診治線粒體疾病，探討人類進(jìn)化及法醫(yī)鑒定等方面開(kāi)拓了廣泛領(lǐng)域，但是其開(kāi)發(fā)和利用還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，尤其是對(duì)一些線粒體疾病的發(fā)現(xiàn)和診治仍具有更廣泛的前景。