吡唑并嘧啶衍生物對微生物的影響

許 芬，饒國武

（浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，浙江 杭州 310014）

0 前言

化學(xué)家在二十世紀(jì)50年代中期研究了作為嘌呤類似物的吡唑并嘧啶，據(jù)報(bào)道它具有各種生物活性。1955年，化學(xué)家Howard E.Skipper等人首次探索了吡唑并嘧啶類化合物的抗腫瘤活性[1]，并深入研究了吡唑并嘧啶類化合物，引起了各國化學(xué)家的廣泛興趣。據(jù)文獻(xiàn)[2-3]，吡唑并嘧啶具有良好的物理性質(zhì)，光學(xué)和生理活性以及高反應(yīng)性，并能與各種試劑發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，因此具有廣闊的前景。

寄生蟲（parasite）是指具有致病性的低等真核生物，可作為病原體，也可作為媒介傳播疾病。寄生蟲特征為在宿主或寄主（host）體內(nèi)或附著于體外以獲取維持其生存、發(fā)育或者繁殖所需的營養(yǎng)或者庇護(hù)的一切生物。許多小動(dòng)物以寄生的方式生存，依附在比它們更大的動(dòng)物身上。

寄生蟲可以改變寄主的行為，以達(dá)到自身更好地繁殖生存的目的。人類若受到一些寄生在腦部的寄生蟲，如終生寄生在腦部的弓形蟲（Toxoplasmosis），其反應(yīng)能力會(huì)降低。

病菌是引起人類疾病的細(xì)菌和病毒，統(tǒng)稱為病原菌或致病菌（pathogenic bacterium）。細(xì)菌在人體內(nèi)寄生，增殖并引起疾病的特性稱為細(xì)菌的致病性或病原性（pathogenicity）。致病性是細(xì)菌種的特征之一，具有質(zhì)的概念，如鼠疫細(xì)菌引起鼠疫，結(jié)核桿菌引起結(jié)核。致病性強(qiáng)弱程度以毒力（virulence）表示，是量的概念。

革蘭氏陽性和革蘭氏陰性病原體，例如金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、釀膿葡萄球菌（Staphylococcus pyogenes）、鼠傷寒沙門氏菌和大腸桿菌引起食物中毒，風(fēng)濕熱，沙門氏菌病，腹瀉等許多傳染病。這些在全球都是嚴(yán)重的健康問題。全球有百萬人受到感染，每年因這些細(xì)菌感染死亡達(dá)到15萬人[4]。

在抗生素使用前的時(shí)代，輕微的傷害和常見的感染可能會(huì)導(dǎo)致危及生命的疾病。20世紀(jì)最偉大的成就之一是抗生素的發(fā)現(xiàn)，它顯著改善了生活質(zhì)量，徹底改變了現(xiàn)代醫(yī)學(xué)[5-7]。

1 吡唑并嘧啶衍生物的抗菌作用

細(xì)菌對傳統(tǒng)抗生素如青霉素和四環(huán)素的耐藥性迅速增加，這促使人們繼續(xù)尋找具有新型抗菌活性的新型化合物。吡唑并嘧啶是一類重要的化合物，吸引了化學(xué)家的注意，因?yàn)榛瘜W(xué)治療藥物，如抗菌藥物，抗病毒藥物和細(xì)胞毒性藥物的性質(zhì)都有很好的文獻(xiàn)記載。吡唑并嘧啶和相關(guān)雜環(huán)在藥物化學(xué)中具有廣泛的重要藥效團(tuán)和特殊結(jié)構(gòu)。據(jù)文獻(xiàn)調(diào)查顯示，吡唑并嘧啶衍生物具有多種藥理活性，如CNS抑制劑，精神安定劑，結(jié)核抑制劑，抗高血壓藥，鎮(zhèn)痛劑和抗菌活性。吡唑并[1，5-a]嘧啶構(gòu)架是[5-6]稠合雙環(huán)雜環(huán)，除了用于各種藥理學(xué)研究外，已經(jīng)成為多用途骨架，從它們對多種疾病靶標(biāo)的效用來看，吡唑并[1，5-a]嘧啶在制備各種藥物和生物活性分子方面顯示出巨大的合成價(jià)值[8]。

1.1 吡唑并[1，5-a]嘧啶的抗菌活性

吡唑并[1，5-a]嘧啶作為嘌呤類似物，其重要性在化學(xué)和藥理學(xué)中都有體現(xiàn)。另一方面，磺酰胺類化合物具有多種生物活性。這促使研究者探索含有磺酰氨基的吡唑并[1，5-a]嘧啶的合成，以篩查其抗菌活性。通過實(shí)驗(yàn)表明，大多數(shù)這類化合物存在革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的抗菌活性[9]。

通過瓊脂擴(kuò)散法測定合成化合物1（其合成方法見Scheme 1）的抗微生物活性評價(jià)化合物對大腸桿菌（MTCC443）、枯草芽孢桿菌（MTCC441）、金黃色葡萄球菌（MTCC96）和傷寒沙門氏菌的抗菌活性。用抗生素青霉素（25μg/mL）作為抗菌藥物和制霉菌素（25μg/mL）作為抗真菌藥物的參比藥物，使用二甲基亞砜（1%，DMSO）作為無化合物的對照[8]得到實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1.2 吡唑并[3，4-d]嘧啶類抗菌活性

