生物技術(shù)藥物脫酰胺化檢測方法概述*

李恒，何雁南，馬吉勝，劉姍姍，周朝暉

(1.武漢藥品醫(yī)療器械檢驗所，武漢 430075；2.溫州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，溫州 325035；3.東北大學(xué)化學(xué)與生物化學(xué)系，巴奈特化學(xué)與生物分析研究所，美國波士頓 02115)

近年來，我國生物醫(yī)藥行業(yè)迅速蓬勃發(fā)展。據(jù)艾美仕(Intercontinental Marketing Services，IMS)預(yù)測，到2020年，我國生物醫(yī)藥市場將成為僅次于美國的全球第二大生物醫(yī)藥市場，其中抗體藥物和蛋白藥物等生物技術(shù)藥物未來可產(chǎn)生3000億～5000億元市場。據(jù)2016年不完全統(tǒng)計，我國已批準(zhǔn)上市的生物技術(shù)藥有44種[1]，并且獲批品種數(shù)量還在逐年增加。隨著《中華人民共和國藥典》2015年版的實施，生物技術(shù)藥物的質(zhì)量控制將會大幅提高，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)逐步與國際接軌，藥品質(zhì)量將達(dá)到國際水平。

生物技術(shù)藥物不同于傳統(tǒng)的小分子藥物，生產(chǎn)、儲存及運輸條件等因素的改變都會引起其蛋白的異構(gòu)、變性，從而引起難以預(yù)測的臨床藥物不良反應(yīng)。脫酰胺化(deamidation)是常見的蛋白翻譯后修飾形式，普遍存在蛋白、多肽類藥物中。異天冬氨酸(isoaspartic acid，isoAsp)是脫酰胺化的特異性降解產(chǎn)物，其存在量能反映藥物脫酰胺化的程度。因此，國外生物藥品生產(chǎn)企業(yè)在向美國食品藥品管理局(FDA)、歐盟藥品管理局(EMA)申報藥品資料時都會提供該申報藥品脫酰胺化的相關(guān)檢測數(shù)據(jù)。饒春明等[2]對2015年版《中華人民共和國藥典》生物技術(shù)藥質(zhì)量控制相關(guān)內(nèi)容進(jìn)行切實詳盡的闡述，并以人用重組 DNA 蛋白制品為例，其中指出氨基酸序列測定時應(yīng)考慮各種可能的翻譯后修飾(如脫酰胺化、氧化、異構(gòu)化等)[3]。韋薇等[4]將脫酰胺化列入重組單克隆抗體產(chǎn)品相關(guān)物質(zhì)或雜質(zhì)研究范圍。這些生物技術(shù)藥物發(fā)生脫酰胺化的可能性非常高，其結(jié)果有待研究與分析。

隨著生物技術(shù)藥物的發(fā)展，脫酰胺化研究報道也越來越多[5-6]。目前為止《中華人民共和國藥典》及法規(guī)都尚未對生物技術(shù)藥物中脫酰胺化作出指導(dǎo)方法或建立明確的標(biāo)準(zhǔn)，也沒有對其產(chǎn)生的isoAsp進(jìn)行必要的定性定量檢測。因此筆者對脫酰胺化的檢測方法在國內(nèi)外研究的進(jìn)展綜述如下。

1 脫酰胺化及其對生物技術(shù)藥物的影響

1.1脫酰胺化定義 脫酰胺化是指多肽或蛋白中天冬酰胺(asparagine，Asn)殘基自發(fā)的非酶催化的脫酰胺反應(yīng)。Asn脫去其側(cè)鏈上的氨基，形成五元環(huán)的琥珀酰亞胺中間體，進(jìn)而水解形成天冬氨酸(aspartic acid，Asp)和isoAsp。谷氨酰胺(glutamine，Gln)殘基也能發(fā)生脫酰胺化，但發(fā)生較少且轉(zhuǎn)化速率較Asn慢得多，產(chǎn)生量也很低[7-9]，這里主要討論Asn脫酰胺化。

