三種常見細菌的潛在揮發(fā)性生物標志物研究進展

聶茅毛,李明娟,郭雷,劉德勝,李恩有

感染是指細菌、病毒、真菌、寄生蟲等病原體侵入人體所引起的局部組織和全身性炎性反應(yīng)，其中以細菌感染最為常見。引起感染的細菌被稱為致病菌。致病菌侵襲人體不同部位和組織，可以引發(fā)各種疾病，如常見的肺炎、腸炎等。另外，致病菌及其代謝產(chǎn)物通過血液傳播也可引發(fā)多種全身性癥狀，如毒血癥、菌血癥等，嚴重威脅人類的生命安全[1]。

細菌感染的傳統(tǒng)診斷方法有分離培養(yǎng)、生化鑒定、血清學試驗以及顯微鏡檢查等。目前，細菌的分離培養(yǎng)鑒定是細菌學診斷的金標準，然而，這種方法過程繁雜、耗時較長，從獲得樣本到最后確診一般需要24～48 h。一些新興的分子生物學方法，如基因雜交、基因擴增等，雖然縮短了檢測時間，增加了檢驗的準確性，但同樣存在過程繁瑣的缺點，增加了臨床應(yīng)用的難度。雖然目前病原學診斷檢查方法眾多，但現(xiàn)代細菌感染所具有的復(fù)合感染、廣泛耐藥、菌株變異以及內(nèi)源性感染等特點[2]，大大增加了臨床上確診細菌種類的難度，這對于感染細菌種類的確診方法也提出了更高的要求。因此，臨床上迫切需要一種理想的檢測細菌種類的方法，這種方法應(yīng)該具有快速、實時以及靈敏度和特異性高等特點[3]。

揮發(fā)性有機化合物分析是近年來發(fā)展起來的一種用于疾病診斷的新興方法，由于其具有方便、快速、靈敏度高等特點而備受研究者關(guān)注。不同種屬或同一種屬不同表現(xiàn)型的細菌所產(chǎn)生的代謝物各不相同，這些代謝物中的某些特異性揮發(fā)性有機化合物即可成為鑒別診斷細菌種類的潛在性生物標志物?，F(xiàn)對近年來三種研究較多的細菌感揮發(fā)性生物標志物研究進行綜述，將對一些有潛力成為細菌診斷標志物的多種揮發(fā)性有機化合物紋譜進行整理分析，并對其可能的代謝途徑進行討論。另外，針對目前各研究結(jié)果之間存在較大差異的原因進行了分析，并對分析的研究方向進行了展望。

1 三種常見細菌的潛在揮發(fā)性有機化合物

1.1銅綠假單胞菌銅綠假單胞菌原稱綠膿桿菌，是一種革蘭陰性菌，在正常人的皮膚、呼吸道和腸道等都有分布。它是一種呼吸道條件致病菌，可以反復(fù)感染肺囊性纖維化病人，使病人的發(fā)病率和病死率顯著增加[4]。銅綠假單胞菌感染的早期如發(fā)現(xiàn)和治療，可以根除細菌的感染，防止疾病轉(zhuǎn)歸為慢性[5]。作為一種新興的疾病篩查及診斷方法，近年來揮發(fā)性有機化合物分析被廣泛應(yīng)用于細菌的早期診斷，其中以銅綠假單胞菌的研究數(shù)量最多，獲得的潛在生物標志物也最多，具體見表1。

表1 銅綠假單胞菌的潛在揮發(fā)性生物標志物

注：GC-MS為氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀；SIFT-MS為選擇性離子流管質(zhì)譜；NT-GC-MS為非靶向氣相色譜-質(zhì)譜串聯(lián)；GC-FPD為帶高選擇性火焰熱離子檢測器的氣相色譜儀；GC-TLC為氣相-薄層色譜法；SESI-MS為二次電噴霧電離質(zhì)譜；GC×GC-TOF-MS為全二維氣相色譜飛行時間質(zhì)譜儀

分析表1可知，已發(fā)現(xiàn)的銅綠假單胞菌的潛在揮發(fā)性生物標志物較多，共39種揮發(fā)性有機化合物，其中以烴類、酮類化合物為主，其次是含氮化合物、含硫化合物以及醇類化合物。其中，2-氨基苯乙酮(2-AA)是發(fā)現(xiàn)最早的潛在生物標志物，也是到目前為止研究最多的銅綠假單胞菌診斷標志物之一。1979年，有研究已證實銅綠假單胞菌所產(chǎn)生的特殊葡萄樣氣味，其來源即為化合物2-AA[13]。近年來，隨著多種揮發(fā)性有機化合物分析技術(shù)的發(fā)展，越來越多的研究為2-AA成為銅綠假單胞菌感染的診斷標志物提供了有力證據(jù)[6,18]。另外，一些體外培養(yǎng)銅綠假單胞菌的研究發(fā)現(xiàn)，向培養(yǎng)基中加入色氨酸可使銅綠假單胞菌特異性的葡萄樣氣味增加[13,29]，這是因為2-AA是喹唑啉生物合成途徑中的一個中間物質(zhì)，而喹唑啉生物合成路徑是色氨酸分解代謝途徑的一個分支[30]。然而也有研究[10]提出，對于細菌的揮發(fā)性生物標志物的研究，需明確體外細菌培養(yǎng)和體內(nèi)樣本分析之間的差別。

