遠(yuǎn)志皂苷元對內(nèi)皮祖細(xì)胞移植治療急性心肌梗死模型大鼠心功能的影響

靳文學(xué) 喬秀蘭

(重慶市中醫(yī)院 1心血管科，重慶 400021；2針灸科)

急性心肌梗死(AMI)是全球發(fā)病率較高的一種疾病，外科手術(shù)和介入治療是AMI目前主要臨床傳統(tǒng)療法，此兩種療法均旨在重新建立血供，但對損傷的心肌組織和細(xì)胞并無修復(fù)效果。內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)是與血管新生有關(guān)的骨髓干細(xì)胞亞群〔1〕，國內(nèi)外諸多研究已經(jīng)表明，EPCs在重建血供〔2〕、促進(jìn)缺血性組織血管新生〔3〕，向心肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等細(xì)胞的分化〔4,5〕、緩解內(nèi)皮功能障礙的肺動(dòng)脈高壓〔6〕及腫瘤防治等方面有卓越表現(xiàn)。在AMI治療方面，EPCs移植也表現(xiàn)出了令人滿意的療效，EPCs移植可促進(jìn)血管重建，改善心臟功能；向毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞分化，促進(jìn)心肌梗死的恢復(fù)，改善心臟功能〔7～9〕。遠(yuǎn)志是我國傳統(tǒng)的藥材，其主要的活性組分有皂苷類、黃酮類、寡糖酯和生物堿等。遠(yuǎn)志皂苷元是其藥理作用的主要活性成分之一，其在抗氧化、抑制炎癥、抗衰老及抗細(xì)胞毒性方面療效卓著〔10〕。在AMI進(jìn)程中，心肌缺血再灌注會加劇內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，引發(fā)心肌細(xì)胞凋亡，加重心肌梗死危害〔11〕，李子希等〔12〕研究表明，遠(yuǎn)志皂苷元可通過緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激保護(hù)心肌。此外，遠(yuǎn)志皂苷元可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和活化，抑制內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡〔13～16〕。據(jù)此推測，遠(yuǎn)志皂苷元可提高EPCs移植的作用效果，然而目前遠(yuǎn)志皂苷元對EPCs移植治療心肌梗死大鼠影響的研究尚為空白。本文旨在探討遠(yuǎn)志皂苷元干預(yù)和EPCs移植聯(lián)合治療對AMI大鼠心功能的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 80只體重300～350 g健康SD大鼠(2.5月齡左右，雄性)由重慶醫(yī)科大學(xué)提供，室溫25℃，濕度50%～80%，SPF環(huán)境下自由飲水和采食，許可證號：SCXK(渝)2012-0001。

1.2主要材料 實(shí)驗(yàn)所用顯微鏡均由上海儀圓光學(xué)提供，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)購自北京化學(xué)試劑集團(tuán)有限公司；胰蛋白酶購自美國Sigma公司；磷酸鹽緩沖液(PBS)由Hyclone提供；細(xì)胞培養(yǎng)箱購自Heraeus Sepatech 公司。外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院提供。EBM-2培養(yǎng)基、胎牛血清均購自Hyclone；Trizol試劑盒購自Invitrogen；聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白濃度試劑盒(增強(qiáng)型)、5×十二烷基磺酸鈉(SDS)蛋白上樣緩沖液、20×三乙醇胺緩沖鹽水(TBS)緩沖液等購自南京建成生物。SP-DiI染料購自北京大清生物技術(shù)有限公司；血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)抗體購于北京百邁客生物科技有限公司，β-actin抗體購于艾康生物技術(shù)(杭州)有限公司。生理鹽水從上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院購進(jìn)。超凈工作臺提供自藝斯高上海貿(mào)易有限公司。熒光染色溶液的配制：將2.5 g SP-Dil染料用1 L的二甲基酰胺(DMF)溶解。遠(yuǎn)志皂苷元購自上海誠凜生物科技有限公司。

