肝癌干細(xì)胞抗原致敏的DC-CTL對肝癌的抑制作用

賈碩 孫艷 張穎宏 王宏竹 盛春華

(1中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院，湖南 長沙 410011；2解放軍第208醫(yī)院；3吉林大學(xué)第二醫(yī)院)

肝癌具有發(fā)病隱匿、易轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)及預(yù)后差等特征，患者生存期短，死亡率高，即使預(yù)后較好的小肝癌，術(shù)后也有超過70%的患者在2年內(nèi)發(fā)生復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，而高達(dá)90%以上的肝癌術(shù)后死亡因素與轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)有關(guān)〔1〕。研究證實(shí)，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、治療耐藥和容易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的根本原因在于患者體內(nèi)存在腫瘤干細(xì)胞(CSCs)〔2〕。CSCs雖然數(shù)量很少，但很難殺滅，常規(guī)放化療只能去除腫瘤組織中大多數(shù)增殖細(xì)胞，不能去除CSCs〔3〕。在殺滅大部分已分化的腫瘤細(xì)胞后(手術(shù)、放療、化療后)，再予以CSCs的靶向治療，將可能是腫瘤治療的新方案。肝癌手術(shù)后，殘存在血液、淋巴循環(huán)及組織中的CSCs是復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的根源〔4〕。CD133是目前比較明確的CSCs的表面標(biāo)志〔5〕，本研究篩選CD133+CSCs，制備裸鼠肝癌模型，再以CSCs為靶點(diǎn)，體外誘導(dǎo)擴(kuò)增樹突細(xì)胞(DC)和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)，觀察體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中CSCs抗原致敏的DC-CTL對肝癌的抑制作用，為CSCs的臨床靶向治療奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1主要材料試劑與儀器 GTT-551、DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基、人AB血清(Gibco公司)；細(xì)胞因子白細(xì)胞介素(IL)-2、干擾素(IFN)-γ、IL-1α、IL-4、粒細(xì)胞單核細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、腫瘤壞死因子(TNF)-α(美國Peprotech公司)；抗人CD3單克隆抗體、CD8單克隆抗體、小鼠抗人單克隆抗體CD133-PE(美國BD公司)；ClinicMacs流式細(xì)胞儀(美國Beckman Coulter公司)，全自動磁性細(xì)胞分選儀(德國Miltenyi公司)。BABL/c雄性裸小鼠(上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司)15只，4～5周齡，體重18～20 g。

1.2，CSCs的分選 明確診斷肝細(xì)胞性肝癌患者手術(shù)后取肝癌組織，用生理鹽水加入慶大霉素(100 U/ml)清洗，剪切組織塊，加入胰蛋白酶液置于37℃孵箱中消化，并間斷用攪拌棒攪拌，消化4 h，用200目濾篩過濾，重新制備成單細(xì)胞懸液，加生理鹽水離心800 r/min 10 min，2次，應(yīng)用高糖DMEM培養(yǎng)基加8%人AB血清接種于6孔板中，密度2×106/ml。嚴(yán)格應(yīng)用磁珠分選系統(tǒng)說明書進(jìn)行細(xì)胞分選操作。制備肝癌單細(xì)胞懸液，與CD133抗體磁珠進(jìn)行交聯(lián)后過分離柱進(jìn)行分選，收集CD133+細(xì)胞，制備成CSCs單細(xì)胞懸液備用。

1.3流式細(xì)胞技術(shù)測定CSCs 取分選前的肝癌細(xì)胞懸液和分選后的CD133+細(xì)胞懸液，分別加入2 ml圓底離心管中，離心1 500 r/min，5 min，棄上清液。加入磷酸鹽緩沖液(PBS) 1 ml離心洗滌1次，棄上清。調(diào)整細(xì)胞濃度，加入Fc受體封閉劑，4℃避光反應(yīng)10 min。離心，棄上清液。用PBS 1 ml洗滌1次，離心。分別加入CD133-PE抗體，將上述2份細(xì)胞放在冰盒里避光孵育30 min，用1 ml含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清PBS洗滌2次，應(yīng)用流式細(xì)胞儀分析測定CD133+細(xì)胞。

1.4CSCs和肝癌細(xì)胞抗原的獲得 分別收集CSCs和肝癌細(xì)胞，用PBS調(diào)整密度為5×106/ml，細(xì)胞被反復(fù)凍融(-196～37℃)，循環(huán)4次。細(xì)胞裂解物經(jīng)12 000 r/min離心5 min，取上清經(jīng)濾器除菌后按Bradford蛋白濃度測定試劑盒說明書所示方法測量、計(jì)算抗原的蛋白濃度，分裝后-70℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5分別培養(yǎng)CSCs和肝癌細(xì)胞抗原致敏的DC-CTL