銅綠假單胞菌的另一個潛在的揮發(fā)性生物標志物是氫氰酸，它也是唯一一種可以在所有來源的樣本中均可檢測到的揮發(fā)性有機化合物。研究表明，氫氰酸對真核細胞有強烈的毒性，并且這種毒性能夠抑制真菌的生長，為銅綠假單胞菌的感染提供了有利條件[31-32]。另一種揮發(fā)性生物標志物硫氰酸甲酯的產(chǎn)生可能與氫氰酸有一定聯(lián)系。有研究[24]提出，氫氰酸可能是硫氰酸甲酯生物合成途徑的一種底物。目前所有多種揮發(fā)性有機化合物其潛在的生物途徑均尚不清楚，需要研究者們的進一步探究，也需要一些化學專家的分析支持。

1.2大腸埃希菌大腸埃希菌又稱大腸桿菌，是一種革蘭陰性菌。根據(jù)致病機制的不同，致瀉性大腸埃希菌被分為腸產(chǎn)毒性大腸埃希菌、腸道侵襲性大腸埃希菌、腸道致病性大腸埃希菌、腸集聚性黏附性大腸埃希菌以及腸出血性大腸埃希菌5種。大腸桿菌常被作為糞便污染的指標。近幾年來，大腸桿菌的多種揮發(fā)性有機化合物指紋譜分析逐漸被應(yīng)用于食品衛(wèi)生與保健方面的研究中。目前發(fā)現(xiàn)的大腸桿菌的潛在揮發(fā)性生物標志物較少，具體見表2。

在表2中所有的多種揮發(fā)性有機化合物中，吲哚是研究較多的潛在生物標志物之一，由色氨酸通過色氨酸酶代謝產(chǎn)生[39]。Kunze等[37]研究發(fā)現(xiàn)，在大腸桿菌的不同生長階段(遲緩期、對數(shù)期、穩(wěn)定期)均有吲哚產(chǎn)生。

表2 大腸埃希菌的潛在揮發(fā)性生物標志物

注：PTR-MS為質(zhì)子傳遞反應(yīng)質(zhì)譜；MCC-IMS為快速氣相色譜-離子遷移譜聯(lián)用譜儀；TD-GC-MS為熱脫附-氣質(zhì)聯(lián)用法；其余縮寫同表1

也有研究表明，大腸桿菌具有某種特殊氣味，其來源很可能是吲哚這種揮發(fā)性有機化合物[40]。研究結(jié)果提示，吲哚很有可能成為診斷大腸埃希菌感染的揮發(fā)性生物標志物。

1.3金黃色葡萄球菌金黃色葡萄球菌是革蘭陽性菌的代表細菌，可引起許多嚴重感染。金黃色葡萄球菌易產(chǎn)生耐藥，其中的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌[41]也稱為“超級細菌”，除了萬古霉素，幾乎可以抵抗所有的抗生素。據(jù)美國疾病控制中心報告稱，由金黃色葡萄球菌引起的感染占第二位，僅次于大腸桿菌，由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒事件也時有發(fā)生。因此，利用呼出氣揮發(fā)性有機化合物分析，對疑似金黃色葡萄球菌引起的食物中毒病人進行早期診斷，對人類健康具有重大的意義。我們將近年對金黃色葡萄球菌潛在揮發(fā)性生物標志物的研究進行了總結(jié)分析，結(jié)果共發(fā)現(xiàn)了30多種揮發(fā)性有機化合物，具體見表3。

目前，關(guān)于金黃色葡萄球菌的揮發(fā)性有機化合物分析研究較少，大多數(shù)的多種揮發(fā)性有機化合物仍需進一步驗證。

表3 金黃色葡萄球菌的潛在揮發(fā)性生物標志物

注：GC-tof-MS：氣相色譜-飛行時間-質(zhì)譜；其余縮寫同表1

值得一提的是，在有些研究中將金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌按照一定的比例(分別為3∶1,1∶1和1∶3)混合后培養(yǎng)，并分析其頂空氣多種揮發(fā)性有機化合物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)一些特異性多種揮發(fā)性有機化合物不僅可以鑒別不同的細菌，同時也可以用來推測其混合的比例[16]。這為我們將來研究細菌的復(fù)合感染提供了一種全新的思路。

另一方面，我們將3種細菌的潛在揮發(fā)性生物標志物進行橫向分析發(fā)現(xiàn)，乙酸、丙酮、乙醇以及二甲基二硫醚等4種揮發(fā)性有機化合物在3種細菌的指紋譜中都有出現(xiàn)，而有些揮發(fā)性有機化合物僅僅出現(xiàn)在某一種細菌指紋譜中，如2-(4-聯(lián)苯基)-2-丙醇、氫氰酸、2-庚酮、苯甲醛等，這些揮發(fā)性有機化合物對這些細菌的診斷能力均需要進一步的交叉驗證。