在使FOL7185作為模板來設(shè)計(jì)用于用BtIspD和BtIspE測試的許多吡唑并嘧啶類似物時(shí)，盡管FOL7185在抑制區(qū)測定中對B.thailandensis和銅綠假單胞菌沒有顯示出可測量的生長抑制，但其許多類似物確實(shí)顯示出生長抑制。化合物2（其合成方法見Scheme 2）抑制B.thailandensis濃度為0.1 mM （這與卡那霉素相當(dāng)）。 該化合物還顯示出對銅綠假單胞菌多重耐藥菌株的可測量的效力，因此證明了跨物種抑制作用和作為廣譜抗生素活性的起點(diǎn)的潛力。在STDNMR研究中，化合物2顯示與BtIspE的活性位點(diǎn)的顯著相互作用，表明這些類似物可以通過破壞類異戊二烯生物合成來抑制細(xì)菌生長[7]。

使用紙片擴(kuò)散法測試化合物3，4和5（Figure 1）對金黃色葡萄球菌ATCC 6538，表皮葡萄球菌ATCC 12228，大腸桿菌 ATCC 8739，綠膿假單胞菌ATCC 1539，以及它們對白色念珠菌ATCC 10231的抗真菌活性，發(fā)現(xiàn)化合物3，4和5對抗金黃色葡萄球菌ATCC 6538（分別為MIC：185；78；和 156μg/Ml）和化合物 5對白色念珠菌ATCC 10231 （MIC：312.5 μg/mL）（使用微量稀釋法測定這些化合物的最小抑制濃度）[10]。

Scheme1 具有抗菌活性的吡唑并[1，5-a]嘧啶衍生物的合成

2 吡唑并嘧啶衍生物抗寄生蟲活性

吡唑并嘧啶是嘌呤類似物,其像嘌呤一樣被致病性血蠅代謝（該代謝序列在人類或其他哺乳動(dòng)物中不存在）。別嘌呤醇是由吡唑并嘧啶堿基經(jīng)歷核糖磷酸化為核糖核苷酸產(chǎn)生，該核糖核苷酸可以保持原樣或被氨基化成氨基類似物進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成氨基吡唑并嘧啶核糖核苷三磷酸，后者被并入RNA中。該代謝序列已經(jīng)在利什曼原蟲屬和錐蟲屬中得到證明[11]。

Scheme2 具有抗菌活性的吡唑并[3，4-d]嘧啶衍生物的合成

Figure1 具有抗金黃色葡萄球菌和白念珠菌的吡唑并嘧啶衍生物

2.1 某些吡唑并[1，5-a]嘧啶的抗滴蟲活性

關(guān)于吡唑并[1，5-a]嘧啶的生物學(xué)性質(zhì)的調(diào)查研究促使人們探索開發(fā)含有稠合硝基吡咯環(huán)的抗寄生蟲化合物。例如，3-硝基吡唑并 [1，5-a]嘧啶衍生物6（其合成方法見Scheme 3），其中R1為H或C2H5且R2為H或COOC2H5COOH。 然而，研究這些新化合物3-硝基-4，6-二取代吡唑并[1，5-a]嘧啶酮（7， 8， 9 和 10， Figure 2）的所有衍生物的活性結(jié)果顯示其并非完全缺乏對除滴蟲以外的細(xì)菌、真菌和寄生蟲的活性[12]。

Scheme3 具有抗滴蟲活性的吡唑并[1，5-a]嘧啶衍生物的合成

Figure2 3-硝基-4，6-二取代吡唑并[1，5-a]嘧啶酮

2.2 別嘌呤醇對克氏錐蟲的影響

別嘌呤醇（4-羥基吡唑并[3，4-d]嘧啶）是體外抗克氏錐蟲的有效藥物。 這種寄生蟲寄生的重要形式，就如同人類恰加斯病的發(fā)病機(jī)制，是血流和細(xì)胞內(nèi)形式。用放射性標(biāo)記的別嘌呤醇和通過高效液相色譜法分析該化合物的代謝產(chǎn)物的實(shí)驗(yàn)表明，血管和細(xì)胞內(nèi)形式的克氏錐蟲均以與體外對于epimastig-otes所顯示的相同的方式代謝別嘌呤醇。通過感染動(dòng)物和感染了克氏錐蟲的組織培養(yǎng)系統(tǒng)分離出的有機(jī)體證明了致病形式的吡唑并嘧啶的代謝途徑。 用別嘌呤醇治療感染組織培養(yǎng)物及根除感染的調(diào)查意味著別嘌呤醇可能對克氏錐蟲感染的化療有用，這一假設(shè)已在一項(xiàng)動(dòng)物研究中得到證實(shí)[13]。

