線紋香茶菜的組織培養(yǎng)與快速繁殖

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(廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院，廣州 510520)

唇形科(Lamiaceae)香茶菜屬(Rabdosia)植物線紋香茶菜[Rabdosialophanthoides(Buch.-Ham．Ex D．Don)H.Hara]，是中藥溪黃草的主要基原植物之一，為民間習(xí)用草藥，主產(chǎn)于云南、四川、江西、湖南、湖北、廣東、廣西、福建等省區(qū)[1]。常生于山谷中陰涼潮濕的溪流旁，其新鮮葉片揉碎后汁呈黃色而得名[2]。其性味苦、寒，歸肝、膽經(jīng)，具有涼血散瘀、清熱利濕、退黃等功效，主要用于治療急性膽囊炎、黃疸型肝炎、濕熱痢疾、腸炎、跌打瘀腫等。在廣東各地應(yīng)用普遍，是著名的嶺南特色中藥材。現(xiàn)已開發(fā)出多種保健品和中成藥，如消炎利膽片、復(fù)方膽通膠囊、溪黃草沖劑、溪黃草袋泡茶等，對(duì)護(hù)肝利膽、抗腫瘤有著顯著的作用。此外，溪黃草是廣式?jīng)霾璧闹匾煞郑菐X南地區(qū)的居民較常飲的涼茶之一[3]。

線紋香茶菜通常以扦插繁殖，由于扦插繁殖系數(shù)低，后代性狀不穩(wěn)定等制約了線紋香茶菜的推廣與發(fā)展。利用組培離體快繁技術(shù)，不僅能保持優(yōu)良品種的特性，而且能實(shí)現(xiàn)優(yōu)良品種在短期內(nèi)迅速地推廣種植，滿足市場需求。本試驗(yàn)采用植物組織培養(yǎng)技術(shù)對(duì)線紋香茶菜進(jìn)行無菌試管苗快速繁殖研究，可為工廠化育苗提供技術(shù)參考，也為線紋香茶菜的進(jìn)一步開發(fā)與利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

研究材料為2017年4月采集于廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院引種園的線紋香茶菜(R.lophanthoides)栽培植株的莖尖或腋芽的莖段。由中國科學(xué)院華南植物園鑒定專家葉華谷教授鑒定。憑證標(biāo)本存于廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院標(biāo)本館。

1.2 方 法

采用MS(Murashige and Skoog)基本培養(yǎng)基[4]，根據(jù)試驗(yàn)要求設(shè)置以下幾種培養(yǎng)基：

不定芽誘導(dǎo)和增殖培養(yǎng)基： 1) MS+6-BA 0 mg/L； 2) MS+6-BA 0.5 mg/L； 3) MS+6-BA 1.0 mg/L； 4) MS+6-BA 2.0 mg/L； 5) MS+6-BA 3.0 mg/L。生根培養(yǎng)基： 6) MS+NAA 0.2 mg/L； 7) 1/2 MS+NAA 0.2 mg/L。每個(gè)培養(yǎng)基均加入0.7%的瓊脂和4%的蔗糖，pH=5.9。培養(yǎng)溫度25～27 ℃，光照強(qiáng)度為28～35μmol/(m2·s)，光照時(shí)間為12 h/d。

將裁剪成1～2 cm的莖尖或帶節(jié)莖段裝入燒杯中清洗，先用自來水清洗2～3遍，滴入2～3滴洗潔精混勻后再清洗1～2次；然后用自來水清洗2～3次初步去除洗潔精殘液，再用約2滴吐溫80與自來水混勻，使材料浸泡其中，再用自來水徹底清除洗潔精殘液。然后將材料裝入干燥、無菌的消毒瓶中，在超凈工作臺(tái)上用0.1%升汞消毒10 min，無菌水清洗5次[5]，稍晾干，接種于增殖培養(yǎng)基1)、2)、3)、4)和5)上。