1.5.1外周血單個(gè)核細(xì)胞分別誘導(dǎo)擴(kuò)增DC和細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(CIK) 肝癌患者(與上文獲得肝癌干細(xì)胞為同一患者)手術(shù)1個(gè)月后，應(yīng)用血液成分分離機(jī)進(jìn)行單個(gè)核細(xì)胞單采，經(jīng)Ficoll淋巴細(xì)胞分離液從單個(gè)核細(xì)胞分離淋巴細(xì)胞。用GTT-551培養(yǎng)基洗滌2次，用GTT-551培養(yǎng)基加入6%人AB血清混懸于培養(yǎng)瓶中，置37℃、5%CO2孵育箱中，2 h后將懸浮細(xì)胞移出進(jìn)行CIK培養(yǎng)，貼壁細(xì)胞進(jìn)行DC培養(yǎng)。

1.5.2CSCs和肝癌細(xì)胞抗原致敏的DC培養(yǎng) 貼壁細(xì)胞加入IL-4(500 U/ml)，GM-CSF(1 000 U/ml)培養(yǎng)，每隔2～3 d換液1次，第6天分別加入CSCs和肝癌細(xì)胞抗原100 μg/ml，第7天加入TNF-α(500 U/ml)誘導(dǎo)DC成熟，第9天分別收獲成熟DC細(xì)胞。

1.5.3CIK培養(yǎng) 懸浮淋巴細(xì)胞加入重組人IFN-γ(1 000 U/ml)和10%AB型人血清的GTT-551培養(yǎng)液，24 h后更換成含100 ng/ml小鼠抗人CD3單克隆抗體、IL-1α(1 000 U/ml)和 IL-2(500 U/ml)的完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，2 d后換含IL-2(500 U/ml)的完全培養(yǎng)液隔日換液維持培養(yǎng)9 d。

1.5.4分選CTL 參照ClincMacs使用說明，加入CD3、CD8抗體磁珠，應(yīng)用CliniMacs流式細(xì)胞儀從誘導(dǎo)擴(kuò)增的CIK中分選出CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞。

1.5.5抗原致敏后的DC與CTL共培養(yǎng)，獲得DC-CTL 細(xì)胞培養(yǎng)第9天，分別取CSCs和肝癌細(xì)胞抗原致敏后的DC，經(jīng)活細(xì)胞計(jì)數(shù)后，按1∶5分別與CD3+CD8+T細(xì)胞混合培養(yǎng)，每2天加入IL-2(500 U/ml)半量換液，5 d后收集，獲得分別CTL。細(xì)胞質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞存活率≥95%，不含細(xì)菌、病毒和內(nèi)毒素等微生物。

1.6檢測抗原致敏的DC-CTL對裸鼠肝癌的抑瘤作用

1.6.1造模 將生長狀態(tài)良好的人CSCs制備成為單細(xì)胞懸液，以1×106/只，注射到BABL/c裸小鼠右側(cè)腋下，每天觀察小鼠的飲食及精神狀態(tài)，8 d后可見小鼠右側(cè)腋下長出腫瘤，成瘤率為100%。

1.6.2分組實(shí)驗(yàn) 將無差異造模成功裸鼠隨機(jī)分為3組，每組5只：生理鹽水對照組，CSCs抗原致敏組，肝癌細(xì)胞抗原致敏組。3組分別給予尾靜脈注射：生理鹽水、CSCs抗原致敏的DC-CTL、肝癌細(xì)胞抗原致敏的DC-CTL。每次1×108/0.5 ml。每3 d治療1次，治療5次，末次治療2 w后處死裸鼠，剝出瘤塊，用電子天平稱取瘤重，計(jì)算抑瘤率。

1.6.3計(jì)算抑瘤率 抑瘤率(%)=(對照組平均腫瘤重量-實(shí)驗(yàn)組平均腫瘤重量)/對照組平均腫瘤重量×100%。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1流式細(xì)胞技術(shù)測定CSCs CD133表達(dá)達(dá)到98.4%，說明分選成功，得到的細(xì)胞基本為具有CD133+標(biāo)志的CSCs。

2.2抗原致敏DC培養(yǎng) DC培養(yǎng)至第9天在顯微鏡下觀察，DC呈圓形，貼壁生長，表面有樹突狀突起。應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)測定DC表面標(biāo)志，說明為成熟DC。

2.3CIK培養(yǎng) 流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞誘導(dǎo)擴(kuò)增前CD3+CD8+細(xì)胞含量約為48%，細(xì)胞誘導(dǎo)擴(kuò)增9 d，CIK中CD3+CD8+含量約達(dá)90%，并且細(xì)胞總數(shù)量隨誘導(dǎo)時(shí)間大幅擴(kuò)增，第1天CIK數(shù)量為(1.05±0.05)×106/ml，第7天CIK數(shù)量為(56.33±1.85)×106/ml，第9天CIK數(shù)量為(112.19±2.17)×106/ml，第9天擴(kuò)增100余倍。

