miRNA及其在肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展中作用的研究進(jìn)展

李彥寧，王建華

(天津中醫(yī)藥大學(xué)附屬北辰中醫(yī)醫(yī)院，天津300400)

肝細(xì)胞癌(HCC)是原發(fā)性肝癌的主要病理類型，發(fā)病率居全球惡性腫瘤第五位[1]。HCC具有發(fā)病隱匿的生物學(xué)特征，故臨床多數(shù)患者確診時(shí)已屬晚期，臨床治療手段有限甚至無效。臨床亟待新的治療方法來改善HCC的預(yù)后。因此深入研究HCC發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，探索HCC早期診斷的生物學(xué)標(biāo)記物和藥物治療靶點(diǎn)是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。微小RNA(miRNA)是一類無翻譯蛋白質(zhì)功能的非編碼RNA分子。近年研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在HCC組織中呈異常表達(dá)，證實(shí)其在HCC的發(fā)生發(fā)展、浸潤和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)過程中起重要作用，極有可能為未來早期診斷和治療HCC提供新的理念和方向。miRNA

可影響腫瘤細(xì)胞分化、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)、化療敏感性及腫瘤轉(zhuǎn)移，甚至可能標(biāo)記HCC干細(xì)胞表型。揭示miRNA的作用和機(jī)制有助于進(jìn)一步分析HCC的分子作用機(jī)制，為HCC提供潛在基因治療靶點(diǎn)。

1 miRNA概述

miRNA是調(diào)節(jié)基因表達(dá)的一類重要短鏈非編碼RNA，其主要通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄后水平參與機(jī)體功能調(diào)節(jié)。miRNA通過其種子序列與mRNA的3'非翻譯區(qū)(3'UTR)互補(bǔ)結(jié)合以介導(dǎo)mRNA去腺苷酸化或翻譯阻斷[2]。miRNA的基因調(diào)控在機(jī)體是普遍存在的，人類基因組編碼中有超過1 000個(gè)miRNA，并且每個(gè)都可以調(diào)節(jié)多個(gè)靶標(biāo)[3]。提示miRNA對眾多生物過程有一定影響。

miRNA表達(dá)譜與HCC的相關(guān)性在過去十年中已被廣泛研究?，F(xiàn)已明確，人類HCC和非腫瘤性肝臟組織miRNA表達(dá)顯著不同。部分miRNA例如miR-21、miR-221和miR-222在HCC組織中呈過表達(dá)狀態(tài)。這些miRNA通過負(fù)調(diào)控HCC組織中抑制腫瘤的蛋白質(zhì)編碼基因來促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展[4～6]。以上致癌miRNA也被稱為“oncomiRs”。另一方面，多項(xiàng)研究表明miR-122、miR-125b、miR-139、miR-101和let-7等在HCC組織中的表達(dá)周期性下調(diào)[7～10]。提示miRNA通過抑制HCC中的致癌基因發(fā)揮腫瘤抑制作用。miRNA調(diào)控紊亂是早期事件，可在癌前病變肝臟發(fā)育不良結(jié)節(jié)中檢測到，并且可在HCC發(fā)生過程中進(jìn)一步積累[11]。

目前HCC的具體發(fā)病機(jī)制尚不明確，探究miRNA與HCC發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性可為揭示HCC的發(fā)病分子機(jī)制提供新的方向。根據(jù)miRNA在HCC中的生物學(xué)功能表現(xiàn)，可以將其分為抑制腫瘤和致腫瘤作用兩類。