1.3建立大鼠模型及實(shí)驗(yàn)分組 取80只SD雄性大鼠建立AMI模型：麻醉大鼠，氣管插管進(jìn)行機(jī)械通氣并密切監(jiān)測心電變化。對所有實(shí)驗(yàn)大鼠開胸，辨認(rèn)并結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支近段，以結(jié)扎冠狀動(dòng)脈后心肌顏色變暗、心臟變大、左室前壁局部心肌運(yùn)動(dòng)明顯減弱及心電圖ST段抬高為標(biāo)準(zhǔn)判定AMI模型建立成功與否。判定后縫合大鼠胸部切口后將之放回籠中飼養(yǎng)，將實(shí)驗(yàn)大鼠平均隨機(jī)分為四組：AMI對照組(組Ⅰ)、遠(yuǎn)志皂苷元治療組(組Ⅱ)、EPCs移植組(組Ⅲ)、EPCs移植聯(lián)合遠(yuǎn)志皂苷元治療組(組Ⅳ)，各20只。

1.4體外復(fù)蘇并培養(yǎng)擴(kuò)增大鼠外周血EPCs 將凍存原代EPCs置于60℃恒溫水浴箱，30 s內(nèi)進(jìn)行EPCs快速復(fù)蘇。融化之后迅疾轉(zhuǎn)入EP管并加入EBM-2培養(yǎng)基，重復(fù)小心吹打細(xì)胞使其均勻分布，隨后離心棄上清液。將復(fù)蘇后的細(xì)胞用EBM-2完全培養(yǎng)基調(diào)整為1×106/ml的密度。進(jìn)行培養(yǎng)待EPCs匯合度達(dá)80%以上時(shí)，胰蛋白酶溶液消化2～3 min后終止消化；離心棄上清重懸細(xì)胞。調(diào)整細(xì)胞密度至1×106/ml培養(yǎng)7 d。離心棄上清，將EPC細(xì)胞密度調(diào)整為8×105/ml，加入5 μl CM-Dil標(biāo)記細(xì)胞；隨后置于培養(yǎng)箱中標(biāo)記孵化25～30 min后離心棄上清PBS重懸，重復(fù)標(biāo)記兩次，顯微鏡下觀察細(xì)胞標(biāo)記的情況。鏡下可見EPCs標(biāo)記顯現(xiàn)出鮮艷的橘紅色，且顏色均勻，備用。實(shí)驗(yàn)大鼠建模1 h之后，進(jìn)行EPCs移植和遠(yuǎn)志皂苷元干預(yù)治療。將100 μl CM-Dil標(biāo)記好的EPCs細(xì)胞懸液分5點(diǎn)分別注射到組Ⅲ及組Ⅳ心肌梗死區(qū)域的邊緣，尾靜脈注射100 μl生理鹽水；將100 μl生理鹽水分5點(diǎn)分別注射組Ⅱ大鼠心肌梗死區(qū)邊緣，組Ⅱ和組Ⅳ尾靜脈注射3 mg/ml遠(yuǎn)志皂苷元溶劑；分別于組Ⅰ心肌梗死區(qū)域邊緣和尾靜脈注射與上述EPCs混懸液和遠(yuǎn)志皂苷元試劑相同體積的生理鹽水；連續(xù)治療3 d。

1.5超聲心動(dòng)圖檢測大鼠心功能改變及毛細(xì)血管密度 EPCs移植后3 w及6 w，分別從各個(gè)實(shí)驗(yàn)組選取5只大鼠進(jìn)行心功能變化測定。采用超聲診斷儀記錄3個(gè)心動(dòng)周期左室收縮末期內(nèi)徑(LVDs)、左室舒張末期內(nèi)徑(LVDd)、左室前壁舒張末期厚度(LVAWd)、左室舒張末期容積(EDV)、收縮末期容積(ESV)并計(jì)算左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)的平均值。于移植后3 w和6 w，處死大鼠迅速打開其胸腔，剝離出大鼠心肌梗死組織將之分為3份：1份置于液氮中備用；1份石蠟組織制片備用免疫組化染色；1份冰凍組織切片備用蘇木精-伊紅染(HE)染色。對心肌梗死組織進(jìn)行石蠟包埋組織切片，CD34免疫組化染色并于顯微鏡下計(jì)數(shù)平均毛細(xì)血管密度。

