膽酸鈉片質(zhì)量狀況及現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)

郭江紅，王文晞，馬妮，胡遠(yuǎn)華，姜紅

( 湖北省藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，武漢 430064)

動物膽汁作為藥物使用在中國已經(jīng)有上千年歷史，具有清熱解毒、止咳平喘等功效[1]。膽汁酸是動物膽汁的主要有效成分，其主要結(jié)構(gòu)是以環(huán)戊烷多氫菲為核心的二十四碳膽烷羧酸，不同動物分泌不同類型膽汁酸的臨床功效也不盡相同[2]。膽酸鈉系自?；蜇i膽中提取的膽汁酸鹽的混合物。臨床上作為利膽藥，用于膽汁缺乏及膽囊炎等。膽酸鈉片是膽酸鈉制成的糖衣片。其不良反應(yīng)主要為胃腸道反應(yīng)和皮疹。國內(nèi)企業(yè)最早于1995年獲得膽酸鈉及膽酸鈉片的批準(zhǔn)文號。膽酸鈉片目前全國共有生產(chǎn)企業(yè)17家，批準(zhǔn)文號18個；但大部分企業(yè)長期不生產(chǎn)；現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)為中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)二部六冊(生化藥品第一分冊)，標(biāo)準(zhǔn)中收載了化學(xué)與薄層色譜鑒別，崩解時限及含量測定(乙醚萃取稱重法)。國外尚無該品種上市。膽酸鈉片是國家評價性抽驗(yàn)品種，筆者根據(jù)原國家食品藥品監(jiān)督管理總局統(tǒng)一安排，參考文獻(xiàn)[3-12]報(bào)道，對抽取30批不同企業(yè)生產(chǎn)膽酸鈉片實(shí)施法定檢驗(yàn)，并進(jìn)行探索性研究，全面考察該品種的質(zhì)量現(xiàn)狀及現(xiàn)行法定標(biāo)準(zhǔn)水平。

1 儀器與試藥

1.1儀器 液質(zhì)聯(lián)用飛行時間質(zhì)譜儀(Waters G2-S Q-TOF LC/MS)，TAS-986型原子吸收分光光度計(jì)，Mars微波消解儀、AG-135電子天平(梅特勒-托利多儀器公司，感量：0.1 mg)，DHG-9036A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，AT7 Smart型智能溶出度儀，Evolution-300型紫外可見分光光度計(jì)，millipore超純水機(jī)，MATRIX-F 近紅外光譜儀。

1.2試藥 膽酸對照品(批號：10078-0013)、豬去氧膽酸對照品(批號：100087-200610)、鵝去氧膽酸對照品(批號：110806-200704)、?；蛆Z去氧膽酸對照品(批號：110846-200506)、熊去氧膽酸對照品(批號：100087-200610)、去氧膽酸對照品(批號：110724-200207)購自中國食品藥品檢定研究院；?；秦i去氧膽酸(批號：079K0045)、牛磺熊去氧膽酸(批號：119K0052)購自Sigma公司；甘氨豬去氧膽酸(批號：TRC24-CF-57-3)、?；悄懰?批號：LF50N06)、甘氨鵝去氧膽酸鈉(批號：LJ20O26)等由企業(yè)提供。鈉離子標(biāo)準(zhǔn)溶液(國家有色金屬及電子材料分析測試中心，唯一標(biāo)識：13432-2，規(guī)格：1000 μg·mL-1)、硝酸(色譜純)。

2 方法與結(jié)果

2.1抽樣簡介 全國共有生產(chǎn)企業(yè)17家，批準(zhǔn)文號18個；但大部分企業(yè)并未生產(chǎn)，所以僅抽取到2個生產(chǎn)企業(yè)30批次樣品，涉及2個批準(zhǔn)文號；其中生產(chǎn)企業(yè)抽樣2批次，占樣品總數(shù)6.7%； 在藥品經(jīng)營企業(yè)抽取27批次，占樣品總數(shù)90.0%；在醫(yī)療機(jī)構(gòu)抽取1批次，占樣品總數(shù)3.3%。從抽取樣品的地域分布來看，膽酸鈉片分布在8省市自治區(qū)，其中，安徽、江蘇、上海最多，均為6批次。