1.2影響脫酰胺化因素 脫酰胺化反應(yīng)的發(fā)生是個極其復(fù)雜的過程，isoAsp的產(chǎn)生速度取決于多種因素，包括蛋白質(zhì)多肽的原始序列、構(gòu)象、pH值和溫度等。在沒有固定空間結(jié)構(gòu)的肽中，位于Asn或Asp的C端殘基起主要作用；作為最靈活和酸性(主鏈酰胺)的Asn-甘氨酸(glycine，Gly)(NG)在生理條件下表現(xiàn)出最高的脫酰胺速率(半衰期約1 d)； Asn-絲氨酸(serine，Ser)(NS)和Asn-組氨酸(histidine，His)(NH)，在酸催化條件下，除NG外脫酰胺速率比大多數(shù)其他序列要快得多；由于脯氨酸(proline，Pro)中含有仲胺，因此Asn-Pro(NP)并沒有觀察到脫酰胺反應(yīng)。總而言之，蛋白質(zhì)多肽中含NG結(jié)構(gòu)很可能發(fā)生，含NS結(jié)構(gòu)可能發(fā)生，而含NP大多不發(fā)生脫酰胺化。在生理條件下，Asp異構(gòu)化速率約為Asn的1/40[10]。而琥珀酰亞胺中間體通常以3：1的比例水解成isoAsp和Asp[11-12]。生物信息學(xué)分析和實驗研究均表明，蛋白質(zhì)中Asn(～4%)和Asp(～5%)生成isoAsp概率均較高，而isoAsp是普遍存在且發(fā)揮著不同作用。

1.3脫酰胺化對生物技術(shù)藥物的影響 isoAsp是普遍存在的，它會改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能[13-14]。許多生物技術(shù)藥物在生產(chǎn)、儲存等過程中都有可能發(fā)生非酶催化的脫酰胺化反應(yīng)，這將對其結(jié)構(gòu)與穩(wěn)定性產(chǎn)生影響[15]，從而造成藥物本身活性的降低甚至完全喪失，如重組人干細(xì)胞因子[16]、重組人免疫球蛋白抗體E[17]、重組人生長激素[18]等。不僅如此，科學(xué)家們在多個領(lǐng)域的研究中發(fā)現(xiàn)脫酰胺化及可能的重要影響，包括對神經(jīng)生物學(xué)，細(xì)胞粘附，癌癥和免疫原性的影響[19-20]。

1.4脫酰胺化研究的難點 isoAsp的形成可以說是最常見的蛋白質(zhì)翻譯后修飾(post-translational modification，PTM)之一，并且它是最小的PTM。首先，鑒定含有isoAsp的蛋白質(zhì)已經(jīng)非常困難，而且還需在蛋白質(zhì)中將其精確定位；其次，isoAsp和Asp是相同質(zhì)量的異構(gòu)體，并不能通過質(zhì)譜法直接將二者進(jìn)行區(qū)分；最后，isoAsp的產(chǎn)生是個動態(tài)變化的過程，建立準(zhǔn)確定量的檢測方法十分困難。因此尋找準(zhǔn)確合適的方法將其區(qū)分并測定，是許多實驗研究人員努力的方向。

2 脫酰胺化的檢測方法

2.1處理方法 少量多肽藥物不需酶切，如重組人胰島素、重組人生長激素等，加入適當(dāng)濃度的鹽酸或緩沖液，在室溫放置24 h，采用高效液相色譜(HPLC)法可以直接有效地分離脫胺組分或產(chǎn)物。《中華人民共和國藥典》2015年版已收入上述兩個品種，并對其對應(yīng)的脫胺組分有相應(yīng)的檢查要求[21]。徐軍等[5]對《中華人民共和國藥典》重組人胰島素注射液中有關(guān)物質(zhì)檢查方法進(jìn)行優(yōu)化，并用質(zhì)譜(mass spectrometry，MS)鑒定B3和B3iso脫氨人胰島素。

生物技術(shù)藥物相對分子質(zhì)量大，通常需使用胰蛋白酶等內(nèi)切蛋白酶進(jìn)行消化水解成多肽片段(必要時進(jìn)行富集)，然后在一定的溫度下，將肽段在醋酸銨或碳酸氫銨緩沖液中進(jìn)行孵化，最后利用酶法[異天冬氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(proteinL-isoaspartyl methyltrans-ferase，PIMT)、天冬氨酸肽鏈內(nèi)切酶Asp-N(endoprotease Asp-N)]、同位素標(biāo)記(18O)法等進(jìn)行進(jìn)一步處理，進(jìn)而采用不同分析儀器對isoAsp進(jìn)行鑒定或含量測定。