1.6逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)及酶聯(lián)免疫吸附測定梗死周邊區(qū)VEGF基因及蛋白的表達(dá) 研磨勻漿大鼠心肌梗死組織并提取組織的總RNA，通過Primer Primer5.0軟件設(shè)計(jì)引物，VEGF引物序列上游：5′-AGAAGGAGGAGGGCAGAATCA-3′；下游：5′-CAAATGCTTTCTCCGCTCTGA-3′，目的片段長度326 bp；參照物β-actin引物序列上游：5′-ACTCCTGCTTGCTGATCCACATC-3′；下游5′-AGCGGGAAATCGTGCGTGCGTGAC-3′，片段長度為471 bp。反應(yīng)后瓊脂糖凝膠電泳并成像儀攝片，用Image proplus6.0圖像分析軟件測算電泳條帶的OD值，進(jìn)而計(jì)算其相對表達(dá)量。取大鼠心肌梗死區(qū)域組織勻漿液，4 000 r/min離心取組織上清液，用ELISA試劑盒(購自南京建成生物有限公司)測定VEGF含量。根據(jù)免疫顯色反應(yīng)的當(dāng)量關(guān)系可知實(shí)驗(yàn)大鼠心肌梗死組織的VEGF水平。

1.7熒光顯微鏡觀察心肌內(nèi)移植內(nèi)皮祖細(xì)胞EPCs 干預(yù)治療3 w和6 w之后制作大鼠心肌梗死組織冰凍切片并進(jìn)行4′，6-二脒基-2苯基吲哚染色。干燥后，顯微鏡下觀察時(shí)，隨機(jī)選取每張冷凍切片的3個(gè)視野并且對之進(jìn)行拍照記錄；假設(shè)每張照片的總亮度為1，每張照片選取一個(gè)光亮度點(diǎn)，利用ACDsee5.0軟件確定其坐標(biāo)值。隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)CM-Dil陽性細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞總數(shù)，計(jì)算標(biāo)記率。標(biāo)記率=視野內(nèi)陽性細(xì)胞總數(shù)/視野內(nèi)細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.8大鼠心肌修復(fù)情況 取出大鼠心肌梗死組織，10%甲醛固定組織；梯度酒精脫水，逐漸脫去組織塊中的水分。再將組織塊置于既溶于酒精，又溶于石蠟的透明劑二甲苯中透明，以二甲苯替換出組織塊的中酒精，隨后進(jìn)行浸蠟包埋。將包埋好的蠟塊固定于切片機(jī)上，切成5～8 μm薄片。將薄片燙平，再貼到載玻片上，45℃恒溫烘干。脫蠟后，進(jìn)行HE染色。染色后的切片經(jīng)純酒精脫水，再經(jīng)二甲苯使切片透明。將已透明的切片滴上加拿大樹膠，蓋上蓋玻片封固。待樹膠干燥后，熒光顯微鏡下觀察各組心肌梗死組織的病理學(xué)變化。于治療后3 w和6 w，選取各個(gè)實(shí)驗(yàn)組5只大鼠麻醉處死，立即取出大鼠的心臟于液氮凍存30 min。隨后取長軸垂直方向1～2 mm切片，以2，3，5-三蘇基氨化四氮唑(TTC)染色法計(jì)算心肌梗死面積〔17〕。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、方差分析。

2 結(jié) 果

2.1EPCs形態(tài)觀察 冷凍保存的EPCs復(fù)蘇后重懸于新鮮的EPCs細(xì)胞培養(yǎng)液中，多數(shù)細(xì)胞生長良好。培養(yǎng)5～6 d發(fā)現(xiàn)細(xì)胞明顯增殖即可傳代，移植后2 w細(xì)胞呈平形排列或漩渦狀集落生長，排列緊密；傳代后的細(xì)胞傳至第3代細(xì)胞生長迅速，純度高、 形態(tài)單一(圖1)。選取第3代細(xì)胞進(jìn)入實(shí)驗(yàn)。

2.2大鼠心功能改變檢測結(jié)果 在細(xì)胞移植和藥物干預(yù)3 w及6 w后，與組Ⅰ相比，組Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ心功能和左室收縮舒張功能明顯改善(P<0.05)；組Ⅳ較組Ⅱ、Ⅲ顯著提高了大鼠的心臟功能和左心室的舒縮能力(P<0.05)。見表1。

