廣東客家黃酒體外抗氧化能力的初步評(píng)價(jià)

劉曉艷，曹 甜，傅筱鷗，白衛(wèi)東*，曹龍輝，趙文紅

（1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院 輕工食品學(xué)院，廣東 廣州 510225；2.廣東省嶺南特色食品工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510225）

黃酒，作為世界三大古酒之一，有著豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，且酒度較低，故既可用做食品調(diào)味品，也能用做傳統(tǒng)健康食品[1]。目前，黃酒的產(chǎn)地和消費(fèi)主要集中在浙江、江蘇兩帶，且其產(chǎn)量逐年可觀，產(chǎn)品越來(lái)越多樣化，包裝更多元化。隨著國(guó)內(nèi)居民生活水平與健康意識(shí)的不斷提高，健康、綠色、營(yíng)養(yǎng)的消費(fèi)觀念已成為主流，黃酒不斷更新發(fā)展[2]。廣東客家黃酒中含有豐富的維生素族，對(duì)女性來(lái)說(shuō)，長(zhǎng)期飲用有很好的美容抗衰老效果。由于客家黃酒酒精度較為適中，還可作為藥引子加以使用。目前在廣東客家黃酒的產(chǎn)地主要集中在河源梅州一帶，家家戶戶都會(huì)釀造屬于自己的黃酒，不僅可以自己飲用，還可作為特產(chǎn)贈(zèng)送給親朋好友；客家人稱黃酒為老酒，在當(dāng)?shù)兀图尹S酒也被稱為“月子酒”或者“雞子酒”，適量飲用能夠很好地讓產(chǎn)婦在坐月子期間恢復(fù)元?dú)?，更加亮眼美麗[3]。有研究表明是黃酒之所以具有的較高抗氧化力，主要源于其所含的幾種活性酚物質(zhì)，酚物質(zhì)易消耗氧，降低氧含量[4]。有報(bào)道表明，黃酒可發(fā)生美拉德反應(yīng)，其產(chǎn)物有一定的抗氧化功能[5]，但是由于缺乏系統(tǒng)科學(xué)的探究，故而黃酒特有的保健功效尚未被證實(shí)[6]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)黃酒的抗氧化性進(jìn)行研究，以廣東客家黃酒為原料來(lái)探究其體外的抗氧化能力，從而為更深層次的探究廣東客家黃酒提供了有力的基礎(chǔ)，有助于人們能科學(xué)地認(rèn)識(shí)黃酒的保健功能，也為更深入研究黃酒的功能打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛血清蛋白（bovine serumal bumin，BSA）、2,2'-聯(lián)氮-雙（3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（2,2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate）diammonium，ABTS）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、維生素E（vitamin E，VE）（均為分析純）：美國(guó)Sigma公司；鄰苯三酚、乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）、沒(méi)食子酸丙酯（propyl gallate，PG）、3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）（均為分析純）：阿拉丁試劑（上海）有限公司；廣東客家黃酒：梅州市龍軒實(shí)業(yè)有限公司；福林酚試劑盒：合肥博美生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TU-1901型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限公司；GM-1.0A隔膜真空泵：天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；DK-98II型電熱恒溫水浴鍋：天津市泰斯特儀器有限公司；KDN-103F型自動(dòng)定氮儀、308型消化爐：上海纖檢儀器有限公司；TG16-WS臺(tái)式高速離心機(jī)：湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；LGJ-12型真空冷凍干燥機(jī)：北京松源華興生物技術(shù)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 ABTS+自由基清除能力[7]

ABTS+溶液的配制：采用2.45 mmol/L過(guò)硫酸鉀溶液溶解0.384 1 g ABTS，配制7 mmol/L的ABTS+儲(chǔ)備液，室溫、避光條件下靜置14 h待用。用10 mmol/L、pH為7.4磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered solution，PBS）稀釋 ABTS+儲(chǔ)備液，使其吸光度值在波長(zhǎng)734 nm處達(dá)0.700。

