miR-16通過靶向調(diào)控YAP1基因表達(dá)影響肺癌細(xì)胞的增殖

周蕓 張筠 樓玉鳳 方力爭

(1浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院全科醫(yī)學(xué)科，浙江 寧波 310058；2寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科；3浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院全科醫(yī)學(xué)科)

雖然隨著治療技術(shù)手段的不斷發(fā)展，但肺癌的遠(yuǎn)期生存率仍沒有顯著提高。因此，提高肺癌的早期診斷、早期治療具有重要意義〔1，2〕。miRNA能夠通過負(fù)性調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等多種生物學(xué)過程。大量學(xué)者通過miRNA芯片技術(shù)、微陣列技術(shù)、熒光定量PCR等技術(shù)手段證實了肺癌腫瘤組織、血漿中存在著多種miRNA的差異性表達(dá)，并提示miRNA是肺癌早期診斷的有效指標(biāo)〔3，4〕。miR-16是較早發(fā)現(xiàn)的一種抑癌miRNA，在包括肺癌在內(nèi)的多種腫瘤組織中低表達(dá)，但在肺癌發(fā)生發(fā)展過程中的具體機(jī)制尚未明確〔5，6〕。同時，miRNA在細(xì)胞生物學(xué)中的作用幾乎都是通過調(diào)控靶基因表達(dá)來實現(xiàn)的。因此，本研究將探討miR-16對肺癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響及對相關(guān)靶基因的調(diào)控作用。

1 材料和方法

1.1細(xì)胞株 肺腺癌細(xì)胞A549、H1050、H1299，肺鱗癌細(xì)胞NCI-H520、NCI H596及人胚肺細(xì)胞MIRC-5均購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.2主要試劑和儀器 兔抗人Yes相關(guān)蛋白(YAP)1及磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)單克隆抗體均購于美國Cell Signal Technology公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白測定試劑盒，Hoechst33258染色試劑盒均購于南京凱基生物技術(shù)有限公司；Trizol總RNA提取試劑盒，LipofectamineTM3000脂質(zhì)體，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(第一鏈cDNA合成試劑盒)均購于大連寶生物技術(shù)有限公司；miR-16 mimics和miR-16 NC均購于上海吉馬生物技術(shù)有限公司；重組質(zhì)粒pGL3 YAP1 3′UTR-Wt及pGL3 YAP1 3′UTR-Mut購于廣州銳博生物技術(shù)有限公司。DYCZ-40D型轉(zhuǎn)印電泳儀，DYCZ-425D型雙垂直電泳儀均購于北京六一儀器廠；168-1000XC型酶標(biāo)儀，F(xiàn)ACSCalibur型流式細(xì)胞儀購于美國BD公司；GelDoc 2000型凝膠成像系統(tǒng)購于美國伯樂公司；IX51倒置顯微鏡購于日本OLIMPUS公司。

1.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染 當(dāng)A549細(xì)胞密度達(dá)到50%時，利用LipofectamineTM3000脂質(zhì)體將稀釋好的miR-16 mimics和miR-16 NC轉(zhuǎn)染到A549細(xì)胞中，6 h 后細(xì)胞換液并繼續(xù)培養(yǎng)48 h，采用RT-PCR法檢測細(xì)胞中miR-16的表達(dá)。

1.4RT-PCR法檢測細(xì)胞中miR-16及YAP1表達(dá) 根據(jù)Trizol試劑盒說明書提取總RNA，當(dāng)檢測出的RNA純度良好時候，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，最后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。

1.5MTT法檢測細(xì)胞活力 將5×103個A549細(xì)胞接種到96孔板，培養(yǎng)24 h，按“1.4”轉(zhuǎn)染48 h后，加入MTT試劑孵育4 h，后舍去上清液，加入二甲基亞砜，微量振蕩器震蕩使結(jié)晶物溶解，利用酶標(biāo)儀檢測OD570 nm值，所測OD值即細(xì)胞活力。

1.6軟瓊脂糖克隆形成實驗 將8×103個A549細(xì)胞接種到6孔板，培養(yǎng)24 h后，按“1.4”轉(zhuǎn)染48 h后，消化細(xì)胞并制成單細(xì)胞懸液。制作1.2%及0.7%的瓊脂糖液，首先將1.2%瓊脂糖與兩倍體積的DMEM培養(yǎng)基混勻，倒于6 cm培養(yǎng)皿，室溫下冷卻。接著0.7%瓊脂糖液與兩倍體積的DMEM培養(yǎng)基混勻后，加入單細(xì)胞懸液繼續(xù)混勻，后倒于鋪有1.2%瓊脂糖的平皿中，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并于顯微鏡下觀察計數(shù)。