2.4動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果 與生理鹽水對照組相比，無論是肝癌細(xì)胞抗原致敏組還是肝癌CSCs抗原致敏組對腫瘤都具有極顯著的抑制作用(P<0.01)，CSCs抗原致敏組較肝癌細(xì)胞抗原致敏組抑瘤率顯著增高(P<0.05)，見表1，說明CSCs抗原致敏的DC-CTL對肝癌具有更強(qiáng)的抑制作用。見圖1，表1。

圖1 抗原致敏的DC-CTL對裸鼠肝癌的抑制作用

組別瘤重量(g)抑瘤率(%)生理鹽水對照組6.918±1.6070.00肝癌細(xì)胞抗原致敏組3.679±1.05654.241)CSCs抗原致敏組2.502±0.83365.081)2)

與生理鹽水對照組比較：1)P<0.01；與肝癌細(xì)胞抗原致敏組比較：2)P<0.05

3 討 論

近年來隨著CSCs生物學(xué)研究的深入，CSCs揭示了肝癌的發(fā)生發(fā)展，普遍認(rèn)為CSCs是肝癌的種子細(xì)胞，在肝癌的增殖、轉(zhuǎn)移等多種重要生物學(xué)過程中具有決定性作用。對CSCs進(jìn)行有效抑制，可能是肝癌治療的關(guān)鍵〔6，7〕。研究認(rèn)為，CSCs對放化療耐藥，術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是患者最終死亡的主要原因，而CSCs逃脫免疫系統(tǒng)監(jiān)視清除是復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的根源。人體抗腫瘤免疫主要為細(xì)胞免疫，介導(dǎo)細(xì)胞免疫的主要是T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞。在T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫中CD3+CD8+細(xì)胞即效應(yīng)細(xì)胞毒性T細(xì)胞主要發(fā)揮識別和殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。肝癌患者往往細(xì)胞免疫功能低下，腫瘤免疫原性差，不能有效提呈給DC細(xì)胞，機(jī)體難以產(chǎn)生針對性的CD3+CD8+T細(xì)胞。CD133是CSCs明確的表面標(biāo)志。本研究根據(jù)CD133分子標(biāo)志從肝癌組織中篩選人CSCs，進(jìn)一步獲得CSCs抗原。從病人外周血中分離單個(gè)核細(xì)胞，分別誘導(dǎo)和擴(kuò)增人CSCs抗原致敏的DC和CIK。以CSCs為靶標(biāo)，通過MTT實(shí)驗(yàn)觀察其靶向性殺傷CSCs的作用。DC是人體內(nèi)功能最強(qiáng)大的抗原呈遞細(xì)胞，能有效激活初始T細(xì)胞，誘導(dǎo)出抗原特異性CTL，使機(jī)體產(chǎn)生抗腫瘤免疫反應(yīng)?？乖旅艉驞C的增殖活性和對抗原的識別作用均增強(qiáng)〔8〕。CIK是人體外周血單個(gè)核細(xì)胞在體外用多種細(xì)胞因子誘導(dǎo)而獲得的一種異質(zhì)性T細(xì)胞〔9〕，增殖能力強(qiáng)，短期培養(yǎng)后即可達(dá)到抗腫瘤效應(yīng)細(xì)胞的數(shù)量。CIK對腫瘤細(xì)胞的毒性是非主要組織相容性(MHC)限制的，并且對一般的腫瘤干細(xì)胞也具有細(xì)胞毒性〔10〕。它通過釋放細(xì)胞顆粒、激活腫瘤細(xì)胞凋亡基因、活化死亡受體caspase級聯(lián)反應(yīng)、分泌多種細(xì)胞因子抑制腫瘤細(xì)胞、間接調(diào)節(jié)免疫功能等機(jī)制，發(fā)揮其對腫瘤細(xì)胞廣譜、高效的殺傷作用。CIK富含大量CTL。通過臨床應(yīng)用級別的ClinicMacs流式細(xì)胞儀分選出CD3+CD8+的CTL細(xì)胞與DC共培養(yǎng)后，細(xì)胞間的相互作用能促進(jìn)二者的成熟和增殖，增加DC和共刺激分子遞呈抗原的特異性，促進(jìn)DC分泌IL-2〔12〕。本研究結(jié)果顯示，DC-CTL對肝癌細(xì)胞具有直接的殺傷作用。CSCs抗原致敏的DC-CTL對CSCs可能產(chǎn)生了靶向性的識別和殺傷作用，對于臨床患者手術(shù)后進(jìn)行CSCs的清除治療具有一定參考意義。