圖1 第3代 EPCs的形態(tài)(×200)

組別移植后3 wLVAWd(cm)LVDs(cm)LVDd(cm)ESV(ml)EDV(ml)EF(%)FS(%)組Ⅰ0.14±0.020.53±0.110.63±0.120.32±0.210.56±0.2646.42±9.4323.21±6.17組Ⅱ0.11±0.021)0.48±0.101)0.66±0.081)0.25±0.201)0.70±0.251)65.72±8.241)32.71±6.421)組Ⅲ0.10±0.031)0.47±0.111)0.69±0.101)0.24±0.181)0.71±0.241)65.80±7.921)32.78±6.751)組Ⅳ0.08±0.021)2)3)0.37±0.081)2)3)0.72±0.111)2)3)0.16±0.091)2)3)0.87±0.221)2)3)75.89±4.661)2)3)42.75±7.351)2)3)組別移植后6 wLVAWd(cm)LVDs(cm)LVDd(cm)ESV(ml)EDV(ml)EF(%)FS(%)組Ⅰ0.15±0.030.57±0.090.65±0.140.31±0.160.58±0.2249.54±8.5625.12±6.23組Ⅱ0.13±0.031)0.52±0.081)0.68±0.121)0.25±0.171)0.72±0.231)69.45±9.052)35.65±7.061)組Ⅲ0.12±0.041)0.51±0.091)0.69±0.131)0.24±0.151)0.73±0.221)69.89±9.341)35.86±7.341)組Ⅳ0.10±0.031)2)3)0.41±0.061)2)3)0.74±0.121)2)3)0.17±0.161)2)3)0.85±0.221)2)3)77.25±8.441)2)3)47.34±7.661)2)3)

與組Ⅰ比較：1)P<0.05;與組Ⅱ比較：2)P<0.05;與組Ⅲ比較：3)P<0.05，下表同

2.3毛細(xì)血管密度的測定 與組Ⅰ相比，治療3 w后組Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ均顯著增加了心肌梗死組織中的新生毛細(xì)血管密度，組Ⅳ較組Ⅲ明顯增高(P<0.05)。治療6 w后，各組新生毛細(xì)血管密度均較治療3 w后顯著增加，而組Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ均顯著高于組Ⅰ(P<0.05)，組Ⅳ效果最佳。見表2。

2.4VEGF基因和蛋白的表達(dá) 與組Ⅰ相比，治療3 w后組Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ心肌梗死組織中VEGF mRNA和蛋白相對表達(dá)水平均顯著提高(P<0.05)，組Ⅳ顯著高于其他組(P<0.05)。在治療6 w后，各組心肌梗死組織中VEGF mRNA和蛋白相對表達(dá)水平較治療3 w明顯提高；組Ⅱ、Ⅲ VEGF mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著高于組Ⅰ(P<0.05)，而組Ⅳ明顯高于組Ⅱ、Ⅲ(P<0.05)。見表2和圖2。

表2 各組新生毛細(xì)血管密度、心肌梗死組織VEGF mRNA和蛋白表達(dá)水平及心肌梗死面積

圖2 各組VEGF mRNA和蛋白表達(dá)

2.5CM-Dil標(biāo)記陽性EPCs 治療3和6 w后，組Ⅱ和組Ⅰ未見CM-Dil標(biāo)記陽性EPCs；組Ⅳ與組Ⅲ可觀察到較多的CM-Dil標(biāo)記陽性EPCs，組ⅣCM-Dil陽性EPCs明顯多于組Ⅲ。見圖3。

2.6心肌修復(fù)情況 在干預(yù)治療3 w之后，組Ⅰ心肌組織發(fā)生了明顯的組織病理學(xué)變化，如心肌梗死區(qū)域內(nèi)肌纖維溶解、心肌肌組織發(fā)生斷裂，心肌細(xì)胞排列紊亂；治療各組心肌梗死組織形態(tài)學(xué)病變明顯緩解，心肌組織區(qū)域正常，心肌細(xì)胞排列較為整齊，有明顯的新生毛細(xì)血管存在；其中組Ⅳ心肌梗死狀況明顯好轉(zhuǎn)，新生毛細(xì)血管最多，心肌細(xì)胞排列整齊度最佳(圖4)。治療3 w和6 w后，與組Ⅰ相比，組Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的心肌梗死區(qū)域梗死面積顯著降低,組Ⅳ低于其他各組。見表2。