2.2依據(jù)現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)結(jié)果及分析 本次抽取樣品均按中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)二部六冊(生化藥品第一分冊)檢驗(yàn)，該標(biāo)準(zhǔn)出版于1998年，該品種標(biāo)準(zhǔn)一直未進(jìn)行增修訂。檢驗(yàn)項(xiàng)目比較簡單，主要包括：性狀、鑒別、崩解時限與含量測定等4項(xiàng)；30批次樣品均符合規(guī)定，合格率為100%。其中崩解時限規(guī)定“應(yīng)在1 h內(nèi)完全崩解”，30批次樣品的崩解時限為21～39 min；30批次樣品含量測定結(jié)果為69.6%～77.8%，均符合“本品含膽酸不得少于標(biāo)示量的65%”的規(guī)定。

2.3探索性研究結(jié)果及分析 結(jié)合企業(yè)現(xiàn)場調(diào)研、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)現(xiàn)狀及檢驗(yàn)情況，針對藥品的有效性、安全性及質(zhì)量可控性等方面，開展了產(chǎn)品的來源、有效成分、鈉離子含量、溶出行為及安全性等方面探索性研究。

2.3.1種屬來源鑒別 膽酸鈉原料藥標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定“本品系自牛或豬膽中提取的膽汁酸鹽混合物”，但不同動物的膽汁中膽汁酸成分有較大差別。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，豬膽汁中主要游離膽汁酸為豬去氧膽酸和鵝去氧膽酸[4]，牛膽汁中主要游離膽汁酸為膽酸和去氧膽酸[5]。采用薄層色譜法對樣品中的膽汁酸成分進(jìn)行初步分析，對動物來源的膽汁酸進(jìn)行區(qū)分。

按照現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)薄層色譜鑒別項(xiàng)下方法：取本品，除去包衣，研細(xì)，稱取約2 g，加水10 mL，振搖溶解，作為供試品溶液。精密稱取豬去氧膽酸與鵝去氧膽酸對照品，分別加甲醇制成1 mg·mL-1的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法(《中華人民共和國藥典》2015年版四部通則0502)，吸取上述溶液各2 μL，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以異辛烷-正丁醚-冰醋酸(8：5：5)為展開劑，展開后，噴以10%磷鉬酸乙醇溶液，在105 ℃干燥5 min。結(jié)果顯示：本次抽樣30批次樣品薄層色譜鑒別均檢測出豬去氧膽酸和鵝去氧膽酸的斑點(diǎn)，提示所用膽汁來源均為豬膽汁，薄層色譜圖見圖1。

1.豬去氧膽酸對照品；2.鵝去氧膽酸對照品；3.企業(yè)A樣品(20131201)；4.企業(yè)B樣品(130402)

圖1膽酸鈉片膽汁薄層色譜圖

2.3.2有效成分研究 本品名為膽酸鈉片，有效成分應(yīng)為膽酸鈉，即3α，7α，12α-三羥基-5β-膽烷酸單鈉鹽，但該品種原料藥膽酸鈉項(xiàng)下描述為膽汁酸鹽混合物，與品種名稱不符，故采用Q-Tof LC/MS法對樣品中成分進(jìn)行分析鑒定。

質(zhì)譜分析條件：采用BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，130 ?)，流動相A為水(含0.01%甲酸)，B為乙腈，C為甲醇，按表1進(jìn)行梯度洗脫，流速為0.6 mL·min-1，柱溫 35 ℃；檢測器采用質(zhì)譜檢測器，離子源為ESI負(fù)離子模式，采集模式為MSE，相對分子質(zhì)量為50～1200，Trap電壓50～60 V，椎孔電壓40 V。結(jié)果見圖2，表2。30批次膽酸鈉片所含已知膽汁酸成分由豬去氧膽酸、?；秦i去氧膽酸、甘氨豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸、?；蛆Z去氧膽酸、甘氨鵝去氧膽酸、牛磺石膽酸和甘氨石膽酸組成。此外，還含有兩種未知膽汁酸成分，經(jīng)過查閱文獻(xiàn)和MassFragment軟件預(yù)測，推測其為?；?-氧代-3α，6α-二羥基-24-膽烷酸和甘氨5-氧代-3α，6α-二羥基-24-膽烷酸。兩家生產(chǎn)企業(yè)膽酸鈉原料均來自豬膽，所含膽汁酸成分一致。

