加味蘇子降氣湯對(duì)哮喘模型大鼠細(xì)胞因子功能紊亂的調(diào)節(jié)

方寧 劉娟花

(1咸陽(yáng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，陜西 咸陽(yáng) 712046；2陜西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院)

哮喘是由多種細(xì)胞(以肥大細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞浸潤(rùn)為主)和細(xì)胞組分參與的慢性氣道炎癥性疾病，以氣道高反應(yīng)及慢性氣道炎性反應(yīng)為主要特征。加味蘇子降氣湯對(duì)哮喘患者在緩解癥狀、降低副作用等方面均有較好的療效。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀(guān)察加味蘇子降氣湯對(duì)哮喘大鼠體內(nèi)細(xì)胞因子水平的影響及對(duì)免疫網(wǎng)絡(luò)的調(diào)節(jié)，進(jìn)一步探討加味蘇子降氣湯治療腎陽(yáng)虛證哮喘的免疫機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)SD大鼠,雄性,40只，體重(160±20)g，月齡6～9個(gè)月，由西安交大實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)前于實(shí)驗(yàn)室正常飼養(yǎng)1 w，分籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食進(jìn)水，飼料由西安交大實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心統(tǒng)一提供，為標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料。飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室采光、通風(fēng)良好，室溫約25℃。

1.2藥物及試劑 加味蘇子降氣湯由紫蘇子、半夏、當(dāng)歸、前胡、厚樸、肉桂、甘草等中藥組成，購(gòu)于陜西中醫(yī)藥大學(xué)校醫(yī)院。采用自動(dòng)煎藥機(jī)煎藥，密封包裝，每包100 ml，每毫升含生藥 1 g。哮喘模型致敏劑卵清白蛋白(OVA)，Sigma公司產(chǎn)品(分裝)；氫氧化鋁，購(gòu)于天津市博迪化工有限公司；滅活百日咳桿菌疫苗來(lái)自上海生物制品研究所；靈芝孢子粉，購(gòu)自陜西大至醫(yī)藥有限公司。白細(xì)胞介素(IL)-4、干擾素(IFN)-γ檢測(cè)所用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒購(gòu)于武漢博士德公司。

1.3主要器材 FAl004N電子天平，上海精密科學(xué)儀器公司；CC2170A超聲霧化器，成都維信電子科大新技術(shù)有限公司；SHHW21-600電熱恒溫水箱，天津市泰斯特有限公司；RT-2100C酶標(biāo)分析儀，深圳雷杜電子有限公司。

1.4動(dòng)物分組及哮喘模型制造 大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、哮喘模型組、加味蘇子降氣湯組和地塞米松組，每組10只。除正常對(duì)照組外，其余3組參照文獻(xiàn)〔1〕制造哮喘模型。首先進(jìn)行致敏，分別于第1、7天經(jīng)腹腔及四肢末端注射致敏液1 ml(含OVA 0.1 g，氫氧化鋁0.1 g，百日咳桿菌原液5×109個(gè)/ml)；于第14天開(kāi)始，將模型大鼠置于密閉容器內(nèi)，霧化吸入1% OVA溶液，1次/d，20 min/次，持續(xù)霧化吸入5 d，隨后減為隔日1次霧化，執(zhí)行至第28天。哮喘模型激發(fā)成功的標(biāo)志：每次霧化時(shí)，大鼠出現(xiàn)抖毛、咳嗽、腹式呼吸、煩躁，甚至跌倒、抽搐等表現(xiàn)。正常對(duì)照組給予生理鹽水代替致敏液進(jìn)行致敏，致敏方式和方法同其余3組。

1.5用藥 地塞米松組、加味蘇子降氣湯組于激發(fā)第1天開(kāi)始給藥。劑量：地塞米松組給予地塞米松 0.25 mg·kg-1·d-1，加味蘇子降氣湯組給予加味蘇子降氣湯2 ml·kg-1·d-1；正常對(duì)照組、哮喘模型組給予生理鹽水2 ml·kg-1·d-1。給藥方式均為灌胃。