樣品測(cè)定：為評(píng)價(jià)廣東客家黃酒的ABTS+的清除能力，以VE作為陽(yáng)性對(duì)照，在20μL、40μL、60μL、80μL的黃酒中分別加入水至4 mL，即體積分?jǐn)?shù)為5μL/mL、10μL/mL、15μL/mL、20μL/mL，加入到等體積的ABTS+充分混勻30 s，空白對(duì)照為4 mL ABTS+溶液和4 mL蒸餾水，分別測(cè)定于波長(zhǎng)734 nm處的吸光度值。ABTS+的清除率計(jì)算公式如下：

式中：U為ABTS+的清除率，%；U0為空白對(duì)照的吸光度值；

Ux為待測(cè)樣品的吸光度值。

1.3.2 DPPH自由基清除能力[7-8]

為評(píng)價(jià)廣東客家黃酒的DPPH自由基清除能力，在0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL的黃酒中分別加入水至2 mL，即體積分?jǐn)?shù)為0.05 mL/mL、0.1mL/mL、0.15 mL/mL、0.2 mL/mL、0.25 mL/mL，加入等體積的濃度為0.1 mmol/L的DPPH溶液，混勻后在室溫下避光反應(yīng)0.5 h，取上清液在波長(zhǎng)517 nm處測(cè)定吸光度值；空白對(duì)照組為2 mL的無(wú)水乙醇和2 mL樣品液，以100μg/mL的VE溶液作為陽(yáng)性對(duì)照。DPPH自由基清除率計(jì)算公式如下：

式中：X為DPPH自由基的清除率，%；A0為乙醇溶液替代樣液的吸光度值；Ax為待測(cè)樣品的吸光度值；Ax0為空白對(duì)照組的吸光度值。

1.3.3 超氧陰離子自由基清除能力[7-9]

在0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL的黃酒分別加入水至1 mL，即體積分?jǐn)?shù)為0.1 mL/mL、0.2 mL/mL、0.3 mL/mL、0.4 mL/mL、0.5 mL/mL，加入pH為8.2的Tris-HCl溶液5.0 mL，于25℃條件下保溫20 min后立即加入相同溫度的50 mmol/L鄰苯三酚溶液1 mL，搖勻，在25℃條件下恒溫水浴繼續(xù)保持5 min，再加8 mol/L HCl溶液1 mL終止反應(yīng)。在波長(zhǎng)325 nm處測(cè)出各樣品的吸光度值，由此算出鄰苯三酚溶液的吸光度值隨著時(shí)間的變化率。用超純水調(diào)零，以100μg/mL沒(méi)食子酸溶液為陽(yáng)性對(duì)照。超氧陰離子自由基清除率計(jì)算公式如下：

式中：X為超氧陰離子的清除率，%；A0為蒸餾水代替樣液的吸光度值，Ax0為蒸餾水代替鄰苯三酚溶液所得本底的吸光度值；Ax為待測(cè)樣品的吸光度值。

1.3.4 羥自由基清除能力[10-11]

在0.05 mL、0.10 mL、0.20 mL、0.30 mL的黃酒中分別加入水至1 mL，即體積分?jǐn)?shù)為0.05 mL/mL、0.10 mL/mL、0.20 mL/mL、0.30 mL/mL，分別加入2.25 mmol/L的FeSO4、9 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液和8.8 mmol/L H2O2各1 mL，搖勻，在37℃條件下靜置30 min，以超純水調(diào)零，測(cè)出波長(zhǎng)510 nm處的樣品吸光度值[9]。用2 mL蒸餾水作為空白，以100μg/mL VE溶液作為陽(yáng)性對(duì)照[10]。羥自由基清除率計(jì)算公式如下：

式中：X為羥自由基清除率，%；Ax為樣品液吸光度值；Ax0為蒸餾水代替H2O2所得本底的吸光度值；A0為蒸餾水代替樣液的吸光度值。

1.3.5 還原能力測(cè)定[12-13]

