利用花藥培養(yǎng)技術(shù)選育優(yōu)質(zhì)水稻兩系不育系EH1S

劉凱 李三和 徐華山 陳志軍 楊國才 游艾青

[摘要]EH1S是湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所以自育兩系不育系H155S、H2319S和H1968-4S為母本，導(dǎo)入長粒、香味及稻瘟病抗性基因，結(jié)合分子輔助選擇與花藥培養(yǎng)技術(shù)選育而成的水稻兩系不育系。EH1S開花習(xí)性好，異交結(jié)實率高，稻瘟病抗性好，粒形細(xì)長，千粒重高，有香味，米質(zhì)優(yōu)。

[關(guān)鍵詞]優(yōu)質(zhì);水稻;兩系不育系;EH1S;花藥培養(yǎng)

[中圖分類號]S511[文獻標(biāo)識碼]B

石明松1973年在農(nóng)墾58中發(fā)現(xiàn)了晚粳自然不育株，具有長日高溫不育、短日低溫可育特性，1981年提出了一系兩用的構(gòu)想，開辟了中國兩系雜交水稻研究的新篇章。兩系法具有配組自由，種子生產(chǎn)成本低，無不育細(xì)胞質(zhì)負(fù)效應(yīng)，易轉(zhuǎn)育新不系等優(yōu)點。水稻兩系不育系的恢復(fù)基因廣，普遍存在于一般水稻品種。兩系法雜種優(yōu)勢利用不受恢保關(guān)系的限制，配組自由，因此，選育強優(yōu)勢、好品質(zhì)、多抗性雜交組合的機率更大，應(yīng)用前景更好。兩系法的關(guān)鍵在光溫敏雄性核不育系。光溫敏雄性核不育系選育每年可繁殖2代，但是武漢地區(qū)秋繁，轉(zhuǎn)育低溫不穩(wěn)定，導(dǎo)致每年僅1代，育種進程嚴(yán)重滯后。利用水稻花藥培養(yǎng)技術(shù)可以迅速獲得穩(wěn)定的純合二倍體，育種周期短、選擇效率高。本研究于2007年開始采用花藥培養(yǎng)加速兩系不育系選育進程，最初選用三交、四交或者復(fù)交轉(zhuǎn)育材料，后代分離嚴(yán)重，有些花培后代甚至無光溫敏核不育系，6a僅育成H155S、H2319S、H1968-4S等3個不育株系，在米質(zhì)、抗性方面均無大的改進，根本不能在生產(chǎn)中大面積應(yīng)用，不育系選育必須在現(xiàn)有基礎(chǔ)上，對米質(zhì)、抗性進行大幅度改良。

筆者根據(jù)2010-2013年9月15-25日武漢氣溫變化，結(jié)合育種實踐，摸索出水稻兩系不育系在武漢地區(qū)7月上旬播種，9月下旬抽穗，育性轉(zhuǎn)換期在9月20日前后，這段時間保證了育性正常轉(zhuǎn)換，雜交轉(zhuǎn)育在人工氣候室進行，使不育系回交改良群體的構(gòu)建成為可能。2010年開始回交轉(zhuǎn)育，2013年構(gòu)建回交改良群體，其后不斷導(dǎo)入新的優(yōu)質(zhì)及抗病基因，從群體內(nèi)篩選優(yōu)良單株，利用分子標(biāo)記檢測目標(biāo)基因，選取陽性單株進行花藥培養(yǎng)，育成優(yōu)質(zhì)、抗病、有香味的兩系不育系EH1S。