2.3 抗利什曼蟲和錐蟲屬

吡唑并嘧啶堿別嘌呤醇被磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶活化為核糖核酸，將核糖核苷酸胺化成4-氨基吡唑并嘧啶核糖核苷酸，隨后磷酸化成三磷酸酯形式并摻入RNA中。吡唑并嘧啶核糖核苷霉素B和別嘌呤醇核糖核苷通過核苷磷酸轉(zhuǎn)移酶活化，如上所述將得到的核糖核苷酸胺化并摻入RNA中。 這些代謝特征不僅發(fā)生在昆蟲載體中，而且發(fā)生在人的致病細(xì)胞內(nèi)。 在利什曼原蟲和錐蟲屬中存在的嘌呤的酶學(xué)和代謝的差異為化療開發(fā)提供了極好的機(jī)會(huì)[14]。

哺乳動(dòng)物細(xì)胞從頭合成嘌呤，此外還具有連接嘌呤堿基和核苷的能力，以用于核酸和輔酶的合成。 利什曼原蟲和錐蟲屬物種缺乏從頭合成嘌呤，但可利用嘌呤摻入的主動(dòng)補(bǔ)救機(jī)制。這些差異和人類與原生動(dòng)物之間嘌呤補(bǔ)救途徑中酶的特異性相關(guān)的吡唑并嘧啶代謝方面的差異使人們對這些生物的生物化學(xué)有了更全面的理解，并且可能發(fā)現(xiàn)由這些生物引起的疾病的藥化學(xué)治療形式的一些實(shí)際應(yīng)用物[11]。

2.4 吡唑并[3，4-d]嘧啶核糖核苷作為抗球蟲藥

4-（烷硫基）-1H-吡唑并[3，4-d]嘧啶的核糖核苷已被證明是有用的抗球蟲劑。 在研究中，不飽和4-烯丙基硫代和4-丁烯硫基衍生物 （11和12，F(xiàn)igure 3）顯示出比它們的飽和同系物在體內(nèi)對柔嫩艾美耳球蟲更具活性。

Figure3 具有抗球蟲活性的吡唑并[3，4-d]嘧啶衍生物

研究表明，1H-吡唑[3，4-d]嘧啶的核糖核苷能夠抑制雛雞中柔嫩艾美耳球蟲的發(fā)育。 結(jié)果表明，烷基硫代衍生物在用4-烷基硫代化合物的研究中優(yōu)于烷基氨基衍生物，顯然，4-取代基的烷基鏈中的不飽和鍵增強(qiáng)了其體內(nèi)活性。由于發(fā)現(xiàn)飽和的同源物，因此該研究已擴(kuò)展至包括4-(芳基烯基)硫基和 4-(芳基炔基)硫基類似物[15]。

2.5 抗隱孢子蟲屬和剛地弓形蟲

原生動(dòng)物隱孢子蟲和弓形蟲是無處不在的寄生蟲，感染人類和家養(yǎng)動(dòng)物，是一種引起人類主要健康問題C.parvum的寄生蟲 （因?yàn)樗峭ㄟ^水傳播疾病的）。C.parvum感染會(huì)導(dǎo)致衰弱性腹瀉，這可能增加免疫功能低下患者的生命危險(xiǎn)。 最近的研究致力于將發(fā)展中國家的兒童腹瀉病的發(fā)病率控制在15%～20%左右[16-18]。

原生動(dòng)物隱孢子蟲和弓形蟲是兩種寄生蟲，均含有一組鈣依賴性蛋白激酶（CDPK），這些激酶在植物和纖毛蟲中發(fā)現(xiàn)，但不存在于人類或真菌中。所以，一系列在 C.parvum（CpCDPK1）和T.gondii（TgCDPK1）中靶向 CDPK1 的有效抑制劑便產(chǎn)生了。這些抑制劑對CpCDPK1和TgCDPK1的選擇性高于哺乳動(dòng)物SRC和ABL。此外，它們能夠在C.parvum入侵HCT-8宿主細(xì)胞的早期階段發(fā)生作用，這與它們對侵入人成纖維細(xì)胞的弓形蟲的作用相似。

實(shí)際上，Shokat及其同事已經(jīng)表明，含有丙氨酸或甘氨酸殘基的突變哺乳動(dòng)物激酶對吡唑并嘧啶類抑制劑特別敏感，所述吡唑并嘧啶抑制劑（化合物 13～15，F(xiàn)igure 4）[19-21]能夠有效地抑制TgCDPK1的催化活性并阻斷剛毛蟲侵入人成纖維細(xì)胞。在C.parvum （CpCDPK1）中也發(fā)現(xiàn)了TgCDPK1的同源物，但其在寄生蟲侵襲中的作用尚未闡明。

3 總結(jié)

吡唑并嘧啶衍生物作為嘌呤的類似物，其具有多種生物活性，其中最主要的為抗癌和本文所述的對微生物的影響。以吡唑并嘧啶環(huán)為母環(huán)的許多化合物均能抗微生物生長或影響其代謝的過程，無論是抗菌還是抗寄生蟲，都為滅除外物入侵，保護(hù)機(jī)體健康做出了貢獻(xiàn)。

Figure4 具有抗隱孢子蟲屬和剛地弓形蟲的吡唑并嘧啶衍生物