1.7Hoechst法檢測細(xì)胞凋亡情況 將8×103個A549細(xì)胞接種到6孔板，培養(yǎng)24 h后，按“1.4”轉(zhuǎn)染48 h后，用甲醇∶乙酸混合液固定細(xì)胞30 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后，加入Hoechst33258染色液染色10 min，于倒置顯微鏡下觀察，細(xì)胞核皺縮，濃染并呈碎片說明細(xì)胞凋亡，最后用Image J軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.8流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期 將8×103個A549細(xì)胞接種到6孔板，培養(yǎng)24 h后，按“1.4”轉(zhuǎn)染48 h后，每組收集1×105/ml個細(xì)胞，再加入5 μl的Rnase吹打混勻后于室溫下孵育1 h，接著加入PI染液在室溫下避光孵育30 min，最后進(jìn)行流式檢測，并對細(xì)胞周期進(jìn)行分析。

1.9Western印跡檢測細(xì)胞中YAP1表達(dá) 收集細(xì)胞并裂解，離心收獲上清液獲得總蛋白，BCA試劑盒測定蛋白濃度，蛋白煮沸變性，制作濃縮膠及分離膠，上樣，進(jìn)行十二烷基苯磺酸鈉凝膠電泳，聚偏氟乙烯(PVDF)膜濕法轉(zhuǎn)膜。2%的牛血清白蛋白(BSA)室溫下孵育1 h，一抗溶液(兔YAP1及GAPDH單克隆抗體，稀釋度為1∶100) 4℃過夜孵育，第二天在室溫條件下，與二抗溶液孵育1～2 h，在凝膠成像系統(tǒng)中曝光。最后用Quantity one軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.10熒光素酶報告基因表達(dá)分析 將miR-16 mimics+pGL3 YAP1 3′UTR-Wt，miR-16 NC+ pGL3 YAP1 3′UTR-Wt，miR-16 mimics+pGL3 YAP1 3′UTR-Mut，miR-16 NC+ pGL3 YAP1 3′UTR-Mut四組miR-16與YAP1的重組載體轉(zhuǎn)入SW480細(xì)胞中，并根據(jù)雙熒光素酶檢測系統(tǒng)檢測每組細(xì)胞的熒光素酶活性，計算公式：相對熒光值=螢火蟲熒光素酶熒光值/海腎熒光素酶熒光值。

1.11統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS17.0軟件行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1miR-16在肺癌細(xì)胞株及正常胚肺細(xì)胞中的表達(dá) miR-16在A549、H1050、H1299、NCI-H520、NCI H596及MIRC-5中的表達(dá)分別為(0.38±0.03)、(1.35±0.01)、(1.10±0.11)、(1.43±0.14)、(1.56±0.15)、(2.38±0.25)。與MIRC-5比較，肺癌細(xì)胞中miR-16表達(dá)量下調(diào)(P<0.01)，且在A549細(xì)胞中下調(diào)程度最高，因此選為后續(xù)實驗研究對象。

2.2miR-16 mimics轉(zhuǎn)染效果的檢測 miR-16 mimics和miR-16 NC轉(zhuǎn)染48 h后，與miR-16 NC組(0.36±0.03)比較，miR-16 mimics組中miR-16表達(dá)量(1.89±0.12)顯著上調(diào) (P<0.01)。

2.3miR-16 mimics對A549細(xì)胞活力及細(xì)胞克隆能力的影響 miR-16 mimics和miR-16 NC轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞24、48、72 h后，與miR-16 NC組比較，不同轉(zhuǎn)染時間點miR-16 mimics組細(xì)胞活力均顯著降低(P<0.01)。在轉(zhuǎn)染48 h后，與miR-16 NC組(120.52±12.29)比較，miR-16 mimics組(32.46±3.28)細(xì)胞克隆形成數(shù)目顯著減少(P<0.01)。見圖1，圖2。

與miR-16 NC比較:1)P<0.01圖1 miR-16 mimics對A549細(xì)胞活力的影響

圖2 miR-16 mimics對A549細(xì)胞克隆形成能力的影響

2.4miR-16 mimics對A549細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的影響 miR-16 mimics和miR-16 NC轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞48 h后，與miR-16 NC組比較，miR-16 mimics組細(xì)胞凋亡率顯著提高(P<0.01)，且細(xì)胞周期阻滯于G1期 (P<0.01)。見圖3，表1。

圖3 miR-16 mimics對A549細(xì)胞凋亡的影響(×200)

組別細(xì)胞凋亡率細(xì)胞周期G1期S期G2期miR-16 NC組5.48±0.5548.21±4.8232.84±3.6818.95±1.90miR-16 mimics組39.63±3.961)62.35±6.231)16.10±1.611)21.55±2.151)