1 選育經(jīng)過

2013年夏在武漢將自育的花培不育系H155S（香）、H2319S分別與13J1925（廣占63S////廣占63S///廣占63S//廣占63S/谷梅2號，F(xiàn)1，Pi25）雜交，2014年春海南復(fù)交，檢測香味基因和稻瘟病抗性基因Pi25;2014年夏在武漢種植復(fù)交后代群體，選取具有目標(biāo)基因的單株與13JN2103（廣占63-4S//廣占63-4S/Super-basmati，F(xiàn)1）雜交，導(dǎo)入Super-basmati長粒基因;2015年春構(gòu)建優(yōu)質(zhì)長粒、抗稻瘟病、含香味基因回交改良群體;2015年檢測目標(biāo)基因同時選擇長粒單株與E農(nóng)1S雜交，導(dǎo)入稻瘟病抗性基因Pi1、Pi2;2016年春篩選目標(biāo)單株與自育花培不育系H1968-4S雜交;2016年秋選取農(nóng)藝性狀優(yōu)良目標(biāo)且含有目標(biāo)基因的單株進行花藥培養(yǎng)，獲得54個花培不育系株系，經(jīng)2017年繁殖、基因檢測、抗性鑒定、米質(zhì)分析以及田間性狀鑒定等，選留1個優(yōu)質(zhì)、抗稻瘟病、有香味的株系。2018年選用優(yōu)良直播稻福稻88進行配合力測定，雜交種在2019年春海南大區(qū)品比中表現(xiàn)產(chǎn)量高、米質(zhì)優(yōu)、熟期較早，劍葉細(xì)長挺直，分蘗力較強，抗倒性好，后期落色好。2019年春在海南擴大繁殖，經(jīng)鑒定，該不育系臨界轉(zhuǎn)換溫度約為23.5℃，暫命名為EH1S。

2 特征特性

2.1 農(nóng)藝性狀

EH1S在武漢種植，5月5日播種，播始?xì)v期為86d左右;冬季海南陵水于11月20日播種，播始?xì)v期115d左右，屬基本營養(yǎng)生長型。株型松散適中，株高85cm，劍葉細(xì)長、挺直，葉鞘穎尖均無色，谷粒細(xì)長，有香味，千粒重30g左右，每穗穎花數(shù)160朵左右，單株有效穗l2個左右，穗頂部偶有短頂芒。

2.2 育性表現(xiàn)

2019年，湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所對EH1S進行育性轉(zhuǎn)換溫度鑒定，EH1S于湖北武漢5月5日左右播種，7月底抽穗，高溫鑒定不育系開花習(xí)性;在主穗花粉發(fā)育進入母細(xì)胞形成期時，露天人工池恒溫浸泡至幼穗頂部。在23.5℃溫度浸泡，冷水灌溉處理6-8d，花粉可染率3.5%、自交結(jié)實率為0（表1）。鑒定結(jié)果為育性轉(zhuǎn)換的臨界溫度約為23.5℃。

2.3 稻米品質(zhì)

經(jīng)農(nóng)業(yè)部食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心（武漢）測定，EH1S糙米率77.7%，精米率67.3%，整精米率54.6%，長寬比3.6，堊白粒率20%，堊白度3.3%，透明度1級，膠稠度79mm，直鏈淀粉含量14.4%，堿消值6.0，米質(zhì)達國標(biāo)三級優(yōu)質(zhì)米。有香味。

2.4 抗逆性

經(jīng)湖北恩施農(nóng)科院植保所抗性鑒定，EH1S葉瘟病3級，綜合評價為中抗稻瘟病。經(jīng)檢測含有稻瘟病抗性基因Pi1。

3 配組表現(xiàn)

2018年秋季測配的EH1S/福稻88參加海南大區(qū)比產(chǎn)試驗，全生育期120d，比對照豐兩優(yōu)4號早7d，比對照揚兩優(yōu)6號早12d。有效穗315.0萬/hm2，穗長23.0cm，每穗總粒數(shù)160.2粒，結(jié)實率83.2%，千粒重27.9g，產(chǎn)量9364.8kg/hm2，比對照豐兩優(yōu)4號增產(chǎn)1.61%，比對照揚兩優(yōu)6號減少4.42%，后期稈青籽黃，田間抗性好。米質(zhì)經(jīng)農(nóng)業(yè)部食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心（武漢）測定，糙米率77.5%，精米率67.5%，整精米率59.1%，長寬比3.5，堊白粒率10%，堊白度2.3%，透明度1級，膠稠度75mm，直鏈淀粉含量14.6%，堿消值5.5，米質(zhì)達國標(biāo)三級。