1.6標(biāo)本采集與檢測(cè) 將實(shí)驗(yàn)大鼠按1.5 g/kg腹腔注射20%烏拉坦溶液，麻醉。肺泡灌洗法參照文獻(xiàn)〔2〕，將大鼠固定在手術(shù)板上，常規(guī)消毒，剪開(kāi)頸部皮膚，鈍性分離，暴露氣管，用手術(shù)線(xiàn)結(jié)扎左肺，在頸部暴露氣管做一橫切口，將圓頭7號(hào)針頭進(jìn)針約1.0 cm,以“0”號(hào)手術(shù)線(xiàn)結(jié)扎固定，對(duì)右肺用生理鹽水(37℃)3 ml進(jìn)行支氣管肺泡灌洗，每次保留30 s后抽出，如此反復(fù)3次,動(dòng)作宜輕柔，肺泡灌洗液回收總量約8 ml，3 000 r/min離心15 min，取上清液放入Eppendof管中待測(cè)。采用ELISA檢測(cè)肺泡灌洗液中IL-4、IFN-γ水平操作參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0 軟件行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

哮喘模型組肺泡灌洗液中IL-4含量明顯高于正常對(duì)照組，IFN-γ含量明顯低于正常對(duì)照組，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與哮喘模型組相比，加味蘇子降氣湯組、地塞米松組肺泡灌洗液中IL-4水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，IFN-γ水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。加味蘇子降氣湯組與地塞米松組IL-4、IFN-γ水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組肺泡灌洗液中IL-4、IFN-γ 水平比較

與正常對(duì)照組比較：1)P<0.01；與哮喘模型組比較：2)P<0.05

3 討 論

哮喘是與免疫功能紊亂相關(guān)的氣道慢性炎癥性疾病〔3,4〕。此外，分子免疫學(xué)深入研究發(fā)現(xiàn)，輔助性T細(xì)胞(Th)亞群Th1和Th2之間存在著交互調(diào)節(jié)的關(guān)系，Th1/Th2失衡是哮喘發(fā)病的重要免疫學(xué)機(jī)制〔5〕，Th2分泌的細(xì)胞因子IL-4可誘發(fā)哮喘患者體內(nèi)免疫球蛋白(Ig)E的生成。哮喘患者體內(nèi)IL-4異常增高，Th2型免疫反應(yīng)過(guò)高；哮喘患者體內(nèi)Th1降低，IFN-γ生成低下，使IgE生成增加。Th1和Th2相互拮抗調(diào)節(jié)機(jī)體正常的免疫應(yīng)答。Th1分泌的細(xì)胞因子IFN-γ能抑制哮喘發(fā)作〔6〕。

哮喘大多自幼發(fā)病，先天不足是其根本，其中又有部分在中年以后，因腎中陽(yáng)氣漸虧而哮喘宿疾復(fù)發(fā)。腎陽(yáng)虧虛是哮喘宿根形成之本〔7〕。蔣朱秀等〔8〕用相同方法致敏的哮喘模型實(shí)驗(yàn)中，哮喘模型組大鼠血清中T 降低，證實(shí)哮喘模型大鼠有腎陽(yáng)虛證及相關(guān)癥候。蘇子降氣湯源自《太平惠民和劑局方》，是中醫(yī)學(xué)治療“上實(shí)下虛”型哮喘的名方；加味蘇子降氣湯在此基礎(chǔ)上，加大了溫補(bǔ)腎陽(yáng)的功效〔9〕。方中紫蘇子、半夏、當(dāng)歸、前胡、厚樸、肉桂、甘草等諸藥合用可有效鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘，作用大且分散,水溶性強(qiáng)，起效快，鎮(zhèn)咳作用可直達(dá)咳嗽中樞，鎮(zhèn)咳成分為生物堿〔10〕。最終方劑通過(guò)下調(diào)IL-4、上調(diào)IFN-γ水平達(dá)到調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞因子平衡的目的。Th1/Th2模式與中醫(yī)學(xué)的陰陽(yáng)學(xué)說(shuō)、虛實(shí)證候、臟象學(xué)說(shuō)等均有密切關(guān)系，細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)可能是中醫(yī)證候的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。故研究Th1/Th2失衡和IgE分泌是防治哮喘的新途徑〔11,12〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示加味蘇子降氣湯能明顯降低哮喘大鼠IL-4含量，升高IFN-γ水平，改善Th1/Th2失衡，從而達(dá)到防治哮喘的作用。