在0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL的黃酒中分別加入水至1 mL，即體積分?jǐn)?shù)為0.1 mL/mL、0.2 mL/mL、0.3 mL/mL、0.4 mL/mL、0.5 mL/mL，將樣品與pH值為6.6、濃度為0.2 mol/L、體積為2.5 mL的磷酸和30 mmol/L鐵氰化鉀2.5 mL混合，在50℃水浴條件中進(jìn)行反應(yīng)，20 min后加入0.6 mol/L三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）2.5 mL并混勻。取2.5 mL的混合液，與2.5 mL蒸餾水、0.5 mL 6 mmol/L FeCl3混合，測(cè)出波長(zhǎng)700 nm處吸光度值，以100μg/mL的VE溶液作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.3.6 測(cè)定金屬離子鰲合能力[14-16]

在0.235 mL、0.47 mL、0.705 mL、0.94 mL的黃酒分別加入水至4.7 mL，即體積分?jǐn)?shù)為0.05 mL/mL、0.10 mL/mL、0.20 mL/mL、0.30 mL/mL，分別與2 mmol/L的FeCl2溶液0.1 mL、5 mmol/L菲啰嗪（Ferrozine）溶液0.2 mL反應(yīng)，靜置20 min后，測(cè)出562 nm處吸光度值，以1 mmol/L EDTA作為陽(yáng)性對(duì)照。吸光度值越高，則反映待測(cè)樣品的金屬離子鰲合能力越大，其計(jì)算公式如下：

式中：X為金屬離子螯合能力，%；Ax為樣品溶液吸光度值；Ax0為用蒸餾水替代Ferrozine溶液吸光度值；A0為用蒸餾水替代樣品吸光度值。

2 結(jié)果與分析

2.1 ABTS+清除能力

廣東客家黃酒對(duì)ABTS+的清除率，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，隨著黃酒體積分?jǐn)?shù)在5～20μL/mL范圍的增加，黃酒對(duì)ABTS+清除率隨之增加，并當(dāng)廣東客家黃酒添加量增至20μL/mL時(shí)其ABTS+清除率與VE相當(dāng)。VE清除ABTS+的半抑制濃度（50%inhibiting concentration，IC50）值為（6.84±0.04）μL，而廣東客家黃酒清除ABTS+的IC50值為（6.83±0.07）μL。結(jié)果表明，廣東客家黃酒的ABTS+清除率與VE基本相當(dāng)。

圖1 廣東客家黃酒清除ABTS+自由基能力Fig．1 Scavenging ability of Guangdong Hakka Huangjiu on ABTS+free radical

2.2 DPPH自由基清除能力

廣東客家黃酒與VE對(duì)DPPH自由基的清除率，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，當(dāng)黃酒體積分?jǐn)?shù)為0.05～0.15 mL/mL時(shí)，廣東客家黃酒對(duì)DPPH自由基的清除能力低于VE；當(dāng)黃酒體積分?jǐn)?shù)為0.2 mL/mL，二者對(duì)DPPH自由基的清除能力相當(dāng)；當(dāng)黃酒的體積分?jǐn)?shù)超過(guò)0.2 mL/mL之后，廣東客家黃酒對(duì)DPPH自由基的清除能力有所下降。廣東客家黃酒及VE的IC50值分別為（0.14±0.02）mL、（0.14±0.01）mL。結(jié)果表明，廣東客家黃酒的ABTS+清除率與VE基本相當(dāng)。

圖2 廣東客家黃酒清除DPPH自由基能力Fig．2 Scavenging ability of Guangdong Hakka Huangjiu on DPPH free radical