表1 流動相梯度洗脫表 %

A：水(含0.01%甲酸)；B：乙腈；C：甲醇

圖2 膽酸鈉片總離子流圖

2.3.3各膽汁酸成分含量測定 采用上述LC-MS法對確證的膽汁酸鹽成分進(jìn)行含量測定，分析不同廠家，不同批次樣品之間各組分含量差異。結(jié)果顯示：30批次膽酸鈉片總膽汁酸含量為39.6%～71.4%，兩家企業(yè)測定值范圍及均值見表3。企業(yè)B總膽汁酸含量明顯高于企業(yè)A，且批間含量差異較小，提示該生產(chǎn)企業(yè)從原料制備到制劑生產(chǎn)穩(wěn)定性較好；30批次膽酸鈉片中，鵝去氧膽酸、甘氨牛磺結(jié)合鵝去氧膽酸、豬去氧膽酸與甘氨?；墙Y(jié)合豬去氧膽酸分別占總膽汁酸含量95.5%(企業(yè)A)和96.6%(企業(yè)B)，由于?；撬岷透拾彼峤Y(jié)合型膽汁酸只是增加膽汁酸在體內(nèi)的溶解度，他們的療效同游離膽汁酸一致，因此，本次抽樣涉及的兩家生產(chǎn)企業(yè)產(chǎn)品的有效成分均為豬去氧膽酸和鵝去氧膽酸。

表2 膽酸鈉片各膽汁酸成分信息表

表3 膽酸鈉片總膽汁酸含量測定結(jié)果 %

2.3.4樣品中鈉含量測定 本品為膽汁酸鈉鹽，現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中未對鈉離子進(jìn)行控制，擬采用原子吸收分光光度法測定樣品中鈉離子。檢測波長：589.0 nm，狹縫寬度：0.5 nm，燈電流：5.0 mA，氣體：空氣-乙炔。在該條件下進(jìn)行方法學(xué)實(shí)驗(yàn)，當(dāng)鈉離子對照品溶液濃度為0.2～2.0 μg·mL-1，吸收值與濃度呈良好線性，回歸方程為Y=3.003 6X-0.082 9，r=0.999 0；檢出限為0.01 μg·mL-1；連續(xù)測量6次，含量的RSD為0.37%，方法精密度良好；加樣回收率平均值為100.4%，RSD=1.7%(n=6)，表明該方法準(zhǔn)確度較好。樣品測定結(jié)果顯示：30批次膽酸鈉片鈉離子含量為3.6%～5.6%，各生產(chǎn)企業(yè)測定值范圍及均值見表4。兩家生產(chǎn)企業(yè)鈉離子含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表4 膽酸鈉片鈉離子含量考察結(jié)果 %

2.3.5溶出行為研究 膽酸鈉片作為動物膽汁提取的多組分生化藥糖衣片，現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中并未設(shè)定溶出度檢查項(xiàng)，擬開展膽酸鈉片的溶出行為研究，通過比較不同企業(yè)樣品的溶出曲線，考察不同企業(yè)樣品內(nèi)在質(zhì)量的差異，評價工藝的一致性。

由于膽酸鈉在偏酸性的條件下不溶解，并且會析出絮狀沉淀，因此，選取水作為溶出介質(zhì)；采用漿法，每分鐘75轉(zhuǎn)，210 nm為測定波長。采用自身對照法：取20片，研磨，置500 mL量瓶中，加水適量，超聲20 min使溶解，濾過，取續(xù)濾液適量，加水稀釋到每毫升含0.1 mg的溶液，作為自身對照。分別在15，30，45，60，75，135，195，255 min取樣測定溶出度并繪制溶出曲線。兩家生產(chǎn)企業(yè)樣品溶出曲線見圖3。結(jié)果顯示：兩家生產(chǎn)企業(yè)樣品在100 min后才達(dá)到溶出平臺，企業(yè)A樣品比企業(yè)B在前期溶出較為緩慢，在75 min時達(dá)到平臺，企業(yè)B樣品溶出較緩和。溶出曲線中累積溶出量，采用f2相似因子法評價曲線相似性。結(jié)果顯示，兩家生產(chǎn)企業(yè)樣品溶出行為不相似(f2<50.2)。提示兩家生產(chǎn)企業(yè)制劑工藝存在差異。