①PIMT。該方法是最常見最有效的用于蛋白藥物中isoAsp定性定量檢測手段之一[15，22]，通常采用ISOQUANT?Isoaspartate Kit試劑盒進(jìn)行測定。其原理是利用PIMT特異性，通過催化S-腺苷-L-甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methionine，AdoMet，SAM)上甲基轉(zhuǎn)移到isoAsp的α-羧基位置上，生成琥珀酰亞胺中間體，隨后在甲基化過程中自發(fā)分解并釋放甲醇；而SAM失去-CH3生成S-腺苷高半胱氨酸(S-adenosyl-L-homocysteine，SAH)。采用HPLC測定生成的SAH含量，從而間接對isoAsp定量。該方法以isoAsp-DSIP作為對照品，isoAsp在5～250 pmol·L-1濃度的范圍內(nèi)，其含量與SAH峰面積之間有良好的重復(fù)性和線性關(guān)系；蛋白或多肽濃度范圍應(yīng)控制在7.5～37.5 pmol·L-1。畢華等[6]利用該方法對重組人血管內(nèi)皮生長抑制劑中isoAsp的含量進(jìn)行測定，表明生物技術(shù)藥物的質(zhì)量越來越受到我國監(jiān)管部門的重視，脫酰胺化的檢測將會在未來幾年內(nèi)逐步開展。該方法不足在于：它只能全面定量Asn和Asp所有位點上的isoAsp殘基，而不能確證每個單獨位點的信息；不能用于檢測Gln的脫酰胺化；也不能檢測位于肽N-末端isoAsp殘基。

ALFARO等[23]應(yīng)用PIMT選擇性地將isoAsp生成其甲酯，再將不穩(wěn)定甲酯在水溶液中加入強親核試劑，如肼(hydrazine)形成酰肼(hydrazide)，采用基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜(matrix assisted laser desorption ionization-mass spectrometry，MALDI-MS)可以檢測出比原物質(zhì)相對分子質(zhì)量大14的酰肼產(chǎn)物，從而有效地確定脫酰胺化位點。此外，穩(wěn)定的酰肼產(chǎn)物還可以用醛樹脂進(jìn)行富集或者加入具有熒光基團(tuán)的丹磺酰氯進(jìn)行選擇性修飾生成含磺?；鶊F(tuán)的產(chǎn)物(sulfonyl hydrazide)，再通過含紫外(ultraviolet，UV)檢測器(檢測波長為280 nm)或熒光檢測器的HPLC進(jìn)行定量分析。肽酰肼類物質(zhì)具有很高選擇性和顯著親和力，富集效果好，此方法的出現(xiàn)使檢測復(fù)雜的系統(tǒng)isoAsp成為可能，實現(xiàn)了對isoAsp的有效定位與定量檢測。

②Asp-N可以選擇性水解Asp而不影響isoAsp。NI等[24]利用Asp-N這一特性，提高isoAsp的檢測峰度，通過電子捕獲/轉(zhuǎn)移質(zhì)譜法(electron capture dissociation/electron transfer dissociation-MS，ECD/ ETD-MS)對isoAsp進(jìn)行精確的檢測和定性定量分析。該方法的缺點是：在樣品前處理過程中，此酶Asp-N活性條件下的pH容易引起樣品的脫酰胺化的發(fā)生，從而造成一定假陽性的結(jié)果。

③蛋白內(nèi)切酶(endoprotease Glu-C)。在蛋白質(zhì)脫酰胺化的分析中，常用pH值 8.0 的酶解反應(yīng)條件，而在此條件下樣品容易發(fā)生新的脫酰胺化，所測得的脫酰胺水平遠(yuǎn)高于樣品中的實際值[25]。為了避免和減少樣品前處理過程中發(fā)生的這些假陽性現(xiàn)象，LIU等[26]發(fā)現(xiàn)，在pH 值4.5條件下，Glu-C同樣可以有效酶解樣品，且樣品在酶解過程中幾乎不發(fā)生新的脫酰胺化，從而使測得的脫酰胺水平更接近樣品中的真實值。這一發(fā)現(xiàn)降低檢測大分子蛋白藥物中isoAsp假陽性現(xiàn)象，能夠真實有效地分析樣品中isoAsp的情況，進(jìn)一步完善了脫酰胺化的檢測方法。