1.1 抑制HCC發(fā)生發(fā)展的miRNA 抗腫瘤miRNA通過多種途徑抑制HCC的發(fā)生發(fā)展。Wang等[12]在進(jìn)展期HCC小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，Myc原癌基因蛋白(MYC)過表達(dá)導(dǎo)致miR-122表達(dá)下調(diào)。另有學(xué)者在HCC小鼠模型(敲除MYC)中發(fā)現(xiàn)腺相關(guān)病毒介導(dǎo)的miR-122過表達(dá)能夠抑制腫瘤進(jìn)展[13]。體外實(shí)驗(yàn)表明，miR-122通過直接靶向調(diào)控原癌基因Wnt-1參與Wnt信號通路傳導(dǎo)，進(jìn)一步破壞HepG2細(xì)胞中β-鏈蛋白的穩(wěn)定性[14]。Hou等[15]研究表明，miR-199a-3p通過抑制p21活化激酶4及RAF-MEK-ERK途徑下游分子表達(dá)在HCC中發(fā)揮調(diào)控作用。提示miRNA可通過調(diào)控某些原癌基因發(fā)揮抗腫瘤作用。miR-122可通過抑制M2型丙酮酸激酶(PKM2)表達(dá)以影響HCC細(xì)胞系中葡萄糖的代謝，并且miR-122過表達(dá)可降低葡萄糖攝取并逆轉(zhuǎn)HCC細(xì)胞系中的Warburg效應(yīng)[16]。miR-199a-5p可通過靶向調(diào)控己糖激酶2和PKM2來調(diào)節(jié)HCC中葡萄糖酵解代謝。進(jìn)一步通過體內(nèi)和體外研究發(fā)現(xiàn)，miR-199a-5p過表達(dá)可抑制HCC生長且阻斷缺氧誘導(dǎo)的代謝變化[17,18]。提示miRNA可通過調(diào)控腫瘤細(xì)胞代謝抑制HCC發(fā)生發(fā)展。Fornari等研究表明miR-122通過靶向調(diào)控細(xì)胞周期蛋白G1而影響HCC細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)程。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-199a-3p在HCC細(xì)胞系中通過抑制雷帕霉素和肝細(xì)胞生長因子受體信號傳導(dǎo)機(jī)制發(fā)揮調(diào)控作用，并且誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯和促進(jìn)細(xì)胞凋亡[19]。NOD/SCID小鼠模型研究發(fā)現(xiàn)，miR-122*過表達(dá)誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞中TP53依賴性細(xì)胞凋亡并抑制HCC致瘤性[20]。提示miRNA可通過調(diào)控腫瘤細(xì)胞周期、增殖和凋亡抑制HCC發(fā)生發(fā)展。

1.2 促進(jìn)HCC發(fā)生發(fā)展的miRNA 在HCC組織中表達(dá)上調(diào)的miRNA亦可通過多種途徑促進(jìn)HCC發(fā)生發(fā)展。體外實(shí)驗(yàn)表明，miR-221通過調(diào)節(jié)腫瘤抑制基因人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因(PTEN)和組織金屬蛋白酶抑制因子3促進(jìn)HCC的發(fā)生和HCC細(xì)胞的遷移[21]。miR-21通過調(diào)節(jié)人肝細(xì)胞癌中腫瘤抑制基因PTEN的表達(dá)，促進(jìn)HCC的進(jìn)展[22]。提示miRNA可通過調(diào)控腫瘤抑制基因發(fā)揮促HCC的作用。miR-221通過組成型激活NF-κB通路促進(jìn)HCC細(xì)胞的生長和侵襲[5]。Gramantieri等[23]研究發(fā)現(xiàn)，miR-221負(fù)向調(diào)控凋亡調(diào)節(jié)因子家族的促細(xì)胞凋亡蛋白BMF表達(dá)與肝腫瘤的多灶性轉(zhuǎn)移相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，在二乙基亞硝胺誘導(dǎo)的HCC大鼠模型中miR-221的過表達(dá)與索拉非尼耐藥性相關(guān)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)miR-221可能通過調(diào)節(jié)Caspase-3的表達(dá)和細(xì)胞凋亡發(fā)揮作用[24]。提示miRNA可通過影響腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡發(fā)揮調(diào)控HCC的作用?，F(xiàn)已明確，miR-221直接靶向調(diào)控周期蛋白依賴激酶抑制劑和細(xì)胞周期蛋白依賴激酶抑制因子1C促進(jìn)了人HCC細(xì)胞系中細(xì)胞周期的進(jìn)展。提示miRNA可通過調(diào)控細(xì)胞周期促進(jìn)HCC發(fā)生發(fā)展。