圖3 兩家企業(yè)膽酸鈉片溶出曲線圖

2.3.6安全性方面考察 膽酸鈉在提取過程中可能會有膽紅素、膽固醇等有機(jī)物的殘留，此外，動物飼養(yǎng)過程中因環(huán)境、飼料等因素可能造成的重金屬及其他有害物質(zhì)的的蓄積，也需要嚴(yán)格控制。因此，采用高效液相色譜法對樣品中膽紅素與膽固醇?xì)埩暨M(jìn)行檢測[8]，30批次樣品均未檢出膽紅素殘留與膽固醇?xì)埩?。收集企業(yè)A生產(chǎn)的3批膽酸鈉原料藥，采用原子吸收分光光度法和原子熒光法對原料中汞(Hg)、砷(As)、鉛(Pb)等進(jìn)行考察，3批次原料藥中汞、砷、鉛殘留總和在4 mg·kg-1內(nèi)，具體見表5。

表5 3批膽酸鈉原料汞、砷和鉛含量檢測結(jié)果 mg·kg-1

3 討論

膽酸鈉片中有效成分應(yīng)為膽酸鈉，該品種說明書中對該品種成分的描述為“膽酸鈉化學(xué)名：3α，7α，12α-三羥基-5β-膽烷酸”；但探索性研究結(jié)果表明，膽酸鈉片中未檢出膽酸鈉，主要成分為豬去氧膽酸和鵝去氧膽酸以及其與甘氨酸、牛磺酸結(jié)合鈉鹽。膽酸鈉片適應(yīng)證為利膽，用于膽汁缺乏及膽囊炎。文獻(xiàn)查閱發(fā)現(xiàn)不同種類的膽汁酸，除了具有利膽作用外，還有很多不同功效，如膽酸還具有解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎的功效，豬去氧膽酸能降低三酰甘油，適用于Ⅰa或Ⅰb型高血脂癥、動脈粥樣硬化癥。本品實(shí)際是多組分膽汁酸藥品，因此其適應(yīng)證應(yīng)依據(jù)膽汁酸種類的不同重新修訂。建議生產(chǎn)企業(yè)更改制劑名稱，重新修訂說明書中成分、適應(yīng)證等相關(guān)信息。

膽酸鈉原料藥系從牛或豬膽中提取獲得，為動物內(nèi)臟來源的生化藥。動物內(nèi)臟可能積累鉛、砷、汞等有害物質(zhì)，因此在原料藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中應(yīng)對有害元素進(jìn)行控制，但原料藥現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中為對重金屬及其他有害物質(zhì)未進(jìn)行控制。建議在原料藥標(biāo)準(zhǔn)中增訂相關(guān)有害物質(zhì)檢查項(xiàng)。膽酸鈉片現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)包括鑒別，片劑相關(guān)檢查及含量測定，項(xiàng)目設(shè)置過于簡單，現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)不能有效控制產(chǎn)品質(zhì)量。①本品為豬膽汁或牛膽汁提取的膽汁酸鹽，現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)并未設(shè)定相應(yīng)的鑒別項(xiàng)對不同種屬來源動物進(jìn)行區(qū)分；不同動物來源的膽汁中膽汁酸成分存在較大差異，而不同膽汁酸成分有著截然不同的臨床療效。建議標(biāo)準(zhǔn)中增訂對膽汁來源的控制，建立薄層色譜法，對牛和豬來源的膽汁酸進(jìn)行鑒別。②本品為膽汁酸鈉鹽，現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中并未對鈉離子的含量進(jìn)行控制，應(yīng)建立原子吸收分光光度法對鈉離子進(jìn)行控制。③現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中含量測定采用乙醚萃取稱重法，該方法專屬性較差，不能有效控制產(chǎn)品中各膽汁酸含量，目前《歐洲藥典》(EP8.0)中熊去氧膽酸有關(guān)物質(zhì)檢查采用高效液相-示差法，能有效分離多種游離膽汁酸[13]，文獻(xiàn)報(bào)道有專屬性更強(qiáng)的方法可分析不同游離膽汁酸[14]，因此建議建立高效液相色譜等專屬性較強(qiáng)的方法進(jìn)行含量測定。