2.3 超氧陰離子自由基清除能力

超氧陰離子自由基具有毒性，能使機(jī)體發(fā)生氧中毒，引發(fā)多種疾病[17]。廣東客家黃酒與沒(méi)食子酸對(duì)超氧陰離子自由基清除率，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知，隨著黃酒體積分?jǐn)?shù)在0.1～0.5 mL/mL范圍的增加，黃酒對(duì)超氧陰離子自由基清除率隨之增加，但始終高于沒(méi)食子酸。廣東客家黃酒和沒(méi)食子酸清除超氧陰離子自由基IC50值分別為（0.27±0.05）mL和（0.53±0.01）mL。結(jié)果表明，廣東客家黃酒對(duì)超氧陰離子自由基清除率高于沒(méi)食子酸。

圖3 廣東客家黃酒清除O2-·能力Fig．3 Scavenging ability of Guangdong Hakka Huangjiu on superoxide anion free radical

2.4 羥自由基清除能力

羥自由基能破壞機(jī)體的DNA、核酸等生命物質(zhì)，從而引發(fā)機(jī)體的多種疾病[18]。廣東客家黃酒與VE對(duì)羥自由基清除率，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知，隨著黃酒體積分?jǐn)?shù)在0.05～0.20 mL/mL范圍內(nèi)增加，廣東客家黃酒和VE清除羥自由基的能力都在上升并清除率相當(dāng)。在黃酒體積分?jǐn)?shù)＞0.2 mL/mL之后，黃酒清除羥自由基的能力有所下降。廣東客家黃酒與VE清除羥自由基的IC50值分別為（0.16±0.09）mL和（0.15±0.09）mL。結(jié)果表明，廣東客家黃酒的羥自由基清除率與VE基本相當(dāng)。

圖4 廣東客家黃酒清除OH-·能力Fig．4 Scavenging ability of Guangdong Hakka Huangjiu on hydroxyl free radical

2.5 還原能力

圖5 廣東客家黃酒還原能力Fig．5 Reducing power of Guangdong Hakka Huangjiu

待測(cè)樣品的吸光度值可與其還原能力有關(guān)[19]。廣東客家黃酒與VE還原能力，結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5可知，對(duì)比廣東客家黃酒、VE的吸光度值變化曲線可知，當(dāng)黃酒體積分?jǐn)?shù)＞0.3 mL/mL以后，廣東客家黃酒的還原能力與VE相當(dāng)。結(jié)果表明，廣東客家黃酒的還原能力與VE相當(dāng)。

2.6 金屬離子鰲合能力

當(dāng)有其他相互競(jìng)爭(zhēng)、能發(fā)生反應(yīng)的絡(luò)和劑存在時(shí)，會(huì)使Fe2+與Ferrozine溶液反應(yīng)形成的物質(zhì)顏色變淡[20]。廣東客家黃酒與EDTA對(duì)金屬離子螯合能力，結(jié)果見(jiàn)圖6。由圖6可知，金屬離子的螯合能力最高，廣東客家黃酒IC50值為（1.61±0.01）mL，相比于EDTA（IC50值為（0.14±0.02）mL），其金屬離子螯合能力甚小。結(jié)果表明，廣東客家黃酒的金屬離子螯合能力低于EDTA。

圖6 廣東客家黃酒的金屬鰲合能力Fig.6 Metal ion chelating ability of Guangdong Hakaa Huangjiu

3 結(jié)論

經(jīng)過(guò)試驗(yàn)證明，廣東客家黃酒有著較好的抗氧化作用，不但還原能力強(qiáng)，對(duì)ABTS+自由基、DPPH自由基、超氧陰離子自由基和羥自由基等的清除作用明顯。結(jié)果表明，客家黃酒清除ABTS+、DPPH、O2-、OH自由基及金屬離子的螯合能力的IC50值分別為（6.83±0.07）μL、（0.14±0.02）mL、（0.27±0.05）mL、（0.16±0.09）mL及（1.61±0.01）mL，客家黃酒還原力為2.1。結(jié)果表明廣東客家黃酒有著較好的體外抗氧化性能。