圖4 各組心肌修復(fù)情況(×200)

3 討 論

在心肌缺血早期，往往出現(xiàn)心肌肥大和心肌膠原瘢痕，隨之即發(fā)生心功能障礙，心肌舒縮能力下降和心肌壞死。EPCs是主要存在于機(jī)體骨髓中的干細(xì)胞亞群。在機(jī)體發(fā)生某種病理狀況時(shí)，骨髓中的EPCs被動(dòng)員進(jìn)入外周血循環(huán)系統(tǒng)，開始向病理組織遷移。與其他干細(xì)胞特性相似，EPCs具有向組織缺血或者內(nèi)皮損傷部位歸巢的特性，并最終黏附、結(jié)合在受損血管部位。在EPCs遷移歸巢過程中，VEGF等細(xì)胞因子發(fā)揮著重要作用。Miglionico等〔18〕通過對冠心病患者設(shè)置EPCs捕捉支架，取得了令人滿意的治療效果；這證明EPCs在心肌缺血性梗死部位的集聚對心肌梗死恢復(fù)具有重要作用。

國內(nèi)外諸多研究已經(jīng)表明，體外移植EPCs可顯著提高心肌梗死動(dòng)物的心臟功能，促進(jìn)新生血管的形成〔19，20〕。其主要機(jī)制可能是：(1)EPCs分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞并直接形成新的血管，重新構(gòu)建血液供應(yīng)；(2)旁分泌VEGF等，保護(hù)心肌梗死部位的損傷細(xì)胞；(3)EPCs還可與宿主的細(xì)胞相互融合，增強(qiáng)缺血區(qū)域的心肌細(xì)胞功能。然而，Yao等〔21〕研究顯示，體外移植的EPCs在宿主體內(nèi)存活時(shí)間有限，因此這限制了EPCs移植效果。Schuh等〔22〕和Sen等〔23〕通過適當(dāng)輔助性支持EPCs的移植，提高了EPCs的心肌梗死治療效果，改善了心肌梗死后的心臟功能。遠(yuǎn)志皂苷元可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖并抑制內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，據(jù)此推測其對于EPCs移植可能具有較好的輔助性支持效果。本研究結(jié)果顯示，EPCs體外移植后，遠(yuǎn)志皂苷元明顯提高了EPCs移植效率，增加了EPCs在心肌梗死組織的含量。這提示遠(yuǎn)志皂苷元還可通過提高EPCs在心肌梗死部位的存活率提高心肌梗死的治療效果。VEGF在正常人心肌中含量較低，但在冠狀動(dòng)脈疾病中則表達(dá)水平急劇升高；只是VEGF的受體表達(dá)水平也隨之提高，進(jìn)而提高了內(nèi)皮細(xì)胞增殖，放大了VEGF生物學(xué)效應(yīng)〔24〕。VEGF可以促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，促進(jìn)心肌血管的形成，增加血供〔24～26〕。此系因體外移植的EPCs及其分化而成的內(nèi)皮細(xì)胞分泌增加所致。

綜上，遠(yuǎn)志皂苷元干預(yù)提高了EPCs的移植效率，增加了EPCs在心肌梗死組織中的存留，進(jìn)而促進(jìn)心肌梗死恢復(fù)。遠(yuǎn)志皂苷元干預(yù)和EPCs移植的聯(lián)合治療提高了EPCs移植效率和治療效果，其主要通過促進(jìn)心臟功能恢復(fù)、緩解心肌組織病變、提高新生血管密度和VEGF的表達(dá)水平。遠(yuǎn)志皂苷元的干預(yù)對EPCs移植起到了明顯的輔助支持作用，并為該細(xì)胞移植治療心肌梗死開辟新的途徑和思路，但其機(jī)制尚需要進(jìn)一步探討。