與miR-16 NC組比較：1)P<0.01

2.5熒光素酶報告基因分析 miR-16 mimics+pGL3 YAP1 3′UTR-Wt組的熒光強(qiáng)度低于其他轉(zhuǎn)染組(P<0.01)，且另外三組間熒光強(qiáng)度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.6miR-16 mimics對A549細(xì)胞中YAP1蛋白及mRNA表達(dá)量的影響 miR-16 mimics和miR-16 NC轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞48 h后，與miR-16 NC組(0.98±0.08，0.95±0.05)比較，miR-16 mimics組YAP1蛋白(0.14±0.01)及mRNA(0.10±0.01)表達(dá)量顯著下調(diào)(P<0.01)。見圖4。

圖4 miR-16 mimics對A549細(xì)胞中YAP1 mRNA及 蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

miRNA是一類高度保守的與靶基因3′UTR區(qū)域特異性結(jié)合的小RNA分子，其基因組常處于腫瘤基因的脆性區(qū)，因此常作為促癌miRNA或者抑癌miRNA參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展〔3，4〕。miR-16基因組定位于13q14.3，是首個被發(fā)現(xiàn)與腫瘤密切相關(guān)的miRNA。miR-16在血液系統(tǒng)腫瘤、肺癌、乳腺癌、肝癌等腫瘤組織或血液中低表達(dá)，并成為上述癌癥早期診斷的有效指標(biāo)〔6，7〕。但miR-16在肺癌中的具體作用尚不明確。

本研究結(jié)果表明肺腺癌細(xì)胞株A549、H1050、H1299，肺鱗癌細(xì)胞株NCI-H520、NCI H596中miR-16表達(dá)量均顯著低于MIRC-5，此結(jié)果與miR-16在肺癌中的表達(dá)趨勢一致〔5〕，也與miR-16在其他腫瘤細(xì)胞株中的表達(dá)趨勢類似〔8～10〕，提示miR-16在肺癌中起抑癌作用。同時，本研究結(jié)果表明miR-16 mimics能顯著誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡，與miR-16 mimics在膠質(zhì)瘤細(xì)胞、胃癌細(xì)胞中作用效果一致〔8，10〕，從而說明miR-16 mimics能顯著抑制A549細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。腫瘤細(xì)胞的無限增殖源自于細(xì)胞周期的紊亂與不可控制，特別是細(xì)胞周期調(diào)控點G1、S、G2，已經(jīng)成為眾多抗癌藥物的作用靶點之一〔11，12〕。本研究結(jié)果也表明miR-16 mimics能顯著阻滯A549細(xì)胞周期于G1期。

miRNA在腫瘤細(xì)胞中主要通過調(diào)控下游靶基因的轉(zhuǎn)錄發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)〔8，9〕。本研究前期通過靶基因預(yù)測軟件miRanda發(fā)現(xiàn)了YAP1可能是miR-16的靶基因之一，miR-16與YAP1的3′UTR區(qū)域可能互補(bǔ)，因此本研究對此展開了進(jìn)一步的驗證。YAP1蛋白是YAP1基因的編碼產(chǎn)物，是一種富含脯氨酸的磷蛋白，含有8種異構(gòu)體，是Hippo信號通路中的關(guān)鍵一員，在包括肺癌在內(nèi)的多種腫瘤組織中高表達(dá)。YAP1通過Hippo信號通路參與細(xì)胞的生長、分化與凋亡等生物學(xué)過程〔13〕。YAP1在正常生理條件下不表達(dá)或者低表達(dá)，在被上游信號激活后，能夠極大加速細(xì)胞的增殖及惡性轉(zhuǎn)化。目前對YAP1的了解還有限制，已報道YAP1能與miRNA相互作用進(jìn)而發(fā)揮功能〔14〕。本研究利用熒光素酶報告基因證實了miR-16能夠特異性結(jié)合于YAP1的3′UTR區(qū)域，使熒光強(qiáng)度降低；同時，RT-PCR及Western印跡結(jié)果也說明miR-16能夠負(fù)性調(diào)控YAP1表達(dá)，二者存在靶向調(diào)控關(guān)系。有研究表明沉默YAP1表達(dá)能顯著抑制A549細(xì)胞增殖〔15〕，進(jìn)而說明上調(diào)miR-16表達(dá)負(fù)性調(diào)控YAP1表達(dá)能夠顯著抑制A549細(xì)胞增殖。

綜上所述，miR-16在肺癌細(xì)胞株中低表達(dá)，上調(diào)miR-16表達(dá)能顯著降低A549細(xì)胞活力及細(xì)胞克隆數(shù)目，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，阻滯細(xì)胞周期于G1期，是通過靶向下調(diào)YAP1表達(dá)實現(xiàn)的。