2 miRNA對HCC發(fā)生發(fā)展的調(diào)控機(jī)制

2.1 miRNA在HBV相關(guān)HCC中的調(diào)控機(jī)制 HBV感染是HCC發(fā)生的主要危險(xiǎn)因素，在世界范圍內(nèi)超過50%的HCC病例與HBV感染有關(guān)。目前研究已明確HBV直接參與驅(qū)動HCC發(fā)生的過程。第一，HBV病毒基因組可以整合到人類基因組中，導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定和致癌嵌合轉(zhuǎn)錄本的產(chǎn)生。第二，HBV蛋白X(HBx)具有高度致癌性，90%的HBx轉(zhuǎn)基因小鼠可以發(fā)生HCC。Wang等[10]研究表明，導(dǎo)入HBx的HepG2細(xì)胞中miRNA表達(dá)發(fā)生了改變，對let-7家族miRNA表達(dá)下調(diào)的影響尤為顯著。有研究表明HBx可以通過改變宿主中重要的轉(zhuǎn)錄因子或信號通路來介導(dǎo)miRNA的失調(diào)。例如HBx可通過調(diào)控TP53和MYC的表達(dá)分別抑制miR-148a和miR-16。HBx還可通過激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)-IL-6途徑上調(diào)致癌基因miR-21的表達(dá)[25]。

2.2 miRNA在HCV相關(guān)HCC中的調(diào)控機(jī)制 HCV感染是導(dǎo)致肝硬化和HCC的主要原因之一。HCV誘導(dǎo)HCC發(fā)展的分子機(jī)制可能與HBV感染具有差異性，其相關(guān)HCC組織中的miRNA可以調(diào)控免疫應(yīng)答、細(xì)胞周期和代謝途徑等。研究表明HCC發(fā)生過程中HCV與宿主miRNA之間存在復(fù)雜的相互作用。一方面，HCV感染實(shí)質(zhì)上是改變宿主miRNA的表達(dá)以促進(jìn)其病毒復(fù)制。目前研究表明，miR-122對HCV復(fù)制至關(guān)重要。miR-122通過與其5'UTR結(jié)合來穩(wěn)定HCV RNA。此外，HCV RNA還可以從其內(nèi)源mRNA靶標(biāo)中螯合miR-122[26]。故HCV感染在功能上抑制miR-122及其靶標(biāo)以誘導(dǎo)HCC發(fā)生。另一方面，miR-199a直接靶向調(diào)控HCV基因組的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)。miR-199a-3p過表達(dá)以RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體依賴性機(jī)制抑制永生化肝細(xì)胞中的HCV病毒復(fù)制。干擾素β(IFN-β)通過調(diào)節(jié)宿主miRNA表達(dá)部分地發(fā)揮其抗病毒作用。IFN-β治療通過下調(diào)miR-122表達(dá)并使HCV RNA不穩(wěn)定[27]。同時(shí)IFN-β誘導(dǎo)miR-196、miR-296、miR-351、miR-431和miR-448的表達(dá)，這些miRNA直接靶向調(diào)控HCV RNA并減弱HCV復(fù)制[11]。

HCV通過上調(diào)宿主miRNA和促使細(xì)胞信號傳導(dǎo)途徑失調(diào)來促進(jìn)HCC的形成。miR-155表達(dá)由HCV感染誘導(dǎo)，通過激活其上游轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB和P300)，部分上調(diào)miR-155表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程并抑制細(xì)胞凋亡。miR-155還通過靶向調(diào)控腺瘤性結(jié)腸息肉蛋白而激活Wnt信號傳導(dǎo)調(diào)控Wnt靶基因的表達(dá)，包括細(xì)胞周期蛋白D1、MYC和存活蛋白。BALB/c裸鼠模型中，miR-155過表達(dá)促進(jìn)HCC增殖和皮下腫瘤發(fā)展[28]。