4 繁殖技術(shù)要點

EH1S為花藥培養(yǎng)后代，基因型純合。繁殖可選擇在海南冬繁或者云南夏繁。海南陵水冬季一般11月10日左右播種，育性轉(zhuǎn)換敏感期安排在2月下旬為宜;云南夏繁一般4月10日左右播種，育性轉(zhuǎn)換期在8月初。田塊選擇應(yīng)具備隔離條件;栽培上注意稀播壯秧;花培不育系基因純合，可采用雙本栽插;及時防治病蟲草害，因不育系香味濃，后期注意防止鳥鼠危害。抽穗前嚴(yán)格去除雜株，做到田間無雜株;搶晴收割，收獲時防止機械混雜。

5 兩系不育系花藥培養(yǎng)技術(shù)

田間選擇適宜單株，抽取小穗發(fā)育VI-VII期小穗，于8℃低溫預(yù)處理8-10d，選取單核靠邊期的小穗，用75%酒精滅菌1min，有效氯3%的次氯酸鈉消毒24min，無菌水漂洗5次，晾干小穗，剪穎抖藥法將花藥接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中（N6+KT1.0mg/L+2，4-D2.0mg/L+NAA3.0mg/L+脯氨酸600mg/L+麥芽糖50mg/L+植物凝膠3.0mg/L），每瓶接80枚左右花藥。接種后置于光溫培養(yǎng)箱28℃暗培養(yǎng)。待愈傷組織生長到1.8-2.2mm左右時，轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基（MS+KT2.0mg/L+6-BA0.5mg/L+NAA0.5mg/L+蔗糖30mg/L+植物凝膠3.0mg/L），放入光溫培養(yǎng)箱光照培養(yǎng)，光照時間為14h/d。

6 結(jié)語

EH1S具有稻瘟病抗性、米質(zhì)優(yōu)、有香味，所配組合莖稈柔韌性好，有效穗多，熟期適宜，適宜直播栽培，肥料吸收率高，肥效利用率好，不適宜肥力條件好的中高產(chǎn)田做高產(chǎn)栽培。EH1S開花習(xí)性較好，異交結(jié)實率較高，但是柱頭較小，受花面積小，制種要獲高產(chǎn)，要注意促花、保花，并增加父本花粉量;受精后閉穎率高，雜交種子質(zhì)量好。直鏈淀粉含量適中和膠稠度高，有香味，應(yīng)選用有香味父本配組，易配出優(yōu)質(zhì)兩系雜交稻。

90年代以秈粳雜交的F1代作為花培主體材料，花培苗分離嚴(yán)重，后代入選幾率不高，筆者認(rèn)為兩系不育系花藥培養(yǎng)選用回交改良F1群體，選用與目標(biāo)不育系相似的單株，不斷導(dǎo)入新的優(yōu)質(zhì)不育材料、抗性基因、優(yōu)質(zhì)基因等，保持改良群體持續(xù)更新，從群體內(nèi)篩選優(yōu)良單株，分子檢測篩選抗性基因，選取優(yōu)良單株進行花藥培養(yǎng)，能提高兩系不育系入選幾率。無論是回交轉(zhuǎn)育還是花藥培養(yǎng)，育性轉(zhuǎn)換時期和目標(biāo)單株的選擇至關(guān)重要。本研究表明，利用復(fù)交改良F1代群體進行花藥培養(yǎng)選育兩系不育系，既能提高選育的準(zhǔn)確性，又能縮短育種周期。

[參考文獻]

[1] 石明松.晚粳自然兩用系選育及應(yīng)用初報[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，1981（7）：1-3.

[2] 袁隆平.我國兩系法雜交水稻研究的形勢、任務(wù)和發(fā)展前景[J].農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化研究，1997，18（1）：1-3.

[3] 雷東陽，唐文幫，解志堅等.兩系法雜交水稻制種不安全問題的解決途徑[J].作物學(xué)報，2013，39（9）：1569-1575.

[4] 袁麗，宋丁丁，高冠軍，何予卿，2011，利用分子標(biāo)記輔助選擇和花藥培養(yǎng)改良光溫敏不育系Y58S的稻瘟病抗性，基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，30（5）：620-625.