另外，這些潛在的揮發(fā)性生物標志物并非由同一研究機構(gòu)研究所得，不同的研究中心所采用的樣本來源以及采取的檢測分析方法均有所不同。絕大多數(shù)的研究采用的樣本來源于體外細菌培養(yǎng)，與體內(nèi)來源的樣本如痰、鼻竇黏液、肺泡灌洗液以及呼出氣相比，體外研究可以避免體內(nèi)來源樣本分析所面臨的干擾因素過多、過程不可控等缺點，然而，由于體外研究無法完全模擬體內(nèi)感染細菌的生存環(huán)境，因此體外培養(yǎng)得到的多種揮發(fā)性有機化合物是否可以完全代替內(nèi)源性樣本來源所獲得的多種揮發(fā)性有機化合物，以及這些揮發(fā)性有機化合物對于相關(guān)疾病的診斷能力，這些需要研究者們的進一步探討與研究。

2 細菌揮發(fā)性有機化合物色譜、質(zhì)譜檢測方法

細菌揮發(fā)性有機化合物指紋譜分析的飛速發(fā)展依賴于檢測分析方法的不斷進步。這三種細菌常用的多種揮發(fā)性有機化合物指紋譜色譜、質(zhì)譜分析檢測方法是GC-MS、PTR-MS、SIFT-MS、SESI-MS等。應(yīng)用最多的方法是GC-MS。我們將四種揮發(fā)性有機化合物指紋譜分析方法各自的優(yōu)點及不足之處總結(jié)如下。

2.1GC-MSGC-MS屬于化學電離技術(shù)。氣相部分主要起分離和將目標物質(zhì)引入質(zhì)譜系統(tǒng)的作用，而質(zhì)譜部分主要起檢測器的作用。GC-MS分析具有色譜高精確度、高敏感性以及高穩(wěn)定性的特點，是一種比較成熟的方法，應(yīng)用極為廣泛。但GC-MS也有其局限性，如需要先進行預(yù)濃縮再進行熱解析進樣分析，增加了分析時間，且GC-MS無法完成實時檢測等[44]。

2.2PTR-MSPTR-MS的工作原理是通過反應(yīng)離子H3O+與被測物質(zhì)多種揮發(fā)性有機化合物之間的質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應(yīng)，從而實現(xiàn)揮發(fā)性有機化合物的離子化和質(zhì)譜探測[45]。PTR-MS主要的優(yōu)點是不需要預(yù)處理等步驟，樣品分析時間大大縮短(100 ms)，甚至可以實現(xiàn)實時監(jiān)測。在分析方面，擴大了檢測的范圍，提高了檢測的靈敏度。但PTR-MS也有不足。那就是它的檢測范圍只局限于親和力大于水的質(zhì)子；而且，它不適用于檢測濃度較高的樣本，檢測限不能超過10×10-6濃度的揮發(fā)性有機化合物[46-48]。

2.3SIFT-MSSIFT-MS同樣屬于化學電離技術(shù)，是一種相對較新的直接檢測質(zhì)譜分析技術(shù)[49]。使用H3O+、NO+和O2+作為初始離子，與目標分析物在流動管中反應(yīng)，通過四級桿慮質(zhì)器進行全掃描或者選擇性離子掃描。SIFT-MS的優(yōu)勢在于無需色譜分離即可對大多數(shù)揮發(fā)性有機化合物提供10-12級甚至10-10級水平的定量分析結(jié)果，無需前處理直接氣體進樣，不受濕度影響等[49]。最重要的特點是可進行實時檢測。但是，不能夠進行單一揮發(fā)性有機化合物識別，并且不能進行完整的輪廓識別[50]。

2.4SESI-MS二次電噴霧電力技術(shù)主要依靠電噴霧電力產(chǎn)生的帶電粒子和中性氣體樣品分子間的氣相作用[51]。不同于PTR-MS和SIFT-MS，SESI-MS，可通過特殊峰碎片進行化合物鑒別，這是化合物鑒別的重要手段。SESI-MS最低檢測限度是十萬億分之一，其優(yōu)勢在于樣本無需預(yù)處理即可快速識別多種揮發(fā)性有機化合物的特征。2010年，Zhu等[16]第一次將SESI-MS應(yīng)用于檢測細菌的多種揮發(fā)性有機化合物指紋譜，證實SESI-MS可用于多種揮發(fā)性有機化合物指紋譜的實時檢測分析。

3 展望

綜上所述，揮發(fā)性有機化合物分析具有快速、靈敏、無創(chuàng)等優(yōu)勢，隨著檢測技術(shù)及設(shè)備的不斷更新，目前已經(jīng)可以實現(xiàn)實時檢測，前景良好。將揮發(fā)性有機化合物分析技術(shù)應(yīng)用于臨床對細菌感染等疾病進行早期診斷和鑒別，是研究者們的共同目標。目前，多種細菌揮發(fā)性有機化合物的潛在揮發(fā)性生物標志物研究仍處于探索階段，已發(fā)現(xiàn)的潛在標志物的可能生物途徑尚不清楚，需要更多研究者們的進一步深入探究。