2 結(jié)果與分析

2.1 不定芽的誘導(dǎo)和增殖

接種約13 d后，陸續(xù)形成叢生芽。利用純MS培養(yǎng)基培養(yǎng)的外植體出芽率為70.0%，當(dāng)外加BA一定濃度范圍內(nèi)，出芽率隨著BA濃度的升高而增加。BA濃度為0.5 mg/L時(shí)出芽率為95.6%；BA濃度為1 mg/L以上時(shí)，出芽率均為100%。

單個(gè)外植體誘導(dǎo)芽的數(shù)量與BA濃度有著直接的聯(lián)系。BA濃度為0 mg/L時(shí)，芽數(shù)為2～3個(gè)，BA濃度為0.5 mg/L時(shí)，芽數(shù)達(dá) 6個(gè)以上；BA濃度為1 mg/L時(shí)，芽數(shù)達(dá)7個(gè)以上；BA濃度為2 mg/L時(shí)，出芽數(shù)僅4～5個(gè)；BA濃度為3 mg/L時(shí)，出芽數(shù)僅3～4個(gè)(表 1)，且后2種BA濃度長出的芽矮小，葉色淡綠，生長明顯受抑制。說明線紋香茶菜外植體附加BA的濃度，在一定低濃度(0～1 mg/L)范圍內(nèi)，隨著BA濃度的增加，對(duì)出芽數(shù)有一定的促進(jìn)作用；但 BA濃度高于3 mg/L時(shí)，出芽數(shù)反而下降，且對(duì)出芽生長有一定的抑制作用。因此，MS附加1 mg/L BA，對(duì)芽的誘導(dǎo)與生長較為適宜。

接種約30 d后在培養(yǎng)基 3)上的外植體再進(jìn)行增殖培養(yǎng)，增殖系數(shù)為4～5；接種在培養(yǎng)基 4)上的外植體能產(chǎn)生更多的芽，但是在幼苗基部形成的愈傷組織較松脆，易玻璃化。而培養(yǎng)基 5)上的外植體形成的愈傷更明顯，但大部分呈現(xiàn)白色玻璃化狀。說明線紋香茶菜組織培養(yǎng)過程中外植體對(duì)激素較為敏感，比較容易形成玻璃化苗，而相對(duì)較高濃度的BA在一定程度上可促進(jìn)愈傷組織的生成。

2.2 生根培養(yǎng)

將高約4 cm、生長較健壯的無根苗接種到生根培養(yǎng)基 6)、7)上誘導(dǎo)生根。約15 d后幼苗基部開始長根，生根率分別是30%及90%。培養(yǎng)基 6)生長得根系細(xì)長；培養(yǎng)基 7)生長的根系較粗，每苗有3～5條(圖 1)。

2.3 試管苗的移栽

組培苗移栽前，先將瓶蓋打開置于室溫下煉苗約1周后，將幼苗取出，清除掉殘余的培養(yǎng)基質(zhì)，選擇陰天傍晚的時(shí)候，種于小型溫室中的育苗床中(選用含較多腐殖質(zhì)的土壤，且用0.1%多菌靈滅菌)，保溫、保濕，噴霧澆灌，直到長出新根為止。小苗成活率達(dá)90%以上(圖2)。

圖1 線紋香茶菜組培苗

圖2 線紋香茶菜移栽成活的組培苗

2.4 其它因素

迄今為止，線紋香茶菜組織培養(yǎng)未見有成功的報(bào)道，僅在中藥溪黃草另一基原植物溪黃草(R.serra)有相關(guān)報(bào)道[6]。在進(jìn)行線紋香茶菜的組培實(shí)驗(yàn)過程中，不定芽誘導(dǎo)極易污染，這很可能是因?yàn)榫€紋香茶菜葉和莖表面布滿大量的紅色腺點(diǎn)[7]，難以徹底消毒造成的。因此，本實(shí)驗(yàn)在前期對(duì)線紋香茶菜進(jìn)行較為繁瑣的清洗，目的就是為了降低線紋香茶菜離體培養(yǎng)的污染率。