2.3 miRNA在上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和腫瘤轉(zhuǎn)移中的調(diào)控機(jī)制 癌癥轉(zhuǎn)移是癌癥患者病死率高的原因。目前研究表明miRNA參與了HCC轉(zhuǎn)移。體外和體內(nèi)研究均證實(shí)，miR-124、miR-139和miR-151等發(fā)揮抑制癌細(xì)胞運(yùn)動和侵襲的作用[29]。腫瘤抑制miRNA(miR-17和miR-29b)是基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)的負(fù)向調(diào)節(jié)因子，MMP是癌癥轉(zhuǎn)移過程中消化細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的關(guān)鍵酶。miR-200家族，miR-216和miR-181a與人類HCC中轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)介導(dǎo)的EMT有關(guān)。研究表明miR-200家族因子通過形成具有E盒鋅指結(jié)合蛋白1(ZEB1)和E盒鋅指結(jié)合蛋白2(ZEB2)的雙負(fù)反饋環(huán)路，在HCC中調(diào)控EMT。因此，miR-200家族表達(dá)下調(diào)增強(qiáng)了ZEB1和ZEB2的表達(dá)，從而抑制E-鈣黏蛋白的表達(dá)以促進(jìn)EMT[30]。除了調(diào)節(jié)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移過程之外，miRNA還調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞以促進(jìn)播散的HCC細(xì)胞的定植。TGF-β可下調(diào)HCC細(xì)胞系中的miR-34a表達(dá)，從而增加CCL22產(chǎn)生和招募CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞到腫瘤微環(huán)境[11]。Zhou等[31]通過對小鼠異種移植模型研究發(fā)現(xiàn)，HCC中miR-28-5p表達(dá)下調(diào)可以促進(jìn)IL-34介導(dǎo)的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAM)浸潤。TAM浸潤通過分泌TGF-β進(jìn)一步抑制miR-28-5p的表達(dá)，從而形成調(diào)節(jié)HCC轉(zhuǎn)移的前饋環(huán)。

2.4 miRNA對HCC干細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制 癌癥干細(xì)胞(CSC)是具有類似于正常干細(xì)胞特征的腫瘤內(nèi)罕見細(xì)胞群。眾多研究表明CSC對癌癥的耐藥性、腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移具有重要影響，故CSC成為治療癌癥的潛在靶點(diǎn)，并通過多種方法研究調(diào)節(jié)CSC功能的分子機(jī)制[32]。單細(xì)胞克隆HCC干細(xì)胞(LCSC)和非LCSC中基因表達(dá)的分析研究已經(jīng)鑒定出導(dǎo)致HCC具有干性表型的miRNA。

CD133被廣泛認(rèn)為是LCSC表面標(biāo)記物。CD133+HCC細(xì)胞較CD133-HCC細(xì)胞在體內(nèi)具有更高的集落形成能力、擴(kuò)散能力和致腫瘤能力。差異miRNA表達(dá)譜分析表明miR-130b在CD133+LCSCs中呈過表達(dá)狀態(tài)，并且miR-130增強(qiáng)了HCC細(xì)胞系和腫瘤異種移植物的腫瘤干性表型，表現(xiàn)為化學(xué)抗性、致腫瘤性和自我更新能力的增強(qiáng)[33]。上皮細(xì)胞黏附分子(EPCAM)是另一種常用的LCSC標(biāo)記物。miRNA表達(dá)譜分析研究表明，人HCC樣本中分離的EPCAM+LCSC中富含miR-181、miR-429、miR-150、miR-155和miR-223。這些miRNA通過靶向調(diào)控關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子和信號分子來促進(jìn)HCC細(xì)胞干性的表達(dá)[34]。

miRNA作為參與調(diào)節(jié)多種生物和細(xì)胞過程的重要調(diào)節(jié)因子，不同類型的miRNA表達(dá)失調(diào)與HCC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。了解miRNA在人HCC發(fā)生發(fā)展中作用，對揭示肝癌發(fā)生的分子機(jī)制有重要價(jià)值。