2.2儀器方法

2.2.1HPLC法 HPLC法是蛋白質(zhì)分離最常用最有效的分析方法，在脫酰胺化中主要用于相應(yīng)脫氨組分、isoAsp的定量測定等。

2.2.2電泳法 蛋白質(zhì)脫酰胺后會引入負(fù)電荷，使其保留時間增加，因此電泳法也被用作脫酰胺化的檢測[30]。十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳法(sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)是早期采用的檢測方法之一[31]。隨著電泳技術(shù)的發(fā)展，新的電泳技術(shù)也在逐步應(yīng)用。等電焦集電泳(isoelectric focusing electro-phoresis，IEF)是依據(jù)蛋白質(zhì)分子等電點(isoelectric point，IP) 的不同來作分離，其解析度非常好，因此在蛋白質(zhì)脫酰胺化中也有應(yīng)用[32-33]。上述兩種電泳法得到的電泳圖可以較直觀地反映脫酰胺組分。毛細(xì)管電泳(capillary electrophoresis，CE)或高效毛細(xì)管電泳(high performance capillary electrophoresis，HPCE)是凝膠電泳技術(shù)的發(fā)展，HPLC分析的補充。與普通SDS-PAGE比較，CE具有分辨率高、分離效率快等優(yōu)點；與HPLC比較，CE分離機制不同，可應(yīng)用于HPLC不易分離的樣品。但在某些程度上，其方法復(fù)雜，結(jié)果重復(fù)性差。結(jié)合了質(zhì)譜的CE可以對樣品進(jìn)行更全面的分析，可對蛋白質(zhì)復(fù)合物及翻譯后修飾產(chǎn)物進(jìn)行分析。

《中華人民共和國藥典》2015年版三部收錄電泳法(通則0541)，其主要用于蛋白質(zhì)鑒別、相對分子質(zhì)量及IP檢測。張瑩[31]對重組人胰島素中脫胺胰島素檢測方法(PAGE、HPLC、CE)進(jìn)行介紹。LEWIS等[34]和SKOTTNE等[35]分別采用SDS-PAGE對重組人生長激素不同的脫酰胺產(chǎn)物進(jìn)行分離。NIELSEN等[36]采用CE對生物合成人胰島素和人生長激素不同脫酰胺產(chǎn)物進(jìn)行分離，并定量測定。

2.2.3離子交換色譜法(ion exchange chromatography，IEC) 20世紀(jì)90年代初期，IEC被用于蛋白質(zhì)脫酰胺的分析[37]，但Asp與isoAsp兩者不易分離使其在脫酰胺研究上存在局限性，隨著IEC與HPLC的結(jié)合，有了進(jìn)一步的發(fā)展。ZHANG等[33]將單克隆抗體中的多肽片段與PIMT進(jìn)行酶促反應(yīng)，通過強陽離子交換(strong cation exchange，SCX)-HPLC分離各型脫酰胺產(chǎn)物，用HPLC-UV測定其isoAsp總量。VLASAK等[38]通過離子交換(cation exchange，CEX)-HPLC分離、結(jié)合質(zhì)譜，鑒定重組人源化單克隆IgG1抗體(humanized IgG1 monoclonalantibody，MAb)的輕鏈互補決定區(qū)1(complementarity determining region 1，CDR1)中Asn33脫酰胺化，用ISOQUANT Kit檢測其含量。

2.2.5聯(lián)合應(yīng)用 由于isoAsp檢測的復(fù)雜性，為了更好地確認(rèn)發(fā)生脫酰胺化的位點，并且能有效地將Asp與isoAsp分離，多種檢測技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用被人們廣泛采用。ZHANG等[42]在對重組人白細(xì)胞介素11進(jìn)行脫酰胺化研究時，采用SDS-PAGE、HPLC結(jié)合胰蛋白酶肽圖、CE結(jié)合Asp-N肽圖以及LC/MS四種儀器方法進(jìn)行分析，對發(fā)生脫酰胺化的位點進(jìn)行準(zhǔn)確定位，最后利用PIMT采用SCX-HPLC檢測方法對isoAsp的總量進(jìn)行定量測定。

綜上所述，在生物技術(shù)藥物脫酰胺化檢測中，每種方法都有其特點(表1)，因此通常采用幾種方法聯(lián)合應(yīng)用以達(dá)到對isoAsp精確定位，準(zhǔn)確定量的目的。

表1 不同方法在脫酰胺化檢測中的特點

續(xù)表1 不同方法在脫酰胺化檢測中的特點

3 前景與展望

目前，我國生物技術(shù)藥品中涉及脫酰胺產(chǎn)物的檢測項目較少，且未對生物技術(shù)藥品中的isoAsp含量進(jìn)行檢測作任何要求，相關(guān)定性定量檢測方法幾乎處于空白。開展建立高效、準(zhǔn)確測定生物技術(shù)藥物中脫酰胺產(chǎn)物，特別是isoAsp的含量方法，使生物技術(shù)藥物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與國際接軌，可以對生產(chǎn)及市場流通的生物技術(shù)藥物的質(zhì)量起到監(jiān)管的作用，從而更好地保障廣大人民的生命健康和用藥安全。脫酰胺化檢測技術(shù)不斷發(fā)展，如何將這些檢測方法更加合理地應(yīng)用到生物技術(shù)藥物的實際檢測中去，建立高效、準(zhǔn)確的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)是值得我們思考的課題。